CN105255997B - 一种转基因生物定量检测中修正偏差的方法 - Google Patents

一种转基因生物定量检测中修正偏差的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种转基因生物定量检测中修正偏差的方法。本发明建立了一种校正偏差的方法，通过测算转基因与受体非转基因生物的核酸提取效率的比值，用此比值作为校正系数，可得到转基因成分的真实准确含量。

Description

一种转基因生物定量检测中修正偏差的方法
本发明是申请号为2012101041601，发明名称为“转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒”的专利申请的分案申请。
技术领域：
本发明涉及一种转基因生物定量检测中修正转基因检测值与真实值间的偏差方法，具体地说，是建立一种计算修正偏差的校正系数的方法。
背景技术：
转基因生物检测首先需要提取转基因植物的DNA。从理论上来讲，转基因植物与其受体植物的DNA提取效率应该相同。但有些生物在插入外源基因形成转基因生物后，会引起该转基因生物的某些特性发生变化，因此转基因生物的基因组在提取时会受到影响。
因此在转基因生物检测中，提取的外源基因DNA浓度往往偏离其理论提取DNA浓度，导致转基因成分的检测值(即外源基因拷贝数/内标准基因的拷贝数分数)偏离其实际值。
欧盟IRMM的转基因植物标准物质研制中首先要将转基因植物与其受体植物的种子粉末的分别提取其核酸。但每次称量粉末的质量和提取的核酸体积都有可能不同或存在差异，单纯用核酸浓度进行比较，可能有失偏颇。
因此，需要建立一种新的在转基因生物检测中用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种精确定量检测转基因的方法，以消除插入外源基因形成转基因生物后，提取的外源基因DNA浓度偏离其真实浓度而造成的误差。
本发明的直接目的是，建立一种用于修正转基因检测值与真实值间的偏差方法，具体地说，是建立一种计算修正偏差的校正系数的方法。
本发明建立了一种在转基因生物的外源基因定量检测中计算修正偏差的校正系数方法，用此校正系数校正测定值，能够修正转基因检测值与真实值间的偏差。
本发明人发现，受体生物在插入外源基因形成转基因生物后，会引起该转基因生物的 某些特性发生变化，影响外源基因的提取，提取的外源基因DNA浓度偏离其真实浓度，导致转基因成分的检测值(即外源基因拷贝数/内标准基因的拷贝数分数)偏离其实际值。
例如，受体水稻秀水11在插入外源基因Cry1Ab所形成的转基因克螟稻2号的基因组在提取时会受到影响，测得的外源基因DNA浓度偏离其真实浓度。
因此为了使检测结果接近于真实情况，需要建立一种校正方法。
欧盟IRMM的转基因植物标准物质研制中首先要将转基因植物与其受体植物的种子粉末的分别提取其核酸。
本发明先是发现两种植物种子粉末的核酸浓度的比值可作为校正系数，可以得到与质量配比值接近的校正值。
但考虑到每次称量粉末的质量和提取的核酸体积都有可能不同或差异，单纯用核酸浓度进行比较，可能有失偏颇。
为了使这个值显得更加准确，本发明人经研究后，又发现用提取效率这个概念来替代核酸浓度，所以用核酸浓度乘以其核酸体积再除以称量粉末质量得到了该植物种子粉末的核酸提取效率，然后将转基因植物的核酸提取效率与非转基因植物的核酸提取效率进行比较，来看其核酸提取效率的比较，由于质量分数(质量配比值)是以粉末的质量为特性量值，而PCR反应是以核酸的拷贝数作为特性量值，核酸又与其提取效率有密切相关，所以该值可以作为校正测定值的校正系数。
本发明建立了一种方法，可以测算出转基因检测值与真实值的校正系数，步骤如下：
1)精确称取转基因生物与受体非转基因生物样品各一份；
2)分别提取转基因生物与受体非转基因生物基因组DNA，分别测定其DNA浓度，并分别测定所提取DNA的体积；
3)按照下列公式，分别计算转基因生物与受体非转基因生物的核酸提取效率E
4)按下列公式计算校正系数C：
式中，Etransgene为转基因生物核酸提取效率，Ereceptor为受体非转基因生物核酸提取效率；
5)按下列公式计算转基因生物样品转基因成分的含量
转基因成分的含量＝转基因成分的检测值/C
为了计算结果更加准确可靠，最好应重复进行测量，即在步骤1)中分别称取多份样品，并分别进行上述步骤2)～步骤4)，得到每份样品的校正系数C；然后计算所有样品校正系数C的算术平均值。
重复次数越多，所得计算结果越准确，但检测成本和时间越长，通常应重复5～10次。
在本发明的实例中，所得到的转基因水稻克螟稻2号的校正系数C是经过10次重复实验后所获得的。每次实验中，每份样品称取了100mg。测算出了转基因水稻克螟稻2号与受体水稻秀水11的校正系数为22.7％。用此校正系数计算出了待测克螟稻2号样品中的转基因成分精确含量(见实施例)。
根据上述本发明建立的检测方法，本发明还提供了一种转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒中除常规的荧光定量PCR应有的试剂、PCR酶预混液外，还含有以下成分：
内标准基因RBE4的上游引物、下游引物、探针；外源基因克螟稻2号的上游引物、下游引物、探针；具体详见表1。
质控品(为含量1％和5％的转基因水稻克螟稻2号种子粉末标准物质)
标准品：为含有不同浓度的克螟稻2号和RBE4基因片段的质粒分子标准物质，数量为3～8个；
尽管检测精度与标准品数量成正比，但检测成本也与标准品数量成正比。本发明人经实验证明，标准品优选数量是4～6个
在本发明一个实例中，用了5种不同浓度的标准品(分别含有106、105、104、103、102copy/ml的克螟稻2号和RBE4基因片段)。
表1 转基因水稻克螟稻2号(KMD2)定量检测用内标准基因和外源基因探针序列
注：表中FAM为探针的发光基团，BHQ1和MGBNFQ为探针的淬灭基团。
用本发明的试剂盒进行转基因水稻克螟稻2号核酸定量检测的操作方法，其特征为：
1、精确称取质控品和待测样品；
为保证称量精确，应使用经过校准的天平；通常，称取质控品和待测样品各100mg。
2、分别提取质控品和待测样品的基因组DNA，所得DNA纯度应为A2601.8～2.0，且浓度大于20ng/μL。
其中，提取DNA可按现有技术方法，比如，可采用植物基因组提取试剂盒Genomic DNA Purification Kit(美国普罗麦格公司)，提取步骤按照该产品的说明书进行操作。
测定DNA纯度可采用现有技术方法或产品，如用PicoGreen试剂盒进行测定；
3、将表1所述RBE4内标引物对和探针及克螟稻2号外源引物对和探针用去离子水溶解配制成浓度为10μM的工作液；
4、将每个标准品、质控品DNA和待测样品DNA分别进行荧光定量PCR扩增，所述标准品如权利要求1所述；
5、按照表3所示PCR程序设置进行荧光定量PCR检测，根据每个标准品的所示浓度和测得的Ct值可以得出内标准基因和外源基因的标准曲线，以及待测样品DNA和质控品DNA的内标准基因和外源基因的Ct值，根据标准曲线计算得出待测样品和质控品的内标准基因和外源基因的拷贝数及其比值，从而得出待测样品和质控品中转基因水稻克螟稻2号的精确含量，通过使用质控品监控整个实验流程和确保实验数据的准确和可靠。
步骤4中，按照表2中所示，配制内标准基因和外源基因的PCR体系，DNA模板分别是5个标准品、待测样品DNA和质控品DNA；荧光定量PCR反应程序按表3进行；
步骤4中，每个样品做三个重复试验；
步骤5中，根据外源基因和内标准基因的标准曲线的方程分别计算外源基因和内标准基因的拷贝数，最后计算外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数的比值，得出定量检测结果。
表2 内标准基因和外源基因PCR体系
表中所述PCR酶预混液可以选用市售品，如Taqman gene expression PCRmastermix(Life Technology公司)等。
表3 荧光定量PCR反应程序
本发明的检测方法用植物基因组提取试剂盒提取转基因水稻克螟稻2号或其制品的基因组DNA为基础，水稻内标准基因RBE4上下游引物和探针用来定量检测内标准基因的Ct值、外源基因克螟稻2号上下游引物和探针用来定量检测外源基因Ct值，并通过转基因水稻克螟稻2号基因组DNA进行系列稀释建立的标准曲线分别计算得出外源基因和内标准基因拷贝数，可以快速、准确地得到转基因水稻克螟稻2号或其制品中转基因成分的精确含量。
经实验证实本方法不仅可定性检测待测样品中转基因水稻克螟稻2号成分的是否存在，还可以定量检测出转基因成分的精确含量(见实施例1)。
本发明具有以下创新和优点：
1、通过对现有常用的水稻内标准基因进行筛选，从中找到了效果最好的适合转基因水稻克螟稻2号检测的内标准基因RBE4；
2、通过对实时荧光定量PCR体系的优化，找到了适合转基因水稻克螟稻2号或其制品定量检测最佳的PCR体系。
3、检测试剂盒中附带有制作标准曲线和质控品的标准物质，可以消除样本间的差异干扰数据分析，最大程度保证定量检测精确度和准确度。突破了以往转基因植物定量检测的精确度低和不确定度大的缺点，可以确保检测结果的准确性和可溯源性。
4、灵敏度高
最低可以定检测到5拷贝的内标准基因和外源基因，并能定量检测到15拷贝的内标准基因和10拷贝的外源基因。
5、特异性强
选取了国内和国外具有代表性的其他抗虫性水稻引物和抗除草性的转基因水稻引物(克螟稻1号、克螟稻2号、科丰6号、LLRICE601、LLRICE62)。以克螟稻2号的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，结果发现只有克螟稻2号引物可以扩增出特异性条带。
6、重复性好
从实施例给出的实验结果可证实，以5个梯度稀释的基体DNA为样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性。
附图说明：
图1是标准品的内标准基因RBE4标准曲线；
图2是标准品的外源基因克螟稻2号标准曲线。
具体实施方式
水稻粉末中转基因克螟稻2号成分的定量检测
一、材料与方法
1.待测样品为质量分数2％含量的转基因水稻克螟稻2号水稻种子粉标准物质(中国计量科学研究院研制)
2.用天平精确称量待测样品和质控品(质量分数1％和5％含量的转基因水稻克螟稻2号水稻种子粉标准物质)
3.使用植物基因组提取试剂盒Genomic DNA Purification Kit(美国普罗麦格公司)提取待测样品和质控品的基因组DNA，并用紫外分光光度计和Picogreen试剂盒分别测定所提DNA的纯度和浓度。
4.将标准品(含有约106、105、104、103、102copy/ml的克螟稻2号和RBE4基因片段的质粒分子标准物质)和待测样品DNA及质控品DNA作为模板，按照表2进行PCR体系的配制，然后分别进行内标准基因RBE4和外源基因克螟稻2号的荧光定量PCR扩 增。
二、实验结果
1.标准品和待测样品的内标准基因和外源基因的Ct值见表4和表5。
表4 标准品作为标准曲线的内标准基因和外源基因的Ct值
表5 待测样品基因组DNA经PCR扩增后的Ct值
2.待测样品的定量检测结果
通过标准品所做标准曲线对待测样品进行定量。结果表明，待测样品的浓度在标准曲线的线性范围内，能够较好地测定目标样品中的外源基因含量比，结果见图1和图2，其中图中的横坐标是模板起始浓度的对数，纵坐标是Ct值。由表4和图1可知，根据公式一：y＝-3.337x+40.77，可以算出待测样品的内标准基因浓度为44759copy/ul。由表4和图2可知，根据公式二：y＝-3.294x+40.434，可以算出待测样品的外源基因浓度为186copy/ul。由公式三：待测样品外源基因含量比＝(外源基因浓度/内标准基因浓度)*100％可知，待测样品外源基因含量比为0.42％±0.04％。
3.校正系数的测定和计算
将转基因水稻克螟稻2号和非转基因水稻秀水11DNA提取效率进行比较。
方法：
1)分别用天平精确称量转基因生物与受体非转基因生物样品各10份，每份100mg。
2)使用植物基因组提取试剂盒Genomic DNA Purification Kit(美国普罗麦格公司)分别提取每份转基因生物与受体非转基因生物样品的基因组DNA，并用PicoGreen试剂盒测定其DNA浓度；
3)分别按照下列公式计算每份样品基因组DNA提取效率：
4)分别按照下列公式计算每次实验的校正系数C：
上式中，校正系数是转基因/非转基因水稻DNA提取效率比(％)。
结果：
按上述方法，本发明重复进行了10次，得到了10个转基因水稻克螟稻2号与受体水稻秀水11的校正系数，并计算出了这10个校正系数的算术平均值，为22.7％(详见表6)。
表6 校正系数的测定
4.待测转基因克螟稻2号样品基因含量测定值计算
将步骤2中经标准曲线所得的样品定量的检测值除以步骤3所得的校正系数，得到样品的基因含量为
(0.42％±0.04％)/22.7％＝1.85％±0.19％。
即，使用转基因克螟稻2号水稻和非转基因受体水稻秀水11种子粉末的核酸提取效率比值进行校正后，多次重复的待测样品基因含量为1.85％±0.19％，即范围为1.66％～2.04％。

Claims (3)

1.一种在转基因生物定量检测中修正检测值与真实值偏差的方法，其步骤如下：
1)精确称取转基因生物与受体非转基因生物样品各一份；
2)分别提取转基因生物与受体非转基因生物基因组DNA，分别测定DNA浓度，并分别测定所提取DNA的体积；
3)按照下列公式，分别计算转基因生物与受体非转基因生物的核酸提取效率E
4)按下列公式计算校正系数C：
<mrow> <mi>C</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <msub> <mi>E</mi> <mi>transgene</mi> </msub> <msub> <mi>E</mi> <mi>receptor</mi> </msub> </mfrac> </mrow>
式中，Etransgene为转基因生物核酸提取效率，Ereceptor为受体非转基因生物核酸提取效率；
5)用转基因成分的检测值除以校正系数C，得到转基因成分的含量。
2.权利要求1所述的方法，步骤1～步骤4重复进行，每次得到一个校正系数C；然后求出所有校正系数C的算术平均值。
3.权利要求2所述的方法，所述步骤1～步骤4重复进行，重复次数为5～10次。
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Inventor before: Cang Chao

Inventor before: Dong Lianhua

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GR01 Patent grant
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