CN103146698A - 布莱凯特黑牛coq2基因单核苷酸多态性及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子部分序列的多态位点及其检测方法，以包含COQ2基因的待测布莱凯特黑牛全基因组DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子；对PCR产物进行SSCP检测并对基因分型；对基因分型的纯合子测序得到布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列。根据PCR-SSCP及测序结果分析显示，COQ2基因第一外显子第55位为G或T。COQ2基因对CoQ₁₀合成量和合成速度及肉质的影响具有重大意义，因此对其SNP的检测及分析可以作为优质肉牛品种选育的分子标记，为布莱凯特黑牛优良种质的选育提供重要技术支持。

Description

布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性及其检测，特别涉及一种布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

布莱凯特黑牛是一种优质肉牛新品种，其牛肉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成比猪肉更接近人体需要，能提高机体抗病能力，同时CoQ₁₀含量也相对较高，具有营养心肌、增强抵抗力的功能，是我国肉牛品种中不可多得的优质肉牛新种质，因此如何利用分子生物学技术更加快速高效的培育肉质、营养更加优良的肉牛品种是当务之急。

CoQ₁₀以其独特的生物学功能和医学功能，备受广大研究者青睐。在细胞电子传递链上，CoQ₁₀将电子从复合物Ⅱ传递到复合物Ⅲ上，还能作为抗氧化剂与自由基结合，使磷脂膜和蛋白免受脂质过氧化损害。在医药领域，CoQ₁₀主要用于治疗帕金森综合症和保护心脏，它能够保护神经元，对抗毒素导致的神经元死亡，并能为心肌提供充足的氧气，防止突发性心脏病。在与其生物合成途径相关的若干种酶中对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶是主要限速酶，影响着CoQ₁₀的合成速度及合成量，COQ2基因是该酶在真核生物中的编码基因。

据文献报道，在患有脑肌病、肾病和严重缺乏CoQ₁₀的两兄弟体内发现与CoQ₁₀合成相关的对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶编码基因COQ2发生了纯合子突变，这是COQ2突变导致CoQ₁₀缺乏及人类疾病的首次直接证明。但对于哺乳动物COQ2基因遗传突变对体内CoQ₁₀合成量和合成速度影响的研究报道至今未发现，因此本试验根据Esembl Genome Browser数据库公布的普通牛COQ2基因的遗传突变位点信息，对布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子部分序列进行了多态性分析，为后期多态性与肉质性状和CoQ₁₀合成速度及合成量的相关性分析奠定理论基础，以期实现布莱凯特黑牛COQ2基因分子标记辅助育种。

单核苷酸多态性（SNP）是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化。单核苷酸多态性具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，是一种进行分子遗传育种的优良手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，寻找到与布莱凯特黑牛肉质性状相关的SNP，为其分子标记育种奠定基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列，是在布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子第55位为G或T的碱基多态性序列。

布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法包括以下步骤：

以包含COQ2基因的待测布莱凯特黑牛全基因组DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子；对PCR产物进行SSCP检测并对基因分型；对基因分型的纯合子测序得到布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列。

所述的引物对P为：

上游引物：5’-TGCCGCTGACCTGACGCTC-3’

下游引物：5’-CCCCACAGCCATGCCTGAG-3’。

所述PCR反应体系为：50ng/μL的基因组DNA1μL，2×GC bufferⅠ10μL，2.5mmol/L的dNTP3.2μL，10pmol/L上下游混合引物0.6μL，5U/μL的LA Taq酶0.2μL，ddH₂O5μL，总计20μL。

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

所述SSCP检测应用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列及检测方法还可以包括对多态性位点等位基因的基因频率、基因型频率和遗传多态性指标的检测。

所述的遗传多态性指标为纯合度Ho、杂合度He、有效等位基因数Ne和多态信息含量PIC。

所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列及检测方法还可以包括COQ2基因第一外显子变异前后对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶蛋白质二级结构的分析。

所述蛋白质二级结构的分析采用软件DNAStar Lasergene7。

本发明的有益效果是：

首次在布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子第55bp发现G→T的碱基突变，对应密码子发生GCG→TCG的突变，使对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶氨基酸序列第4位氨基酸由疏水性氨基酸Ala突变为极性不带电荷氨基酸Ser，属错义突变。进而对其蛋白质二级结构产生了影响，导致突变后蛋白质二级结构比突变前减少了1个α-螺旋、1个β-折叠，增加了1个β-转角。而这种蛋白质二级结构的改变势必引起蛋白质的三级结构及四级结构的改变，进而可能影响到布莱凯特黑牛对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶的催化性质，导致牛肉中CoQ₁₀合成量和合成速度及肉质的不同。因此这一结果对后期研究酶结构的改变，及其改变对CoQ₁₀合成量和合成速度及肉质的影响具有重大意义，特别是作为优质肉牛品种选育的标记基因，为布莱凯特黑牛优良种质的选育提供重要技术支持。

针对上述布莱凯特黑牛COQ2基因SNP多态性，本发明提供的检测方法简单、快速、成本低廉、精确度高。

附图说明

图1是布莱凯特黑牛基因组DNA琼脂糖凝胶检测结果；

图2是布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子部分片段扩增结果；

图3是COQ2基因第一外显子PCR-SSCP多态性检测结果；

图4a和图4b分别是COQ2基因第一外显子扩增片段AA和BB基因型测序峰图；

图5是第一外显子第55bp突变前(G)蛋白质二级结构预测图；

图6是第一外显子第55bp突变后(T)蛋白质二级结构预测图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

1．基因组DNA提取

分别采取92头成年布莱凯特黑牛耳样，使用天根生化科技(北京)有限公司的组织基因组DNA提取试剂盒从布莱凯特黑牛耳组织中提取基因组DNA，具体步骤如下：

(1)称取10mg布莱凯特黑牛耳样组织放于1.5mL离心管内，用消毒后的手术剪尽量剪碎，取200μL缓冲液GA加入其中，震荡，使其彻底悬浮。

(2)加入20μL的蛋白酶K溶液，混匀。放入水浴锅内56℃水浴1.5h，期间颠倒混匀样品2-3次，至完全消化，然后简短离心以除去管盖内壁的水珠。

(3)加入200μL缓冲液GB，颠倒混匀，70℃水浴锅内放置10min，溶液变清亮，简短离心除去管盖内水珠。

(4)取200μL无水乙醇加入上述溶液，振荡器上振荡混匀15sec，简短离心除去管盖内水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状物全部都加入到一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，于离心机12000rpm离心30sec，倒掉废液后将吸附柱再放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL已加了无水乙醇的缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液后吸附柱放于收集管中。

(7)加入700μL已加了无水乙醇的漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心30sec，弃废液后吸附柱再放入收集管中。

(8)重复操作步骤7，再漂洗一遍。

(9)吸附柱放于收集管中后，12000rpm离心2min，倒掉废液后，将吸附柱放于室温10分钟，彻底晾干材料中残余的漂洗液，闻一下无乙醇的气味。

(10)将上述吸附柱放入一个干净的剪去上盖的离心管中，悬空向吸附柱吸附膜中间部位滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min。

(11)为增加基因组DNA的得率，将上述得到的溶液再次悬空加入到吸附柱吸附膜上，室温放置2min，12000rpm离心2min。

(12)将得到的基因组DNA溶液转移到一个干净的离心管内，取2μL该溶液以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及浓度，剩下的放于-20℃冰箱中保存。

部分基因组DNA电泳结果如图1所示，可知所提取基因组DNA条带清晰，无拖尾现象，说明DNA完整性较好，浓度较高，符合后续试验要求。

2.引物设计与合成

根据Esembl Genome Browser数据库和GenBank上公布的普通牛COQ2基因序列，使用Primer Premier5.0对COQ2基因第一外显子部分序列进行引物设计，扩增包括第一外显子(长298bp)113bp及19bp的上游5’调控序列，共132bp的序列片段，并由上海生工生物工程有限公司进行引物的合成。

引物序列为：

上游引物(SEQ ID No.:1)：5’-TGCCGCTGACCTGACGCTC-3’

下游引物(SEQ ID No.:2)：5’-CCCCACAGCCATGCCTGAG-3’

3.PCR扩增

由于该引物扩增片段中GC含量高达72%，使用普通的Taq酶里的10×PCR Buffer无法扩增出产物。TaKaRa LA Taq能够扩增具有复杂二级结构模板DNA(GC rich、重复序列)，2×GCbuffer是PCR反应用缓冲液。

PCR反应体系为：基因组DNA1μL，2×GC bufferⅠ10μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，上下游混合引物(10pmol/L)0.6μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH₂O5μL，总计20μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特异性，部分扩增结果如图2所示,PCR产物特异性较好，片段长度与预期一致，可以用来进行后面的试验。

4.PCR-SSCP分析

将上述PCR扩增产物按照体积比1:1比例加入变性上样缓冲液，变性后产物在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行单链构象多态分析(SSCP)。并进行条带统计，进而对其基因分型，挑选其中纯合子进行克隆测序。

4.1聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)玻璃板处理：将配套的玻璃板、梳子及边条洗净晾干，用酒精棉球擦一遍，晾干后，吸取少量(约1000μL)剥离硅烷于吸水纸上，迅速全面的擦拭凹板(上玻璃板)，室温放置5-10min；然后吸取少量稀释亲和硅烷溶液于吸水纸上，迅速全面的擦拭平板(下玻璃板)一遍，待2-3min，再吸取少量擦拭一遍，室温放置5-10min。

(2)组装玻璃板：将平板平放于高于桌面的一水平介质上，平板两边放好边条，盖上凹板，板两边用12个夹子对称固定好。

(3)聚丙酰胺凝胶的配制：从4℃冰箱中拿出已配好的30%丙烯酰胺、10%过硫酸铵和TEMED，用移液管移取20mL30%丙烯酰胺、10mL5×TBE、20mL蒸馏水，在用移液器移取350μL10%过硫酸铵、20μL TEMED，迅速搅拌混匀。注意：丙烯酰胺、过硫酸铵和TEMED均有神经毒性，取用时要佩戴手套和口罩。

(4)灌胶：用移液管吸取上述凝胶液，从玻璃板凹口一端缓慢注入，同时用洗耳球轻轻敲击板上表面，使胶液在板内移动迅速且均匀，直至板内充满胶液。

(5)插入梳子：从凹口端慢慢插入梳子平头端，要尽量避免气泡产生，如若产生气泡，则要拿掉有气泡一边的几个夹子，用小铁铲慢慢撬起玻璃板，直至气泡消失，再轻轻放下玻璃板，夹好夹子，从另凹口另一端加入缺少的胶液。待胶液充满板内且没有气泡时，室温水平放置待胶凝固。

(6)预电泳：待胶凝好后，将梳子平头端慢慢拔出，迅速插入梳齿端，梳齿插入胶中约1-2mm。取下板两边夹子，将玻璃板移至垂直电泳槽内，两边固定好，然后在上下电泳槽内倒入适量的1×TBE缓冲液，用注射器吸取电泳液清洗点样孔，以除去其中的气泡及碎胶，最后插好电极，300V电泳30min。

(7)PCR产物处理：向PCR产物中按照体积比1:1比例加入变性上样缓冲液(9.8ml去离子甲酰胺、0.2ml0.5mol/L EDTA(pH8.0)、0.0025g二甲苯青FF、0.0025g溴酚蓝置于棕色瓶内，混匀)，PCR仪中98℃变性10min，然后迅速插入冰中冰浴10min。

(8)点样：用移液器吸取2.5μL变性后PCR产物，依次点入点样孔中。

(9)电泳：4℃，先500V电泳10min，压样；再300V电泳11h。

(10)结束电泳：关闭电泳仪，回收电泳缓冲液，拧开电泳槽两边固定玻璃板的螺丝，取下玻璃板放于桌面水平介质上，拔掉梳子和两边的边条，用小铁铲从玻璃板平口底端一边小心撬起凹板，准备银染。

4.2聚丙烯酰胺凝胶银染

(1)固定：将除去上边凹板的玻璃板放于盛有2L固定/终止液的水槽中，固定10min，期间轻轻来回振荡几次。然后取出玻璃板放于盛有2L蒸馏水的水槽中，轻轻冲洗玻璃板两次，冲洗掉多余固定液及未固定住的DNA。

(2)染色：将玻璃板放于盛有2L染色液的水槽中染色20min，期间轻轻来回振荡几次。然后在蒸馏水中迅速清洗两次，冲掉胶表面多余染色液。

(3)显色：将玻璃板迅速放入盛有2L显色液(临用前现加入3mL甲醛)的水槽内显色，期间不断轻轻振荡，直至出现清晰地条带。一般5-10min，时间不宜过长，防止显色背景过深。

(4)终止：将出现清晰条带的玻璃板迅速放到第一步固定用的固定/终止液中终止显色。

(5)回收各银染试剂，并将玻璃板从固定/终止液中捞出，放于水平面上自然晾干。

(6)标记好样本序号，用凝胶成像系统拍照。

PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后呈现不同的条带，结果如图3所示。由图3可知，COQ2基因第一外显子内检测到两个等位基因(A和B)，3种基因型(AA、BB和AB)。

4.3条带统计

根据银染结果分析各样本的条带数量及位置，确立各样本的基因型，及各基因型的样本数目。

5.纯合子克隆测序

5.1PCR扩增

各引物扩增片段经SSCP分析后，挑选两个纯合子基因型样本，每个基因型挑选两个个体重复，按照上述PCR扩增反应体系和反应程序，进行PCR扩增。取3μL扩增产物，加1μL6×Loading buffer混匀，点样于2%的琼脂糖凝胶中，120V电泳25min。

5.2PCR产物切胶回收

使用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR扩增产物进行切胶回收纯化，步骤如下：

(1)每个引物取上述4个2%琼脂糖凝胶电泳检测结果较好的PCR扩增产物，加入到一个新的小离心管中，加入15μL6×Loading buffer，混匀，加入点样孔宽度为2cm的1.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。放入EB溶液中染色18min。

(2)离心管称重后，标上标签，在紫外灯下，切取目的DNA片段条带，尽量切掉不含DNA条带的凝胶，放入干净离心管中，称重。

(3)向离心管中加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，期间不断翻转离心管几次，确保凝胶全部溶解。

(4)吸附柱的平衡：将吸附柱放入收集管中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液后，再将吸附柱放回收集管中。

(5)将步骤（2）所得溶液冷却至室温后，加入到平衡好的吸附柱中，室温放置2min，然后12000rpm离心60sec，倒掉废液，再将吸附柱放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入600μL已加入无水乙醇的漂洗液PW，静置3min后，12000rpm离心60sec，倒掉废液，再将吸附柱放回收集管中。

(7)重复操作步骤5。

(8)将吸附柱放回收集管后，12000rpm离心2min。将吸附柱放置于室温10min左右，彻底晾干，以防止残留漂洗液影响后续试验。

(9)将晾干的吸附柱放入到一个剪掉上盖的离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加40μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到目的DNA溶液。

(10)将上步离心得到的目的DNA溶液重新滴加到吸附膜上，室温静置2min，12000rpm离心2min，将目的DNA溶液收集到一个新的离心管内。

(11)取上述目的DNA溶液5μL，加入1μL6×Loading buffer，上样于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳检测，剩下的目的DNA溶液放于-20℃保存备用。

5.3目的DNA与T-载体的连接、转化

(1)超净工作台灭菌：先用75%的酒精将工作台台面及要用到的仪器擦拭一遍，将灭菌的枪头、离心管、离心管架等物品放入超净工作台中，然后打开紫外灯照射20min，再打开风机吹5min即可。

(2)从-20℃冰箱中取出T-载体连接试剂盒，放于冰上溶解。在灭菌后的超净工作台上，向200μL离心管内依次加入以下连接体系：SolutionⅠ2.5μL，PCR纯化产物2.0μL（50ng/μL），pMD19-T Vector（50ng/μL）0.5μL，总量为5μL。混匀，16℃静置反应30min。

(3)从-80℃冰箱中拿出TOP10感受态细胞放在冰上，待其刚好解冻时(约5-10min)，将上述连接体系全量5μL加入到50μL感受态细胞中混匀后将样品转入1.5mL的离心管内，然后迅速放于冰中冰浴30min。

(4)打开水浴锅，温度设置为42℃，同时提前打开恒温培养箱和恒温摇床，温度设定为37℃。

(5)冰浴结束后迅速放入42℃水浴锅内热激45sec，再迅速放入冰中冰浴2min，期间不要摇晃样品，要轻拿轻放。

(6)4℃冰箱中取出未加氨苄青霉素（Amp）的LB液态培养基，并向从冰中取出的样品中加入450μL不含Amp的液态LB培养基，37℃200rpm振荡培养90min。

(7)重复操作步骤1。

(8)取100μL上述培养物用涂布器均匀涂布于倒好的固态LB培养基上(加有Amp⁺、ITPG和X-gal)，剩余的培养物可以保存在4℃冰箱中，以备涂板效果不好时再次使用。

(9)涂好的板正放于37℃恒温培养箱中培养30min，然后倒置培养过夜(约14-16h)。

5.4重组质粒的鉴定

(1)取出培养过夜的培养皿，观察平板上细菌的生长状况。如生长密度，可根据需要调整下次涂板的菌液量；细菌分布情况，可据此判断涂板时是否涂布的均匀；阳性菌落，阳性菌落为白斑，阴性菌落为蓝斑；菌落大小，可据此调整平板培养时间。

(2)将培养好的平板用封口膜封口，并放于4℃冰箱中保存8小时，待蓝白斑更为明显时挑菌。

(3)在灭菌后的超净工作台中，从培养过夜的培养皿上挑取白色单个菌落接种于盛有500μL37℃预热的液态LB/Amp⁺培养基的1.5mL离心管中，用封口膜封口后放于37℃摇床中200rpm/min培养过夜。

(4)将平板封口后放于4℃冰箱中保存，以备测序失败再次挑菌。

(5)菌液PCR检测：在灭菌的超净工作台中进行操作，PCR反应体系为：2×GC bufferⅠ10μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，上下游混合引物(10pmol/L)0.6μL，LA Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH₂O4μL，菌液2μL，总计20μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

(3)结果鉴定：菌液PCR结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，依据扩增片段有无和大小，鉴定外源目的DNA是否插入质粒中。

5.5克隆片段序列测定

将上述阳性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行测序，每个样本送测3个重复，以确保测序准确性。

AA和BB两种纯合型PCR产物克隆测序结果如图4a和4b，发现B等位基因在扩增片段第74bp处发生G→T的突变，即第一外显子第55位碱基处发生突变。该突变导致编码基因密码子由GCG突变为TCG，从而使氨基酸由Ala突变为Ser，AA基因型为GG纯合子，BB基因型为TT纯合子。AA基因型的核苷酸序列如SEQ ID No.：3所示，BB基因型的核苷酸序列如SEQ IDNo.：4所示。

6.数据统计分析

对该多态位点等位基因的基因频率、基因型频率进行统计并计算纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)等遗传多态性指标。结果见表1，AB型个体在群体中的频率最高，A、B等位基因频率相当。试验群体COQ2基因第一外显子上的突变位点杂合度为0.500，PIC为0.375，属中度多态。

表1COQ2基因第一外显子多态位点基因型频率、基因频率及遗传多态性指标

7.COQ2基因第一外显子突变前后蛋白质二级结构分析

运用DNAStar Lasergene7软件中的Protean程序对布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子变异前后对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶蛋白质二级结构进行预测，程序参数设置为默认，二级结构预测采用Garnier-Robson预测图，结果如图5、6。可知由于该基因第一外显子第55bp处存在G→T的突变，可能导致其蛋白质二级结构减少了1个α-螺旋、1个β-折叠，增加了1个β-转角，无规则卷曲无变化。

Claims (10)

1.一种布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列，其特征在于，所述序列是布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子第55位为G或T的碱基多态性序列。 

2.一种布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 

以包含COQ2基因的待测布莱凯特黑牛全基因组DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增布莱凯特黑牛COQ2基因第一外显子；对PCR产物进行SSCP检测并对基因分型；对基因分型的纯合子测序得到布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性序列。

3.根据权利要求2所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的引物对P为： 

上游引物：5’-TGCCGCTGACCTGACGCTC-3’； 

下游引物：5’-CCCCACAGCCATGCCTGAG-3’。 

4.根据权利要求2所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：50ng/μL的基因组DNA1μL，2×GC bufferⅠ10μL，2.5mmol/L的dNTP3.2μL，10pmol/L上下游混合引物0.6μL，5U/μL的LA Taq酶0.2μL，ddH₂O5μL，总计20μL。 

5.根据权利要求2所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。 

6.根据权利要求2所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述SSCP检测应用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。 

7.根据权利要求2所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，还包括对多态性位点等位基因的基因频率、基因型频率和遗传多态性指标的检测。 

8.根据权利要求7所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的遗传多态性指标为纯合度Ho、杂合度He、有效等位基因数Ne和多态信息含量PIC。 

9.根据权利要求2所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，还包括COQ2基因第一外显子变异前后对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶蛋白质二级结构的分析。 

10.根据权利要求9所述的布莱凯特黑牛COQ2基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述蛋白质二级结构的分析采用软件DNAStar Lasergene7。 

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