CN103243094B - 布莱凯特黑牛pdss1基因单核苷酸多态性及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子部分序列的多态位点及其检测方法，以包含PDSS1基因的待测布莱凯特黑牛全基因组DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子；对PCR产物进行SSCP检测并对基因分型；对基因分型的纯合子测序得到布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性序列。根据PCR-SSCP及测序结果分析显示，PDSS1基因第4外显子第122位为A或G。PDSS1基因对CoQ₁₀合成量和合成速度及肉质的影响具有重大意义，因此对其SNP的检测及分析可以作为优质肉牛品种选育的分子标记，为布莱凯特黑牛优良种质的选育奠定了重要的基础。

Description

布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性及其检测，特别涉及一种布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

布莱凯特黑牛是一种优质肉牛新品种，其牛肉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成比猪肉更接近人体需要，能提高机体抗病能力，同时CoQ₁₀含量也相对较高，具有营养心肌、增强抵抗力的功能，是我国肉牛品种中不可多得的优质肉牛新种质，因此如何利用分子生物学技术更加快速高效的培育肉质、营养更加优良的肉牛品种是当务之急。

CoQ是生物有氧呼吸电子传递链中的必要成分，它不仅对于能量产生至关重要，还有其它功能，如活性氧自由基的清除、基因表达的调控及通过调控NAD+/NADH比率来控制细胞的氧化还原态等。而CoQ₁₀除具备以上功能外，还是人体唯一可利用的CoQ类。因此人们对CoQ₁₀的研究也越来越多，且主要集中在微生物转基因工程、发酵工程及人类临床医学方面。研究发现像粟酒裂殖酵母（S.pombe）的聚十异戊二烯焦磷酸合成酶（Decaprenyl diphosphatesynthase，DPPS）一样，小鼠mSPS1和mDLP1只有在形成异源四聚体后，才能催化CoQ₁₀侧链的合成，这在人类hDPS1和hDLP1上也同样被证实，且具有专一性，是重要的限速酶。还有研究表明，人体中PDSS1或PDSS2基因的突变，都会引起少见的婴幼儿脏器疾病。对于PDSS1基因，在其催化区的一个隐性点突变，都会引起早发型脑神经病、失聪和网状青斑；对于PDSS2基因，其一个复合杂合子突变也会引发肾病、肌病和一种称作Leigh综合征的激进式神经退行性疾病，除了CoQ₁₀的初级缺乏症，食用CoQ₁₀补充剂对啮齿类动物的神经退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、亨廷顿氏病和帕金森氏病等有显著疗效。还有研究报导，通过对人类PDSS1基因12个外显子的直接测序，发现在第977位（外显子10内）处纯合子T→G的替换导致蛋白质中高度保守的天冬氨酸变为谷氨酸（D308E）。而人类PDSS1基因和COQ2基因的突变，都会引起氧化磷酸化不足。

目前，本实验室正在利用分子遗传标记辅助育种技术对布莱凯黑特黑牛进行改良。前期董懿为等已利用10个微卫星标记分析了鲁西黄牛、布莱凯特肉牛、渤海黑牛和日本和牛4个肉牛群体，结果表明本试验利用微卫星标记分析的4个肉牛群体内和群体间的遗传多样性和亲缘关系是有效的，可为正确评估布莱凯特肉牛新品种遗传多样性的资源价值、制定合理可行的保种方案提供分子水平的遗传学依据，这同时也为今后的分子遗传标记育种实验提供了理论指导。对于CoQ₁₀的研究在其他大型哺乳动物方面还甚少，本研究首次以布莱凯特黑牛为试验对象，研究CoQ₁₀合成过程中关键酶基因PDSS1，目的是对布莱凯特黑牛PDSS1基因的单核苷酸多态性进行检测，并进行群体遗传学分析，为进一步研究该基因与布莱凯特黑牛胴体内CoQ₁₀含量、肉质性状的相关性及基因定位奠定理论基础，从而促进新品种的培育。

单核苷酸多态性（SNP）是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化。单核苷酸多态性具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，是一种进行分子遗传育种的优良手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性的检测方法，寻找到与布莱凯特黑牛肉质性状相关的SNP，为其分子标记育种奠定基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性序列，是在布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子第122位为A或G的碱基多态性序列。

布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性的检测方法包括以下步骤：

以包含PDSS1基因的待测布莱凯特黑牛全基因组DNA序列为模板，以引物对P为引物，PCR扩增布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子；对PCR产物进行SSCP检测并对基因分型；对基因分型的纯合子测序得到布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性序列。

所述的引物对P为：

上游引物：5’-CGTTTTGTGTAGTTATGCCA-3’

下游引物：5’-TGCTGAAGTTGCTCTCCC-3’

所述PCR反应体系为：10×PCR Buffer2μL，25mM的MgCl₂2μL，2.5mM的dNTP Mixture2μL，10uM的上、下游引物各0.4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，50ng/μL的基因组DNA1μL，ddH₂O12μL，总计20μL。

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

所述SSCP检测应用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

所述的布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性序列及检测方法还可以包括对多态性位点基因型频率、等位基因频率和遗传多样性指标的检测。

所述的遗传多样性指标为杂合度He、有效等位基因数Ne和多态信息含量PIC。

所述的布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性序列及检测方法还可以包括PDSS1基因第4外显子变异前后对聚十异戊二烯焦磷酸合成酶亚基蛋白质二级结构的分析。

所述蛋白质二级结构的分析采用Garnier-Roboson分析法。

本发明的有益效果是：

首次在布莱凯特黑牛中PDSS1基因第4外显子第122bp处发现A→G的突变，且引起相应氨基酸的改变N→S（即蛋白质一级结构的改变）；从而导致PDSS1蛋白质二级结构中α-螺旋的数目由20个减至19个，β-折叠的数目由24个减至23个；PDSS1作为形成聚十异戊二烯焦磷酸合成酶（DPPS）的亚基，是由一条具有特定三级结构的多肽链组成的，而其一、二级结构的改变，势必会导致三级结构的改变，蛋白质结构的改变一般会引起其功能的改变。由此可见，利用分子遗传标记辅助布莱凯特黑牛的品种是一种比较科学而有效的方式。

此外，PDSS1基因是CoQ₁₀合成过程中关键的限速酶基因之一，起着重要作用。布莱凯特黑牛体内CoQ₁₀含量的高低或许会影响到其胴体的肉质性状（如色泽、风味、系水力、多汁性、嫩度等）。因此，将PDSS1基因作为影响布莱凯特黑牛体内CoQ₁₀合成及胴体肉质性状的候选基因是有理论依据的，同时这也为今后布莱凯特黑牛分子标记辅助育种奠定了坚实基础。

布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子中单核苷酸多态位点的杂合度为0.448，有效等位基因数为1.812，多态信息含量（PIC）为0.348，这表明第4外显子内第122bp处A→G的突变为中度多态，这对今后布莱凯特黑牛的分子遗传标记辅助选育工作具有重要指导意义。

针对上述布莱凯特黑牛PDSS1基因SNP多态性，本发明提供的检测方法简单、快速、成本低廉、精确度高。

附图说明

图1是布莱凯特黑牛基因组DNA琼脂糖凝胶检测结果；

图2是布莱凯特黑牛PDSS1基因各目的片段的扩增效果，图中，M为DL2000DNA Marker；1～9分别对应P1～P9目的片段；

图3是布莱凯特黑牛PDSS1基因各目的片段的PCR-SSCP检测结果；

图4是PDSS1基因目的片段P4的PCR-SSCP检测结果；

图5a和图5b分别是布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子扩增片段AA、BB基因型测序峰图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

1．基因组DNA提取

分别采取96头成年布莱凯特黑牛耳样，使用天根生化科技(北京)有限公司的组织基因组DNA提取试剂盒从布莱凯特黑牛耳组织中提取基因组DNA，具体步骤如下：

(1)称取10mg布莱凯特黑牛耳样组织放于1.5mL离心管内，用消毒后的手术剪尽量剪碎，取200μL缓冲液GA加入其中，震荡，使其彻底悬浮。

(2)加入20μL的蛋白酶K溶液，混匀。放入水浴锅内56℃水浴1.5h，期间颠倒混匀样品2-3次，至完全消化，然后简短离心以除去管盖内壁的水珠。

(3)加入200μL缓冲液GB，颠倒混匀，70℃水浴锅内放置10min，溶液变清亮，简短离心除去管盖内水珠。

(4)取200μL无水乙醇加入上述溶液，振荡器上振荡混匀15sec，简短离心除去管盖内水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状物全部都加入到一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，于离心机12000rpm离心30sec，倒掉废液后将吸附柱再放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL已加了无水乙醇的缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液后吸附柱放于收集管中。

(7)加入700μL已加了无水乙醇的漂洗液PW进行漂洗，12000rpm离心30sec，弃废液后吸附柱再放入收集管中。

(8)重复操作步骤7，再漂洗一遍。

(9)吸附柱放于收集管中后，12000rpm离心2min，倒掉废液后，将吸附柱放于室温10分钟，彻底晾干材料中残余的漂洗液，闻一下无乙醇的气味。

(10)将上述吸附柱放入一个干净的剪去上盖的离心管中，悬空向吸附柱吸附膜中间部位滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min。

(11)为增加基因组DNA的得率，将上述得到的溶液再次悬空加入到吸附柱吸附膜上，室温放置2min，12000rpm离心2min。

(12)将得到的基因组DNA溶液转移到一个干净的离心管内，取2μL该溶液以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及浓度，剩下的放于-20℃冰箱中保存。

部分基因组DNA电泳结果如图1所示，可知所提取基因组DNA条带清晰，无拖尾现象，说明DNA完整性较好，浓度较高，符合后续试验要求。

2.引物设计与合成

参照Esembl Genome Browser数据库公布的牛PDSS1基因全序列，利用Primer Premier5.0软件针对11个外显子设计了9对引物（表1），并由上海生工生物工程有限公司进行引物的合成。

表1布莱凯特黑牛PDSS1基因各目的片段的扩增引物

注：P1-P9为各对引物扩增的目的片段；E1-E11为PDSS1基因内的11个外显子。

3.PCR扩增

PCR反应体系（片段1例外）：10×PCR Buffer（不含Mg^2＋）2μL，MgCl₂（25mM）2μL，dNTP Mixture（各2.5mM）2μL，上、下游引物（10uM）各0.4μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，DNA模板（50ng/μL）1μL，ddH₂O12μL，共计20μL；

PCR反应体系（片段1，GC含量高达80%以上，经验证普通PCR反应体系不适用）：2×GCBufferⅡ（含5mM Mg^2＋）10μL，dNTP Mixture（各2.5mM）3.2μL，上、下游引物（10uM）各0.4μL，TaKaRa LA Taq酶（5U/μL）0.2μL，DNA模板（约50ng/μL）1μL，ddH₂O4.8μL，共计20μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火（退火温度见表1），30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后在紫外凝胶成像仪上观察电泳结果并拍照，结果如图2所示,9个PCR产物特异性较好，片段长度与预期一致，可以用来进行后面的试验。

4.PCR-SSCP分析

将上述9个PCR扩增产物分别与变性上样缓冲液按照体积比1:2比例加入，变性后产物在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行单链构象多态分析(SSCP)。并进行条带统计，进而对其基因分型，挑选其中纯合子进行克隆测序。

4.1聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)玻璃板处理：将配套的玻璃板、梳子及边条洗净晾干，用酒精棉球擦一遍，晾干后，吸取少量(约1000μL)剥离硅烷于吸水纸上，迅速全面的擦拭凹板(上玻璃板)，室温放置5-10min；然后吸取少量稀释亲和硅烷溶液于吸水纸上，迅速全面的擦拭平板(下玻璃板)一遍，待2-3min，再吸取少量擦拭一遍，室温放置5-10min。

(2)组装玻璃板：将平板平放于高于桌面的一水平介质上，平板两边放好边条，盖上凹板，板两边用12个夹子对称固定好。

(3)聚丙酰胺凝胶的配制：从4℃冰箱中拿出已配好的30%丙烯酰胺、10%过硫酸铵和TEMED，用移液管移取8.33mL30%丙烯酰胺、10mL5×TBE、31.67mL蒸馏水，在用移液器移取350μL10%过硫酸铵、20μL TEMED，迅速搅拌混匀。注意：丙烯酰胺、过硫酸铵和TEMED均有神经毒性，取用时要佩戴手套和口罩。

(4)灌胶：用移液管吸取上述凝胶液，从玻璃板凹口一端缓慢注入，同时用洗耳球轻轻敲击板上表面，使胶液在板内移动迅速且均匀，直至板内充满胶液。

(5)插入梳子：从凹口端慢慢插入梳子平头端，要尽量避免气泡产生，如若产生气泡，则要拿掉有气泡一边的几个夹子，用小铁铲慢慢撬起玻璃板，直至气泡消失，再轻轻放下玻璃板，夹好夹子，从另凹口另一端加入缺少的胶液。待胶液充满板内且没有气泡时，室温水平放置待胶凝固。

(6)预电泳：待胶凝好后，将梳子平头端慢慢拔出，迅速插入梳齿端，梳齿插入胶中约1-2mm。取下板两边夹子，将玻璃板移至垂直电泳槽内，两边固定好，然后在上下电泳槽内倒入适量的1×TBE缓冲液，用注射器吸取电泳液清洗点样孔，以除去其中的气泡及碎胶，最后插好电极，300V电泳30min。

(7)PCR产物处理：向各PCR产物中按照体积比1:2比例分别加入变性上样缓冲液(去离子甲酰胺98mL、EDTA（0.5M，pH为8.0）2mL、溴酚蓝0.25g、二甲苯氰0.25g，混匀)，PCR仪中98℃变性10min，然后迅速插入冰中冰浴10min。

(8)点样：用移液器吸取各2.5μL变性后PCR产物，依次点入点样孔中。

(9)电泳：4℃，先500V电泳10min，压样；再350V电泳12h。

(10)结束电泳：关闭电泳仪，回收电泳缓冲液，拧开电泳槽两边固定玻璃板的螺丝，取下玻璃板放于桌面水平介质上，拔掉梳子和两边的边条，用小铁铲从玻璃板平口底端一边小心撬起凹板，准备银染。

4.2聚丙烯酰胺凝胶银染

(1)固定：将除去上边凹板的玻璃板放于盛有2L固定/终止液的水槽中，固定10min，期间轻轻来回振荡几次。然后取出玻璃板放于盛有2L蒸馏水的水槽中，轻轻冲洗玻璃板两次，冲洗掉多余固定液及未固定住的DNA。

(2)染色：将玻璃板放于盛有2L染色液的水槽中染色20min，期间轻轻来回振荡几次。然后在蒸馏水中迅速清洗两次，冲掉胶表面多余染色液。

(3)显色：将玻璃板迅速放入盛有2L显色液(临用前现加入3mL甲醛)的水槽内显色，期间不断轻轻振荡，直至出现清晰地条带。一般5-10min，时间不宜过长，防止显色背景过深。

(4)终止：将出现清晰条带的玻璃板迅速放到第一步固定用的固定/终止液中终止显色。

(5)回收各银染试剂，并将玻璃板从固定/终止液中捞出，放于水平面上自然晾干。

(6)标记好样本序号，用凝胶成像系统拍照。

PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后呈现不同的条带，结果如图3所示。由图3可知，目的片段P1、P3、P5-P8无多态，P2、P9多态性不显著，而P4多态性显著，可分析性强。因此，将目的片段P4作为之后的重点研究对象，其银染图片见图4。由图4可知，目的片段P4具多态性，有两个等位基因A和B，且有3种基因型：AA、AB、BB。

4.3条带统计

根据银染结果分析目的片段P4的96个样本的条带数量及位置，确立各样本的基因型，及各基因型的样本数目。

5.纯合子克隆测序

5.1PCR扩增

目的片段P4的96个样本扩增片段经SSCP分析后，挑选两个纯合子基因型样本，每个基因型挑选两个个体重复，按照上述PCR扩增反应体系和反应程序，进行PCR扩增。取3μL扩增产物，加1μL6×Loading buffer混匀，点样于2%的琼脂糖凝胶中，120V电泳25min。

5.2PCR产物切胶回收

使用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR扩增产物进行切胶回收纯化，步骤如下：

(1)每个引物取上述4个2%琼脂糖凝胶电泳检测结果较好的PCR扩增产物，加入到一个新的小离心管中，加入15μL6×Loading buffer，混匀，加入点样孔宽度为2cm的1.5%琼脂糖凝胶中，120V电泳30min。放入EB溶液中染色18min。

(2)离心管称重后，标上标签，在紫外灯下，切取目的DNA片段条带，尽量切掉不含DNA条带的凝胶，放入干净离心管中，称重。

(3)向离心管中加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，期间不断翻转离心管几次，确保凝胶全部溶解。

(4)吸附柱的平衡：将吸附柱放入收集管中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉废液后，再将吸附柱放回收集管中。

(5)将步骤（2）所得溶液冷却至室温后，加入到平衡好的吸附柱中，室温放置2min，然后12000rpm离心60sec，倒掉废液，再将吸附柱放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入600μL已加入无水乙醇的漂洗液PW，静置3min后，12000rpm离心60sec，倒掉废液，再将吸附柱放回收集管中。

(7)重复操作步骤5。

(8)将吸附柱放回收集管后，12000rpm离心2min。将吸附柱放置于室温10min左右，彻底晾干，以防止残留漂洗液影响后续试验。

(9)将晾干的吸附柱放入到一个剪掉上盖的离心管中，向吸附膜中央位置悬空滴加40μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到目的DNA溶液。

(10)将上步离心得到的目的DNA溶液重新滴加到吸附膜上，室温静置2min，12000rpm离心2min，将目的DNA溶液收集到一个新的离心管内。

(11)取上述目的DNA溶液5μL，加入1μL6×Loading buffer，上样于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳检测，剩下的目的DNA溶液放于-20℃保存备用。

5.3目的DNA与T-载体的连接、转化

(1)超净工作台灭菌：先用75%的酒精将工作台台面及要用到的仪器擦拭一遍，将灭菌的枪头、离心管、离心管架等物品放入超净工作台中，然后打开紫外灯照射20min，再打开风机吹5min即可。

(2)从-20℃冰箱中取出T-载体连接试剂盒，放于冰上溶解。在灭菌后的超净工作台上，向200μL离心管内依次加入以下连接体系：SolutionⅠ2.5μL，PCR纯化产物2.0μL（50ng/μL），pMD19-T Vector（50ng/μL）0.5μL，总量为5μL。混匀，16℃静置反应30min。

(3)从-80℃冰箱中拿出TOP10感受态细胞放在冰上，待其刚好解冻时(约5-10min)，将上述连接体系全量5μL加入到50μL感受态细胞中混匀后将样品转入1.5mL的离心管内，然后迅速放于冰中冰浴30min。

(4)打开水浴锅，温度设置为42℃，同时提前打开恒温培养箱和恒温摇床，温度设定为37℃。

(5)冰浴结束后迅速放入42℃水浴锅内热激45sec，再迅速放入冰中冰浴2min，期间不要摇晃样品，要轻拿轻放。

(6)4℃冰箱中取出未加氨苄青霉素（Amp）的LB液态培养基，并向从冰中取出的样品中加入450μL不含Amp的液态LB培养基，37℃200rpm振荡培养90min。

(7)重复操作步骤1。

(8)取100μL上述培养物用涂布器均匀涂布于倒好的固态LB培养基上(加有Amp⁺、ITPG和X-gal)，剩余的培养物可以保存在4℃冰箱中，以备涂板效果不好时再次使用。

(9)涂好的板正放于37℃恒温培养箱中培养30min，然后倒置培养过夜(约14-16h)。

5.4重组质粒的鉴定

(1)取出培养过夜的培养皿，观察平板上细菌的生长状况。如生长密度，可根据需要调整下次涂板的菌液量；细菌分布情况，可据此判断涂板时是否涂布的均匀；阳性菌落，阳性菌落为白斑，阴性菌落为蓝斑；菌落大小，可据此调整平板培养时间。

(2)将培养好的平板用封口膜封口，并放于4℃冰箱中保存8小时，待蓝白斑更为明显时挑菌。

(3)在灭菌后的超净工作台中，从培养过夜的培养皿上挑取白色单个菌落接种于盛有500μL37℃预热的液态LB/Amp⁺培养基的1.5mL离心管中，用封口膜封口后放于37℃摇床中200rpm/min培养过夜。

(4)将平板封口后放于4℃冰箱中保存，以备测序失败再次挑菌。

(5)菌液PCR检测：在灭菌的超净工作台中进行操作，PCR反应体系为：10×PCR Buffer（不含Mg^2＋）2μL，MgCl₂（25mM）2μL，dNTP Mixture（各2.5mM）2μL，上、下游引物（10uM）各0.4μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，菌液1μL，ddH₂O12μL，共计20μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

(3)结果鉴定：菌液PCR结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，依据扩增片段有无和大小，鉴定外源目的DNA是否插入质粒中。

5.5克隆片段序列测定

将上述阳性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行测序，每个样本送测3个重复，以确保测序准确性。

AA和BB两种纯合型PCR产物克隆测序结果如图5a和5b，发现B等位基因在PDSS1基因第一外显子第122bp处发生A→G的突变，从而使氨基酸由Asn（N）突变为Ser（S），AA基因型为AA纯合子，BB基因型为GG纯合子。AA基因型序列如SEQ ID No.19所示，BB基因型序列如SEQ ID No.20所示。

6.数据统计分析

对PDSS1基因的单核苷酸多态性进行群体遗传学分析，统计不同基因型个体的数量，计算基因型频率、等位基因频率及有效等位基因数（He）、杂合度（Ne）、多态信息含量（PIC）等遗传学参数。结果见表2，BB型的频率最低，杂合子AB型的频率为0.427＜0.5，A等位基因频率较高，为优势等位基因。布莱凯特黑牛群体中杂合子的频率H=0.427＜2pq（即0.448）＜0.5；H÷√DR=1.802≈2，这完全符合哈代·温伯格定律平衡群体的条件。布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子中单核苷酸多态位点的杂合度为0.448，有效等位基因数为1.812，多态信息含量（PIC）为0.348，这表明第4外显子内第122bp处A→G的突变为中度多态。

7.PDSS1基因第4外显子突变前后蛋白质二级结构分析

采用Garnier-Roboson分析法通过计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性来预测蛋白质的二级结构，结果显示当PDSS1基因第4外显子122bp处发生A→G的突变时，引起相应氨基酸的改变N→S，从而导致PDSS1蛋白质二级结构中α-螺旋的数目由20个减至19个，β-折叠的数目由24个减至23个。

Claims (1)

1. 一种布莱凯特黑牛PDSS1基因单核苷酸多态性序列的用途，所述序列是布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子第122位为A或G的碱基多态性序列，其特征在于作为布莱凯特黑牛体内CoQ₁₀合成及胴体肉质性状选育的分子标记；

所述布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子第122位为A的碱基多态性序列如下所示：

CGTTTTGTGTAGTTATGCCACCCTGTTGATGCAGAGAAACTTTGTTTCAGGAGCTCTTCATATCTACAGCAGAACTCAGGGAAATGTCTGAATACCATTTTGATGGAAAAGGAAAAGCCTTTCGACCAATTATTGTGGTGCTAATGGCCCGAGCCTGTAACATTCATCACAATAACGCCCGGTGAGTTACTTACGTTCTCTCCTCTGTTTTCTATTCGGCAAACCTTCCTTCCCAAGGTTACCGTTTACTTTCTTGGTACTTGTGTCTGCGAACTTACTTTGTGGTGAGTAATTTCCAGCTTTGTGTTCCCAAGGTCACCCTGGAGTCTAGTCTGGGCATCTTCCTTTTCCACGCTTTTTAATATCCACGGGAGAGCAACTTCAGCA

所述布莱凯特黑牛PDSS1基因第4外显子第122位为G的碱基多态性序列如下所示：

CGTTTTGTGTAGTTATGCCACCCTGTTGATGCAGAGAAACTTTGTTTCAGGAGCTCTTCATATCTACAGCAGAACTCAGGGAAATGTCTGAATACCATTTTGATGGAAAAGGAAAAGCCTTTCGACCAATTATTGTGGTGCTAATGGCCCGAGCCTGTAACATTCATCACAGTAACGCCCGGTGAGTTACTTACGTTCTCTCCTCTGTTTTCTATTCGGCAAACCTTCCTTCCCAAGGTTACCGTTTACTTTCTTGGTACTTGTGTCTGCGAACTTACTTTGTGGTGAGTAATTTCCAGCTTTGTGTTCCCAAGGTCACCCTGGAGTCTAGTCTGGGCATCTTCCTTTTCCACGCTTTTTAATATCCACGGGAGAGCAACTTCAGCA。