CN107760790A - 一种与鸡肌肉发育相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与鸡肌肉发育相关的SNP分子标记及其应用。所述的SNP位点位于鸡泛素连接酶F‑box蛋白32(Atrogin‑1)基因上，该基因第四内含子中的chr2:143,708,896bp(galGal3)位点从红色原鸡到商业化的AA肉鸡发生了G到A的突变，影响转录因子结合，从而抑制Atrogin‑1基因在AA肉鸡中的表达，进而促进肌肉发育。本发明的SNP分子标记可用于选育肌肉快速发育的鸡种，在chr2:143,708,896基因型为A则为肌肉快速发育的鸡种。本发明还建立了一种通过转录组测序高效筛选数量性状功能基因的方法，为畜禽数量性状研究提供了新的依据。

Description

一种与鸡肌肉发育相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及与鸡肌肉相关的分子标记，具体地，涉及与鸡肌肉发育相关的SNP分子标记、其应用以及检测该分子标记的方法。

背景技术

鸡不仅在全世界广泛饲养，具有重要经济价值，在生命科学研究中也极有意义，是一种重要的模式生物。鸡与哺乳动物在3.1亿年前拥有共同的祖先。鸡属于恒温脊椎动物，其生物学特征在许多方面与哺乳动物相同，但是由于进化上的差异，鸡作为鸟类较哺乳动物又有许多其它特性，对于研究生命的基础以及进化历程有着不可替代的作用。与其它物种相比较，鸡的基因组序列噪音少，利于检测功能原件。总体来说，鸡的基因组研究在比较基因组学，进化生物学以及系统发生学中都有重要的意义。鸡作为模式生物在研究进化，人类疾病以及农业养殖等方面有重要的意义。

长期的进化及人工选择使商业化的肉鸡品系与野鸡相比无论从生理、形态及运动等方面都表现出显著的差异。肉鸡品系生长速度快、运动性差，而野鸡体型较小、运动力强。肉鸡养殖业在最近100年以来经过高强度选择，形成了体积大生长速度快的商业化肉鸡品系。普通地方鸡生长速度约为原鸡的6-8倍，而商业肉鸡又进一步高了5-10 倍，约140日龄体重可以达到1.2kg-1.5kg，优良肉鸡35日龄体重可达 1.8kg-2.0kg。鸡肉作为当今社会最主要的食物之一，每年的消费量都在不断的上涨。因此对于控制禽类生长的功能基因定位研究一直是科学家关注的焦点。农业动物功能基因定位的研究对人类社会的发展有着重要的意义。在农业产业化方面，农业动物经济性状多为数量性状，如生长、肉质、繁殖力及抗病力等。根据已经发现并验证的遗传突变进行选种，与传统的根据表型育种的方法相比，产量发生了质的改变。

随着后基因组时代的到来，以及测序技术的不断发展，对于畜禽的经济性状功能基因定位已经成为了动物育种专家关注的热点。长期的人工选择使家养动物积累了丰富的影响表型的功能突变，其中不乏一些调控生长发育、繁殖以及抗病相关的基因，对这些功能突变及基因的研究为更好的进行动物遗传育种供了依据。解析重要经济性状包括多个层面的技术，一种是基于DNA水平，寻找核苷酸变异与表型相关的途径，包括QTL(Quantitivetrait locus)遗传连锁定位、GWAS (Genome-wide association study)、外显子测序、基因组重测序；另一种是直接研究转录组差异的技术途径，包括基因表达芯片、RNA-seq、单细胞转录组等，这种方法的延伸还包括蛋白组学的技术。结合上述测序技术对农业动物基因组进行解析，可以掌握更全面的遗传信息，进一步为功能基因定位及动物育种供依据。

作为肌肉特异表达的E3泛素连接酶，三结构域蛋白63(tripartite motif-containing 63,Trim63，MuRF1)和F-box蛋白32(F-box protein 32,Fbxo32，Atrogin-1)调控了绝大多数肌浆蛋白和肌肉生长调控因子的降解。Atrogin-1和MuRF1于2001年被发现在几乎所有的肌肉萎缩模型中都有明显的上调，最终表现为肌肉蛋白质减少，肌纤维变细。这两个基因的表达对于肌肉发育及蛋白代谢有重要的调控作用。有研究表明，Atrogin-1和MuRF1的小鼠敲除模型表现出显著的抗肌肉萎缩的能力。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供与鸡肌肉发育相关的Atrogin-1基因SNP分子标记。

本发明的第二个目的是提供检测该SNP分子标记的方法。

本发明的第三个目的是提供上述SNP分子标记的应用。

本发明首先发现，本研究发现Atrogin-1基因在AA肉鸡中表达被抑制，而肉鸡品种肌纤维更粗肌肉发育更快，因此Atrogin-1是调控鸡肉肌肉快速发育的重要基因。本发明提供了Atrogin-1基因在调控鸡肌肉发育中的应用，所述Atrogin-1基因的cDNA序列如SEQ IDNO.60所示。

本发明提供了用于定量扩增Atrogin-1基因的特异性引物对，上游引物：AGGCCGCAGTGTGTTGTTCT；下游引物： GTGTGAATGGCTGGTTGCAT。

本发明提供的SNP分子标记位于鸡Atrogin-1基因第四内含子中chr2:143,708,896bp(Galgal3版本)，其多态性为G/A。该位点从红色原鸡到商业化的AA肉鸡发生了G到A的突变，导致该基因在AA肉鸡中的表达相对于红色原鸡被抑制，并且调控肌肉发育，导致肉鸡品种肌肉量增加。

所述SNP分子标记所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示。

所述SNP分子标记通过以下引物进行PCR扩增得到：

上游引物：ATGTAGGAGTGCTGGGTAGTGCT；

下游引物：GCGTATTGCAGGCTCATTTG。

本发明提供了上述SNP分子标记在检测鸡肌肉发育情况中的应用，当SNP分子标记的基因型为GG时，待测鸡的肌肉发育缓慢或肌肉萎缩，当SNP分子标记的基因型为AA时，待测鸡肌肉发育快，肌蛋白多，肌纤维粗。

本发明提供了上述SNP分子标记在鸡种质资源改良中的应用。

本发明提供了上述SNP分子标记在选育肌肉发育快、肌肉量多的鸡中的应用。

本发明还建立了一种通过PCR扩增结合Ion torrent测序的方法，检测基因组目的片段突变的实验方法。避免了为研究目标基因而进行全基因组测序，减少了实验成本。

本发明提供一种获得鸡Atrogin-1基因区域内SNP信息的方法，利用PCR扩增结合测序结果，对红色原鸡、茶花鸡、藏鸡、丝羽乌骨鸡、大围山微型鸡、快长型丝羽乌骨鸡、科宝肉鸡、AA肉鸡8 个鸡种Atrogin-1基因区域上下游40kb进行测序，得到上述8个品种Atrogin-1基因上下游40kb范围内全部SNP信息，其步骤包括：

提取八个品种每个品种50个个体的DNA，并将基因组稀释到相同的浓度，将每个品种的50个基因组按照等体积混合，得到八个品种的混基因组模板；

对Atrogin-1基因上游10kb至下游6kb的范围进扩增测序，总测序长度39.95kb，具体位置为chr 2:143,690,694-143,730,638bp；将该40kb的序列分成若干段进行扩增；用KOD DNA聚合酶进行 PCR，扩增条件为94℃，2min；94℃，30sec；60℃，30sec；68℃， 40sec；68℃，7min；35个循环，1.0％琼脂糖电泳观察结果，然后回收PCR产物，检测浓度；随后将每个品种各自的回收产物，按等摩尔数混合，通过加barcode的方式区分不同的品种，建库进行测序，得到鸡Atrogin-1基因上下游40kb范围内全部SNP信息。

本发明提供一种筛选候选功能突变SNP的方法，对上述方法得到的全部SNP进行筛选，将在红色原鸡和茶花鸡中未发生突变，即突变频率为0，而在肉鸡品系中为另一种基因型的位点进行总结，得到候选位点。通常对于农业动物质量性状功能基因研究时，会引入case，control的概念，即相同的性状野生型的基因型为0，而突变型的基因型为1。数量性状虽不同于质量性状，但对于一些控制生长性状相关的主效基因也可引用此概念。

具体地，本发明所述的Atrogin-1基因区域的SNP信息是通过以下方法得到。提取红色原鸡(RJF)、茶花鸡(CH)、藏鸡(Tibetan)、丝羽乌骨鸡(Silky)、大围山微型鸡(mini)、快长型丝羽乌骨鸡(Fast Silky)、科宝肉鸡(KB)、AA肉鸡八个品种每个品种50个个体的DNA，并将基因组稀释到相同的浓度，将每个品种的50个基因组按照等体积混合，得到八个品种的混基因组模板。随后，对Atrogin-1基因上游10 kb至下游6kb的范围进扩增测序，总测序长度近40kb(39.95kb)具体位置为chr 2:143,690,694-143,730,638bp。将该40kb的序列分成16段进行扩增，引物见表1。用KOD DNA聚合酶进行PCR，扩增条件为 94℃，2min；94℃，30sec；60℃，30sec；68℃，40sec；68℃，7min； 35个循环，1.0％琼脂糖电泳观察结果，然后回收PCR产物，检测浓度。随后将每个品种各自的回收产物，按等摩尔数混合，通过加barcode 的方式区分不同的品种，建库后应用Ion torrent(314芯片)进行测序。

本发明建立一种通过转录因子活性实验，鉴定功能突变SNP的方法。首先对测序得到的全部SNP位点进行筛选，将在红色原鸡和茶花鸡中未发生突变(突变频率为0)，而在肉鸡品系中为另一种基因型的位点进行总结。之后通过PCR扩增得到候选位点突变位点野生型 (红色原鸡)和突变型(AA肉鸡)的片段，通过酶切、连接的方法将突变型和野生型序列连接到PGL3 promoter载体中检测其增强子活性(如突变位点位于基因的启动子区，则选择PGL3 basic载体检测其启动子活性)。之后将得到的突变型和野生型具有转录活性差异的SNP位点进行EMSA凝胶阻滞实验，检测该位点突变型及野生型的转录因子结合能力差异。进一步证明，该突变位点为功能突变位点。

本发明首次证明Atrogin-1基因在AA肉鸡中的表达量被抑制是由于其内含子四中的chr2:143,708,896bp位点发生了G到A的突变，进而影响转录因子结合从而抑制基因表达，调控肌肉发育。并建立了一种通过转录组测序筛选数量性状相关功能基因，利用PCR结合Ion torrent 测序的方法检测基因突变，通过转录因子活性实验对突变位点验证进而精细定位功能突变的方法。该方法与传统的QTL定位的方法相比，更加有效地定位功能基因，并且降低了测序成本，为畜禽生长相关的数量性状功能基因定位研究提供了新的方向。

本发明的有益效果在于：首次公开了与鸡肌肉发育相关的SNP 分子标记，用于区别肌肉发育快的鸡只。本发明的检测SNP分子标记的方法能够早期、快速、低成本、有效的预测肌肉发育快的鸡种，在鸡育种和品种改良方面具有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。本发明提供的一种获得鸡Atrogin-1基因区域内SNP信息的方法相对于全基因组重测序可极大地降低成本，并且与传统的抓捕测序的方法相比，覆盖的样本量大，获得的SNP频率更精确。

附图说明

图1是本发明实施例1中Q-PCR(A图)和western blot检测(B 图)Atrogin-1在红色原鸡和AA肉鸡中的表达情况，每个品种三个生物学重复，RJF代表红色原鸡，AA代表AA肉鸡。

图2是本发明实施例1中骨骼肌组织肌纤维横切HE染色图， RJF代表红色原鸡，AA代表AA肉鸡。

图3是本发明实施例3中双荧光素酶系统检测候选位点野生型和突变型转录活性差异检测情况。WT表示野生型(红色原鸡)，AA 表示突变型(AA鸡)等位基因序列分别插入到pGL3-Promoter中。图 3中A图为对Chr2:143,699,522bp的突变型及野生型进行转录活性检测，B图为Chr2:143,708,896bp位点，该位点野生型及突变型转录活性存在显著差异，C图为Chr2:143,711,469bp位点，D图为Chr2: 143,715,477bp位点，E图为Chr2:143,715,485bp，F图为Chr2: 143,715,711bp位点，G图为Chr2:143,718,432bp位点，H图为Chr2: 143,723,139bp位点，该位点位于基因启动子区，所以同时检测启动子及增强子活性，分别用-P代表启动子活性。-E代表增强子活性。

图4是本发明实施例4通过EMSA对突变位点chr2:143,708,896 bp转录因子结合能力差异检测。G表示野生型探针，A表示突变型探针，NE表示核蛋白。箭头1所示的位置为特异性结合条带，箭头 2所示的位置为非特异性结合条带，箭头3所示的为自由探针。结果说明野生型探针和突变型探针存在蛋白结合能力差异，野生型探针结合能力更强。

图5为本发明实施例4中证明的chr2:143,708,896bp突变位点对Atrogin-1该基因的表达调控模式图。AA肉鸡中Atrogin-1基因第四外显子chr2：143,708,896位点发生G到A的突变，该突变影响转录因子X结合，进而抑制基因表达，最终影响表型，表现为AA肉鸡肌肉发育更快，肌纤维更粗。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Atrogin-1抗体购于Santa Cruz；引物合成及序列测定由深圳华大和invitrogen公司完成；KOD DNA聚合酶购于上海东洋纺公司T4 DNA连接酶、限制性内切酶购于大连TaKaRa公司；质粒去内毒素大提试剂盒、胶回收试剂盒购于Omega公司；基因组及RNA提取试剂盒购于QIAGEN公司；RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录试剂盒购于promega公司；总蛋白提取试剂盒购于碧云天公司；细胞转染试剂盒LipofectamineTM 2000购于Invitrogen公司；双荧光素酶试剂盒Dual-Glo Luciferase Assay System购于Promega公司；EMSA试剂盒LightShift Chemiluminescent EMSA kit购于Thermo公司；酶切、连接、回收、转化、PCR扩增、Western blot、HE染色等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》《生物化学》。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 Atrogin-1在红色原鸡与AA肉鸡中差异表达的验证及对不同鸡种骨骼肌肌肉表型的影响

1.总RNA的提取

按照Trizol结合RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit QIAGEN)上提供的方法。

2.反转录PCR

按照promega公司反转录试剂盒说明书(M-MLV Reverse Transcriptase)提供的方法，对2ug RNA进行反转录。反应完成后cDNA 于-20℃保存。

3.定量Q-PCR

针对Atrogin-1基因设计Q-PCR引物，

上游引物：AGGCCGCAGTGTGTTGTTCT(SEQ ID NO.58)

下游引物：GTGTGAATGGCTGGTTGCAT(SEQ ID NO.59)

在罗氏LC480仪器上检测该基因在不同鸡种中的相对表达情况。扩增条件如下：扩增条件为50℃，2min；95℃，5min；{95℃，15s； 60℃，1min}40个循环；95℃，16sec；60℃，15sec；95℃，15sec。反映完成后利用2^-ΔΔCt方法统计分析荧光定量结果，结果显示Atrogin-1 基因在AA肉鸡中表达与红色原鸡相比发生下调，如图1的A图所示。

4.Western Blot检测Atrogin-1蛋白在不同鸡种中的表达情况

根据碧云天公司总蛋白提取试剂盒提供的方法，提取两个鸡种大腿肌肉组织中的蛋白，每个品种三个生物学重复。随后利用Western blot的方法检测两个品种中Atrogin-1蛋白水平，结果显示Atrogin-1基因在红色原鸡中的蛋白表达量显著高于AA肉鸡，如图1的B图所示。

5.红色原鸡与AA肉鸡骨骼肌肌肉组织横切HE染色

取七日龄的红色原鸡及AA肉鸡大腿肌肉组织进行固定，对横切面切片，后进行HE染色，如图2所示。

实施例2 Atrogin-1基因的正选择分析

1、八个不同鸡种基因组DNA提取

按照按照基因组提取试剂盒(Dneasy Blood&Tissue Kit)上提供的方法，提取基因组。提取包括红色原鸡(RJF)、茶花鸡(CH)、藏鸡(Tibetan)、丝羽乌骨鸡(Silky)、大围山微型鸡(mini)、快长型丝羽乌骨鸡(Fast Silky)、科宝肉鸡(KB)、AA肉鸡八个品种，每个品种50个个体的DNA，并将基因组稀释到相同的浓度，再把每个品种的50个基因组按照等体积混合，最终得到八个品种的混基因组模板。

2、对八个品种Atrogin-1基因区域进行扩增后进行Ion torrent测序

Atrogin-1基因位于鸡的2号染色体负链上(WUGSC 2.1/galGal3)，基因长约24.65kb，位置为chr2:143,695,682-143,720,333bp。对Atrogin-1 基因上游10kb至下游6kb的范围进扩增测序，总测序长度近40kb (39.95kb)具体位置为chr 2:143,690,694-143,730,638bp。将该40kb的序列分成16段进行扩增，引物见表1。

表1

用KOD DNA聚合酶进行PCR，扩增条件为94℃，2min；94℃， 30sec；60℃，30sec；68℃，40sec；68℃，7min；35个循环，1.0％琼脂糖电泳观察结果，然后回收PCR产物，测浓度。随后将每个品种各自的回收产物，按等摩尔数混合，通过加barcode的方式区分不同的品种，建库后应用Ion torrent(314芯片)进行测序。

3、测序结果分析

将测序得到的八个品种全部的SNP位点统计在一起(其中未表现出多态性的位点，将其变异频率定为0)。Atrogin-1基因在野鸡和肉鸡中表现出明显的表达差异，很可能是由于肉鸡中产生了功能突变，并且被固定下来。因此最关注的突变位点是在红色原鸡和茶花鸡未发生突变(变异率为0)，而在AA肉鸡和科宝肉鸡中为另一种基因型的位点。根据以上条件，对得到的突变位点进行筛选，最终得到8个符合条件的候选位点(表2)。

表2候选功能突变位点信息汇总

实施例3 荧光素酶报告系统对突变位点活性检测

1、PGL3双荧光素酶报告载体构建

通过PCR扩增的方法将每个候选位点的两种基因型野生型 (RJF)和突变型(AA)分别克隆下来，并且保证克隆岛的同一个候选位点突变型和野生型序列中只有一个碱基的差异。突变位点在中间，其上下游各包含100-200bp左右的序列。由于突变位点大部分位于Atrogin-1基因内含子区域，所以将克隆得到的序列连接到 pGL3-Promoter载体上，检测其增强子活性。具体操作步骤如下：

以提取的RJF和AA肉鸡的DNA为模板，用KOD DNA聚合酶进行PCR，扩增出约100-200bp的片段，引物见表3。

表3

扩增条件：94℃，2min；94℃，30sec；60℃，30sec；68℃， 30sec；68℃，7min；35个循环，再加入1μL taq DNA聚合酶，68℃， 10min。扩增完成后，1.0％琼脂糖电泳观察结果。切胶回收PCR产物，测浓度。纯化后的PCR产物连入T载进行转化，阳性菌落进行测序。对测序正确的质粒进行转化，挑取单克隆，加入盛有5ml LB 培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g溶于1L蒸馏水中)的灭菌管中，37℃，220rpm，培养8h至12h。按照E.Z.N.A PlasmidMiniprep质粒提取试剂盒上提供的方法提取质粒。

将提取好的含有野生型和突变型片段的质粒及PGL3 promoter 载体骨架用限制性内切酶Sac I和NheI进行双酶切，回收后，16℃连接3h，通过常规转化法进行转化、涂板。待单菌落长成后，挑取数个扩大培养并测序。测序验证正确，说明本发明针对8个候选位点构建了含有野生型和突变型的16个PGL3增强子验证载体。

2、鸡成纤维细胞DF-1中检测增强子活性

将载体转染鸡成纤维细胞(DF-1)，同时以pGL3-Basic， pGL3-Promoter和pGL3-Control载体作为空载体、启动子活性和增强子活性载体的对照。DF-1细胞在24孔板中培养至约80％密度时进行转染，按照lipofectamine 2000脂质体试剂提供的方法进行转染，每孔加入720ng的pGL3载体质粒和80ng的pRL-TK海参荧光素酶质粒以及2μL脂质体，孵育4小时后换正常培养基继续培养，24-48小时后检测。利用双荧光素酶检测试剂盒，在InfiniteF200分光光度计(Tecan， Switzerland)上进行检测。计算得到的萤火虫荧光/海参荧光的比例，利用空载体作为对照进行校正。每次实验同一个载体进行三次重复，三个技术重复的结果平均值进行计算。分别进行三次独立实验进行最终的统计检测，结果显示chr2:143,708,896bp位点发生G到A的突变后，增强子活性被抑制，如图3所示。

实施例4 EMSA检测chr2:143,708,896bp位点突变型A和野生型 G转录因子结合能力检测

1、探针合成

以实施例3得到的具有转录活性差异的位点chr2:143,708,896bp 的野生型和突变型为模板，合成实验所用探针，包括野生型生物素标记的上游引物biotin-CCTGCAGCCTGA(C)GTGTTTTAACTG(SEQ ID NO.3)和下游引物CAGTTAAAACAC(G)TCAGGCTGCAGG (SEQ IDNO.1)，以及AA突变型，生物素标记的上游引物biotin- CCTGCAGCCTGA(T)GTGTTTTAACTG(SEQ ID NO.4)，下游引物 CAGTTAAAACAC(A)TCAGGCTGCAGG(SEQ ID NO.2)。同时合成不带生物素的两条上游引物，退火生成竞争性探针。用于EMSA实验的探针长25bp，突变位点位于探针的中间位置，括号中的碱基即突变碱基。上下游引物通过PCR退火形成带生物素的双链DNA探针，步骤详见碧云天退火buffer使用说明。

2、凝胶阻滞EMSA电泳检测转录因子结合能力检测

按照碧云天核蛋白提取试剂盒提供的方法提取DF-1细胞核蛋白，检测蛋白浓度约为(3-5ng/ul)。随后设置EMSA结合反应体系(表4)。

表4 EMSA结合反应体系

注：上表中1-14表示上样泳道

按照上述体系依次加入各种试剂以及竞争性探针了，不加生物素探针，混匀后室温放置20min，让竞争性探针与核蛋白取物充分反应。在反应体系中，加入生物素探针，室温反应20min。加入5μL Loading Buffer(5×)，终止反应，轻柔混匀立即上样。在4℃室电泳，用0.5×TBE 作为电泳液。将配好的PAGE胶100V预电泳30min，用移液器将20μL 样品加入到孔中。100V电泳60min左右，直至前沿溴酚蓝条带至胶的 2/3或者3/4的位置，停止电泳。4℃室转膜380mA电泳50-55min。转膜后紫外交联。将Blocking Buffer及4×Washing Buffer预热至37-50℃。加入20mL Blocking Buffer，充分覆盖住膜，室温在摇床上孵育15min，30rpm。孵育辣根过氧化物酶反应液:将66.7μL辣根过氧化物反应液到 20mL封闭液中(1:300稀释)，替换封闭液，室温在摇床上孵育15min，30g。用去离子水稀释4×Washing Buffer至1×Washing Solution。将辣根过氧化物酶反应封闭液倒掉，用适量的1×WashingBuffer洗膜，室温在摇床上孵育5min，30rpm。重复步骤5，再用Washing Buffer洗3 次膜。将膜转移到新的容器中，加入30mL Equilibration Buffer，室温在摇床上平衡5min，30rpm。配置6mL显色底物。倒掉平衡液，将显色底物均匀的覆盖于膜的表面，室温在暗处孵育5min后，在暗室显影。结果显示探针能够与核蛋白特异性结合(箭头所示的位置)，并且野生型探针和突变型探针存在蛋白结合能力差异，如图4所示。

根据以上实施例的研究结果，绘制实施例4中证明的突变位点 chr2:143,708,896bp位点对Atrogin-1该基因的表达调控模式图，以及对不同鸡种肌肉发育的影响。AA肉鸡中Atrogin-1基因第四外显子 chr2：143,708,896位点发生G到A的突变，该突变影响转录因子X结合，进而抑制基因表达，最终影响表型，表现为AA肉鸡肌肉发育更快，肌纤维更粗)，如图5所示。

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种与鸡肌肉发育相关的 SNP 分子标记及其应用

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgcagcct gagtgtttta actg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagttaaaac actcaggctg cagg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctgcagcct gagtgtttta actg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcagcct gagtgtttta actg 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtggtatccc cagttgactt t 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccaggcttt tttgttatg 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttgcctgtg agcagtgata t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtggtaacc gtgtggtgaa g 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacctgtaag ccacaagact ctc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaatacgcaa agggatgtag agt 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccctttgcgt atttccattc g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atcagcctta accctgacca c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcagagagg cattacagag ag 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcagcgagag aaaagcagat g 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggcatttttc taccatttac aa 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcagttccc tgatgctata cc 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcccttcac tgcttgatct ga 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tttcaaagcc aaactcctca tg 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggtttcccaa gtagcagtga c 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aatgtgaagc agcataggtt g 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttggcagcaa catcatagtt 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tggcagctct gtttcagtac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caaagcggta gcattagagc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctcctcaaag cagggattac ta 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcccatgttt gacctaagaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caatcccctt cacttgagaa 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgagacacca gctgtcaagg t 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cagtggggca taaacaagca 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgggggagga tggtttgtt 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acgccaggtt gggatcttat 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gccagacaag tcctgctttc 20

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttcatccttg tggcttctct c 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gagcttggac actccctttg t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgcatttgcc tttgaaacaa c 21

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tcccctgtct tcctccagtg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cggttgccag atccactaca 20

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agacgcgtta cagggcttcc catttcca 28

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

agagatcttt cctagtgctt cagctcagag tg 32

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

agacgcgtat ttgtgccagc actacaag 28

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agagatcttg cctggtctgc gtttatca 28

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

agacgcgtta agctgcatta ctgctgataa 30

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

agagatcttg tcaggatgag attgatgt 28

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

agacgcgtta ccattcccac actagtatta 30

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

agagatctct aaaattccag gtacaaag 28

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

agacgcgtat ctcttcaaca gccttaacta 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

agagatctaa ttaccctcct tctgacaaat 30

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

agacgcgtgt aaagctgcgg caggaag 27

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

agagatctta ttcccaactc aatagcca 28

<210> 49

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

agacgcgtag ggaaaaaatg gaggagat 28

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agagatctta cccactacaa gctgccac 28

<210> 51

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

agacgcgtat gtaggagtgc tgggtagtgc t 31

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

agagatctgc gtattgcagg ctcatttg 28

<210> 53

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

agacgcgttc agagctggtt ttccctgg 28

<210> 54

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

agagatctat caccccagaa accaccac 28

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

agacgcgtat ctggttcaag cccatgtc 28

<210> 56

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

agagatcttc accctcaact ccaatagt 28

<210> 57

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cagcgtattg caggctcatt tgggaacgct gtttttccta cttcctttgg tacatcaaga 60

aattagggaa ggatttcttt gccagcatcc tgcagcctga cgtgttttaa ctgtattggg 120

tctttgaggt ctcccttttg ctgaggggtg tcggtggctc ttcttgctgt gtgcactgag 180

cactacccag cactcctaca t 201

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aggccgcagt gtgttgttct 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gtgtgaatgg ctggttgcat 20

<210> 60

<211> 4559

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

agccctgccg ccaaggcgct cgccgaaccg gtccgctccg ccgttttagt acctctccca 60

gcccgccgcc gccgccatgc cgttcctcgg gcaggactgg cgctcccctg ggcagagctg 120

ggtgaagaca gccgacggtt ggacgcgctt tctcgatgag aagagcggcg gtttcgtcgg 180

cgacctcagc agcttttgta agaaggaaga tcacaacaaa gagaatctct tcaacagcct 240

taactatgat gttgctgcca agaagaggaa aaaagaccta ctgaataaca aggccaaaat 300

tcagtatttt catcaagaaa agtggatcta tgttcacaag gggagcacaa aagagcgcca 360

tggttactgc accttgggag aagccttcaa cagacttgac ttctccagtg ctatcctgga 420

ctcccggcga ttcaactacg ttgtaaggct gttggagctg atagcaaagt ctcagctgac 480

gtcactgagt ggcattgccc agaaaaacta catgaacatt ttggaaaaag tggtgcagaa 540

agtccttgaa gaccagcaga acatcaggct aatacgggaa ttgctgcaga ccctctacac 600

gtccctctgc actttggttc aacgggtcgg caagtctgtc cttgtaggaa acatcaacat 660

gtgggtgcac aggatggaga ctattctcca ctggcagcag caactgaaca acattcaaat 720

caccaggcct gcctttaaag gaactacctt cacagacctg ccattgtgtt tacaattgaa 780

catcatgcaa cgactgagcg atgggaggga cctggttagc cttggtcaag tggctcccga 840

cctgcaagtg ctcagcgaag accggctgct gtggaagaag ctctgccagt accacttcac 900

agacagacag attcgcaaac ggctaatcct atctgacaag ggacagctgg attggaagaa 960

gatgtacttc aagctcataa ggtgttaccc acggaaggag cagtatggtg acacgctgca 1020

gctgtgcagg cactgccaca tcctctcttg gaagggtact gatcaccctt gcacagccaa 1080

caacccagag acctgttcca cctctctttc acctcaagac tttatcaact tgttcagatt 1140

ctgaatttga gtcaccacag cttaattgat tcttacagga cactttatgc cactgagctt 1200

ggacactccc tttgtaaata gtgtaaatat tcatgttcgt gtgaagctcc tgagtcaagg 1260

aacaagagga ttttggagat gaaaggaaag actaagtaaa aggggagaga agccacaagg 1320

atgaagatga tccaaaaggg aggaagttcc attatagaga aacaaaggac tgagtttaat 1380

ctcgtgagct gtttatattt taagaaattg tcaatatttg catttttgca accaaatcac 1440

tttgcatatc ctggaagagg ctcaaaaagg gaagaaaagc tgcctctggg tggagcagtg 1500

gggaagaggg gaagaaacct gggaaggagg aagccaggaa aatgctgcca ctaacttctg 1560

ttctcctgcc ttcccacagc aaacccaagt ttttgctctt ctagagagct ctgtgagcca 1620

gtgctgctca tagctgtggc ttagagcttg gcatcatcag agatgaggag aaaacgtggg 1680

atagggagct atatttgttt tgaagctcac tccatcagtt gctggtgaaa aataagcctg 1740

gtgatcatgt tcatgtcaac tgaaagtgat ttaaaagctt ttacttggaa aaatgaactt 1800

ttgttttggg gggatgctca tgagtgaggg aggccagttt ctgttctcac tcccacactg 1860

gtgtcagtgg gttgatgagg atgaaatctg gcctgctgaa agaggacatt aaggacagga 1920

acttgcaagt gaatgatgta ttgccactgt ctttggagac gcttgctgtt actttttcta 1980

agaggacatg tatgaccctt ccacctgctc acatctctga cctgggaacg gtttggtttg 2040

tggacctgcc tgtgccatcc acagtgagcc agcctcttgt gatggagttg gcatgaagtg 2100

ctgggggttt ccgtacagtc tgaggccata ctcaccagat gacgcttacc cactgagact 2160

gtcacactgg ctgaatttta agctcaggtt taaatccagt ctgcccaaca agatggaaaa 2220

tcccagcctt tagctgtggt ccaggagcat tcttgctctc actgttgcct ctatcagcct 2280

ttcactggtc ttgagcaaag agtttatgct gtgtcctctg cccagtgaac aacttaatgt 2340

gcaactgagg ctcctatttg tgaaatttaa tttcacttgg tgtttttctt agcactgtgt 2400

agatcttaaa gcgatgaaga tcagtcctga tacaacttgt gcattgctca tcccaagtcc 2460

tggggtattg ctgttggtgt tccaagcagc agaaaaccaa tcaagcactg tgctgcagaa 2520

gaaatctgat taaacaatat gaagcagaat gtgccttgtt cggttatggc ctcagtcacc 2580

agcagctgtc aaatcagaac gtgatctcct tgggagactc attgtttatc atgtggctgg 2640

tacagggagg tattgtgggg aattcaatac cttagtctaa ctgcttaaac aaaatgatca 2700

gtattttggc agtgcgaagg catctgtttg acttaggatg gcagggcagg aaaaccagct 2760

gggatagttc gggtctccag gcaggatggt gtaaggctgc tctcaaacaa aaaggacctt 2820

tttattttag gacaattctg gcaaagctat tgtgaatagg aaacaggctt ttacttgtat 2880

tttgggaagc taatgttctt ttcaaacagt gtctcagctt caagttggtt gatgtgttcc 2940

cattagaaat gcattggttc ttacactgtg aaaggaggtt tttgctctct ttggggtttt 3000

tctgctccca gcatatgcag gagaaaaaaa tgctttatct tcaaaggttc ttaagcattg 3060

taatggtgta gagccatggc accacagaga ggaaaaacag ctccgtgcag gggagatctt 3120

tgtgttctgg cttcctagaa ggggcaggca ttctcatttt cttttcaaga ggcaccattt 3180

cagctgtaca taccttaagc cgtttatagt gactatggca tggtaaagtt tgatcctaaa 3240

atgtgtgcaa ctcctcatat tgtttggttt tcttttaatt gtgaaagttt ctagatcctt 3300

ttgctttgta aagtgattag gaaagcttgt attgctctaa ggacactgct ttgtatgtaa 3360

acatttaatt gcaccctgcc actttctgta tatggaagca cctttttcta tcctttttct 3420

ttgccccagg tttttaactg tttgtgttcc tgtttgtttg acttcagtta ctcttgcaaa 3480

gctctctcct cttagaacgt atgcaggtac tacaccagct tttcctgacc agaaaattcc 3540

ttggccctta gcagctaaaa tttgatttag agcaggaaca attcagattc tgtgaagtag 3600

ctgataaatc agacgtgctg tttcacgctt atctgctgtt cggtacaatg aaccagagtt 3660

ttcttctggg gttcttctta caaacctttg cagcttcccc acagagcagc accttgccag 3720

taagaaatag ctttgaataa taaaatgtca ctcttccgag ctggcctgtt agcaaaacgc 3780

agacccagtg gagctcatgg ctgattgagt tgatgaacaa tgccagctac aaggccgcag 3840

tgtgttgttc tgcccatgtt gcttgtagtc atcctagtta aaggctctga agatgcaacc 3900

agccattcac acgcccagta tcatgtggct gctggggtgt gaatttcttt accagtgcct 3960

gatctttatc ccctgtcttc ctccagtgat ttcactggta ccaaatgggc tttgcaggat 4020

ctggctctat ggagaacaaa tccatctagc ctttgacata ggcagtctct atgaacatca 4080

tgactaccag agagattccc ctccgttggc caagcactgc ctttcctctt cctgggaggg 4140

caagtgaggg tggaacttgc atgtcttgag ctgtcttgag tggtgcagag tactgacagt 4200

ctgctaccaa ggaagtgttt taatttgaaa tggcaaatgt gctcgtcttt aggaattaat 4260

ctacagtaac tataaatacc tacttatata tggaagagtg tgttctgttt tgtttttcct 4320

taaggttcta agtagagata atatgaagtg aaagacatcc cttgtatagt aagatttttt 4380

gtttaatatt actgtgtggt taaaatcctt ccgtataaat ttgcacactt ttttccccct 4440

cttcccttgc atgttcaact ctgatttttt acagctgttc tgtgcaaaca gtaatgtatt 4500

tttttgtaaa acattttttg acactgaatt gcaataaatg ttcaaacaat gtgatccac 4559

Claims (10)

1.Atrogin-1基因在调控鸡肌肉发育中的应用，所述Atrogin-1基因的cDNA序列如SEQID NO.60所示。

2.一种用于定量扩增Atrogin-1基因的特异性引物对，其特征在于，上游引物：AGGCCGCAGTGTGTTGTTCT

下游引物：GTGTGAATGGCTGGTTGCAT。

3.一种与鸡肌肉发育相关的SNP分子标记，其特征在于，位于Galgal3版本鸡Atrogin-1基因第四内含子中chr2:143,708,896bp，其多态性为G/A。

4.如权利要求3所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记所在的核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示。

5.如权利要求3所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记通过以下引物进行PCR扩增得到：

上游引物：ATGTAGGAGTGCTGGGTAGTGCT；

下游引物：GCGTATTGCAGGCTCATTTG。

6.权利要求3-5任一所述的SNP分子标记在检测鸡肌肉发育情况中的应用，当SNP分子标记的基因型为GG时，待测鸡的肌肉发育缓慢，当SNP分子标记的基因型为AA时，待测鸡肌肉发育快，肌蛋白多，肌纤维粗。

7.权利要求3-5任一所述的SNP分子标记在鸡种质资源改良中的应用。

8.权利要求3-5任一所述的SNP分子标记在培育肌肉发育快肌肉质量高的肉鸡中的应用。

9.一种获得鸡Atrogin-1基因区域内SNP信息的方法，其特征在于，利用PCR扩增结合测序结果，对红色原鸡、茶花鸡、藏鸡、丝羽乌骨鸡、大围山微型鸡、快长型丝羽乌骨鸡、科宝肉鸡、AA肉鸡8个鸡种Atrogin-1基因区域上下游40kb进行测序，得到上述8个品种Atrogin-1基因上下游40kb范围内全部SNP信息，其步骤包括：提取八个品种每个品种50个个体的DNA，并将基因组稀释到相同的浓度，将每个品种的50个基因组按照等体积混合，得到八个品种的混基因组模板；

对Atrogin-1基因上游10kb至下游6kb的范围进扩增测序，总测序长度39.95kb，具体位置为chr 2:143,690,694-143,730,638bp；将该40kb的序列分成若干段进行扩增；用KODDNA聚合酶进行PCR，扩增条件为94℃，2min；94℃，30sec；60℃，30sec；68℃，40sec；68℃，7min；35个循环，1.0％琼脂糖电泳观察结果，然后回收PCR产物，检测浓度；随后将每个品种各自的回收产物，按等摩尔数混合，通过加barcode的方式区分不同的品种，建库进行测序，得到鸡Atrogin-1基因上下游40kb范围内全部SNP信息。

10.一种筛选候选功能突变SNP的方法，其特征在于，对权利要求9所述方法得到的全部SNP进行筛选，将在红色原鸡和茶花鸡中未发生突变，即突变频率为0，而在肉鸡品系中为另一种基因型的位点进行总结，得到候选位点。