CN116287299A - 一种与绵羊免疫性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记及其应用。本发明利用DNA混池测序结合KASPar技术检测湖羊PLEKHH2基因SNP位点的方法。根据PLEKHH2基因序列设计引物，从绵羊血液中提取DNA，通过PCR扩增、DNA测序和序列分析，发现在扩增片段的第368位存在一个C/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对889只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与免疫性状指标进行关联分析，发现该位点与绵羊的血小板数(PLT)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)呈显著相关。通过检测本发明的分子标记，可用于绵羊的标记辅助抗病育种上，加速绵羊育种进程。
Description
技术领域
本发明属于绵羊分子标记筛选与应用技术领域，具体涉及PLEKHH2基因多态性作为影响绵羊免疫性状的分子标记、其检测方法和应用。
背景技术
在养羊生产中，疾病不仅会导致绵羊生产力下降，还可能导致大量绵羊死亡，给养羊业造成巨大的经济损失。目前，在全球禁用抗生素的背景下，疾病控制的主要手段仍然依赖于疫苗接种和药物治疗，但这些措施并不能完全解决绵羊病的问题，大量使用药物可能导致耐药性的发展，并且还可能因药物残留而给畜产品的质量和安全带来潜在的风险(Ahmed et al.2020；伊拉米奥特等人，2020)。此外，集约化、大规模养殖的绵羊比例越来越大，对羊在拥挤的饲养管理条件下的抗病性提出了更高的要求。因此，迫切需要从基因育种措施来从根本上增强绵羊的抗病性，但是在直接进行抗病性方面仍存在许多困难，这可以通过选择免疫指标来间接改善，并且随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)被广泛应用于畜禽的选种选育工作中。
绵羊作为主要的草食动物，其抗病育种工作也越来越被重视，其中哺乳动物的血液学特征由三个组成部分组成：白细胞，红细胞和血小板，它们是动物免疫功能，抗病性和整体健康的重要指标(Dal Colletto等人，1993)(Wang等人，2022)。了解这些性状的遗传背景控制变异将有助于疾病检测、种质利用和育种改进。迄今为止，对血液学参数的候选基因和数量性状位点(QTL)的研究仅限于人类(Vasquez等人，2016)和一些重要的农场动物，包括猪(Bovo等人，2019；赵等人，2011；荣格等人，2014；罗等人，2012)，牛(栗鼠-巴尔加斯等人，2020年；Hu等人，2019)和家禽(Sun等人，2016)。然而，与绵羊血液学性状研究相关的候选基因和QTL仍处于萌芽阶段。
PLEKHH2是G蛋白偶联受体信号通路中的一种细胞质蛋白，在肾小球足细胞中高度富集，并与几种人类免疫疾病的发展有关，例如糖尿病肾病(DN)(Greene等人，2008)和局灶性节段性肾小球硬化症(Perisic等人，2012)。有趣的是，PLEKHH2也被确定为在健康和精神分裂症患者的外周组织成纤维细胞中差异表达(Etemadikhah等人，2020)。然而，在农场动物中，还没有报道PLEKHH2基因与性能或免疫表型的关联，PLEKHH2基因与免疫能力是否有关系或有什么关系并不清楚。因此本发明以PLEKHH2基因作为候选基因，通过PCR扩增、DNA测序和序列分析，探讨其不同基因型与绵羊免疫相关性状的关联性，以期为提高绵羊的抗病性提供一个新的分子标记。
发明内容
针对现在养羊业使用大量药物和疫苗等问题，本发明的目的在于提供一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、其检测方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
本发明提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，该分子标记对通过对绵羊PLEKHH2基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的S表示C或G，由于上述序列在第368位碱基处有一个C/G突变，从而导致了绵羊PLEKHH2基因在该位点的C/G多态性。
一对用于检测上述分子标记的引物对，其包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
用于检测上述分子标记的KASPar引物对，其包括正向引物AX、正向引物AY和反向引物C，所述正向引物AX的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向引物AY的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
一种检测上述分子标记的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含了检测上述分子标记的引物对或KASPar引物对。
一种检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的碱基S表示C或G，所述方法包括利用上述的引物对或检测试剂盒对绵羊全血基因组DNA进行检测。
具体的，所述方法包括使用如上所述的引物对或KASPar引物对，或者如上所述的试剂盒，对绵羊全血基因组DNA进行扩增；对获得的扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。
优选地，分型鉴定方法为直接测序法、探针法、基因芯片法和KASP基因分型技术。
进一步地，利用上述引物对检测与绵羊免疫性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：
S1、以绵羊全血为样品提取基因组DNA，利用引物对如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，
S2、对上述PCR的扩增产物进行测序和序列分析，从而确定多态性位点的基因型。
此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，包括如下步骤：
a)以绵羊全血为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的引物进行高通量水浴PCR扩增；
b)扩增结束后，采用KASP基因分型技术，通过BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
本发明还提供了与绵羊免疫性状相关的分子标记、用于检测与绵羊免疫性状相关分子标记的引物对或检测试剂盒或检测方法在绵羊辅助育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对PLEKHH2基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出免疫力较好的绵羊品种。
如上所述的应用，优选在绵羊育种中的应用。其育种目的是为挑选出高免疫力的绵羊品种。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，还提供了检测该分子标记的引物对或检测试剂盒或检测方法在绵羊免疫性状相关检测中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对PLEKHH2基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出具有强免疫力的绵羊品种，为有高免疫力，健康型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留基因为GG纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的免疫力，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。
附图说明
图1为对绵羊PLEKHH2基因片段扩增的凝胶电泳结果图。
图2为本发明中绵羊PLEKHH2基因突变位点的测序结果。
图3为本发明中绵羊PLEKHH2基因g.38384C>G突变位点KASPar SNP分型结果。
具体实施方式
本发明通过对PLEKHH2基因进行PCR扩增、测序和分析，选择889只湖羊为试验群体分析PLEKHH2基因中不同基因型与免疫性状指标的关联性，筛选出对免疫性状有利的基因型，开发一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，为绵羊免疫性状相关的分子标记辅助育种提供依据，为促进绵羊遗传改良提供基因素材，加速优质肉羊的培育进程。结果发现在扩增片段的第368位存在一个C/G多态性位点，并通过检测889只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，该分子标记可以为绵羊性状发育方面的遗传改良提供有效的基因工程手段，具有一定的实际应用价值。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
(1)引物设计
以绵羊PLEKHH2基因DNA(GenBank收录号：NC_056056.1)为模板，利用Oligo7.0软件设计一对引物包括正向引物F和反向引物R，引物序列如下
正向引物F(SEQ ID NO.2)：5＇-TTGGCACAAATAGAAACGC-3＇，反向引物R(SEQ IDNO.3)：5＇-GTTTTATCAGTAATAAAGGCAAC-3＇
(2)PLEKHH2基因的扩增和测序
配制PCR反应体系采用总体积为25μL体系，其中包括DNA模板1μL，正向引物F的浓度为10μmol/L取0.8μL，反向引物R的浓度为10μmol/L取0.8μL，2×PCR Master Mix取12.4μL，ddH2O取10μL。取绵羊的血液进行提取基因组DNA，将获得的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增。
PCR扩增反应的条件是：
94℃预变性5min；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；
最后72℃延伸5min。
对上述获得PCR扩增的反应产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，图1所示，结果显示得到477bp大小的扩增片段。将测序结果通过Chormas(v2.3.0.0)和DNAMAN(6.0.3.99)软件分析。测序的结果见图2：具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该368bp片段中存在一个多态性位点，具体在第368bp位点的S是C突变为G，即扩增该PLEKHH2基因片段在第368bp位点存在C/G多态性，该位点处于NC_056056.1序列中的第38384位，即g.38384C>G(见图2)。其中，SEQ ID NO.1：
TTGGCACAAATAGAAACGCTATAAGCATGATACGGCCACTGAGACCTCAGGAAACAGATCTTGATCTCGTTGATGGCGACAATACAGAAATTTTAGAGACTATGGACACTAATTGTGATGATGGATTATTTTCCTACGACTGCTTGGAATCCCCATGTTCAGAGGACCAGGAAGCCTGCGACTTGGCAAAGAAAGCAGCCTGTGGCAAACCTCCAACTCCACCTCTGCACCGGTTTCCCTCTTGGGTAAATTATGTTGCTGTGTGCAGTGCGCACACGTTTGTTTTCTCTCAGCACTCATTTTCAGGTTTTACTTTACTTTCTTTTCCTGTTTCTTTTCCACTCCAGCTTTGTTCTGACAATTCCCASTTTTTAGAATTCAGTTTTCCCTTCTCTTTTCCTCTGAATCAGTTGAGAAATAAGACACAAGGGTAAGACAAACAGGAGATCTAGATGTTGCCTTTATTACTGATAAAAC。
DNA序列同源性检索鉴定：
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊PLEKHH2基因DNA(GenBank收录号：NC_056056.1)的部分序列同源性达99％。
实施例2基因分型检测方法的建立
(1)引物序列设计
针对实施例1中扩增片段的C/G多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：
用于检测AlleleX的正向引物AX，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
SEQ ID NO.4：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCTTTGTTCTGACAATTCCCAC；
用于检测AlleleG的正向引物AY，如SEQ ID NO.5所示，
SEQ ID NO.5：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCTTTGTTCTGACAATTCCCAG；
通用反向引物C，如SEQ ID NO.6所示，
SEQ ID NO.6：GAGGAAAAGAGAAGGGAAAACTGAATTC。
以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照引物AX：引物AY：引物C的体积比为12:12:30的比例混匀备用。
(2)DNA质控
对绵羊的全血提取得到的基因组DNA的质量进行检测，分别采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100进行检测，要求合格的DNA符合：一、琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；二、Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；三、A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；四、270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。
根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA模板浓度为10～20ng/μL备用。
(3)基因分型
首先利用K-pette分液工作站，将稀释好的待测全血的DNA模板取1.5μL和空白对照(以水为模板记为NTC)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板货号Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：
94℃预变性，15分钟；
94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；
94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。
扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧上方的红(深灰)色圆点表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近右侧的蓝(深灰)色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近中间的(浅色)绿色圆点表示该位点是杂合基因型“GC”或“CG”；黑色圆点表示NTC(图3未能显示出来)，即为空白对照。
(4)本发明的分子标记在绵羊内血液学参数的关联分析中的应用
采用上述方法共检测了889只湖羊的多态性，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与免疫性状进行关联分析。
Yijk＝μ+Gi+Bj+Sk+εijk,
Yimjkl＝μ+Gi+Gm+Bj+Sk+Cl+εimjkl
其中，Yijk和Yimjkl是血液学性状的原始数值数据，μ为总体均数，Gi和Gm为第i和m的基因型效应，Bj为出生地效应，Sk为季节效应，Cl为基因型组合效应，εijk和εimjkl为残差，当线性模型表明基因型之间存在显著差异时，使用最小显著差异(LSD)评估差异。
利用血液学分析仪(ProCyte Dx，IDEXX，Westbrook，ME，USA)在绵羊180日龄测得的血液学参数，使用线性回归模型评估该分子标记PLEKHH2g.38384C>G对180日龄绵羊血液学性状的影响，以在R soft中进行关联分析，使用KASPar方法进行基因型检测，结果表明在889个个体中GG基因型有519个，CG基因型有79个个体，CC基因型有291个个体，基因型与性状关联分析的结果见下表1，其中，表中RBC表示红细胞数，单位为M/uL；HGB表示血红蛋白浓度，单位为g/dL；HCT表示血细胞比容，单位为％；MPV表示平均血小板体积，单位为fL；PLT表示血小板数，单位为K/uL；WBC表示白血球数，单位为K/uL；LYMPH表示淋巴细胞数，单位为K/uL；MONO表示单核细胞数，单位为K/uL；EO表示嗜酸细胞数，单位为K/uL；NEUT表示中性粒细胞数，单位为K/uL；BASO表示嗜碱性细胞数，单位为K/uL；MCHC表示平均红细胞血红蛋白浓度，单位为g/dL；MCV表示平均红血球容积，单位为fL；MCH表示平均冠状血红蛋白，单位为pg；RDW_SD表示平红细胞容积分布宽度标准差，单位为fL；RDW_CV表示平红细胞容积分布宽度变异系数，单位为％。
表1绵羊PLEKHH2基因多态性与部分免疫性状关联分析
注：同行数据间角标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
通过获得889只动物的详细血液学参数特征。结果显示，所有绵羊的血液学参数均保持在正常范围内，为节省篇幅在此不在赘述。血小板通常被认为是血栓形成的细胞介质，但血小板也是免疫系统的重要组成部分，在调节和诱导组织损伤和病原体反应方面起着直接作用。血红蛋白水平是正常的或高的，表明体内含有丰富的铁。血红蛋白含量低，说明体内缺铁，进而影响血红蛋白的合成和氧的承载能力，导致贫血，阻碍动物正常生理活动。并且由上表的结果显示，PLEKHH2 g.38384C>G突变位点即扩增片段SEQ IDNO.1中第368位的所示的C/G多态性位点与血小板数(PLT)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)呈显著相关(P<0.05)，其中携带GG基因型湖羊的PLT和MCHC显著高于CG和CC基因型个体。因此PLEKHH2g.38384C>G突变位点可作为影响绵羊免疫性状的潜在分子标记，选择GG基因型可以提高绵羊个体的免疫性能，并为在育种中鉴别高免疫性能的绵羊提供检测技术手段。
Claims (10)
1.一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的S表示C或G，该突变导致了绵羊PLEKHH2基因在该位点的C/G多态性。
2.一对用于检测权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，其包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.用于检测权利要求1所述分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括正向引物AX、正向引物AY和反向引物C，所述正向引物AX的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述正向引物AY的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.包含权利要求2或3所述引物对的检测试剂盒。
5.一种检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第368bp位的碱基S表示C或G，所述方法包括利用权利要求2或3所述引物对对绵羊全血基因组DNA进行扩增检测；对获得的扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，分型鉴定方法为直接测序法、探针法、基因芯片法和KASP基因分型技术。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、以绵羊全血为样品提取基因组DNA，利用引物对如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，
S2、对上述PCR的扩增产物进行测序和序列分析，从而确定多态性位点的基因型。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述包括如下步骤：
a)以绵羊全血为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行高通量水浴PCR扩增；
b)扩增结束后，采用KASP基因分型技术，通过BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
9.权利要求1所述与绵羊免疫性状相关的分子标记、权利要求2所述的引物对、权利要求3所述的KASPar引物对或权利要求4所述的检测试剂盒或权利要求5-8中任一项所述方法在绵羊辅助育种中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为挑选出高免疫力的绵羊品种。
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