CN109735628A - 一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的cnv标记方法与应用 - Google Patents

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伍革民
韩雪
徐龙鑫
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Abstract

本发明涉及分子遗传学研究领域，具体涉及一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法与应用，所述CNV标记是指鸡ADCY10基因候选区域的拷贝数变异；以绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，以目标基因引物对P1和参照基因引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增ADCY10基因CNV区域和对照基因，根据定量结果分析ADCY10基因CNV拷贝数，根据拷贝数的高低进行蛋壳色素性状的选育；本发明发现ADCY10基因的拷贝数与绿壳蛋鸡中的蛋壳胆绿素含量呈显著正相关，该拷贝数变异的检出为选育改善绿壳蛋鸡的绿壳表型性状提供了科学依据，且该CNV标记不受个体性别、年龄等限制。

Description

一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法与应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学研究领域，具体涉及一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法与应用。
背景技术
研究发现，鸡绿壳蛋色的形成是由SLCO1B3基因上游EAV-HP序列(一种内源病毒的部分序列)的插入引起。然而，同为绿壳，不同个体绿壳深浅不一，绿壳表型差异仍然很大。绿壳色素的沉积量受SLCO1B3基因外的其他基因控制。探寻鸡基因组中与绿壳色素沉积量相关的变异位点或功能基因，可用于绿壳蛋鸡的品种选育，通过标记基因的辅助选育，改善绿壳蛋表型性状，具有重要经济意义。
拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是基因组中重要的结构变异形式，它通过剂量效益、位置效应、基因融合、基因阻断等机制影响基因和表型，在畜禽中已经发现了一些与畜禽性状显著相关的CNVs，可从拷贝数变异角度探寻影响绿壳蛋色素差异的CNVs标记或功能基因，将CNVs作为一个分子遗传标记应用于绿壳蛋色素表型的分子选育。
到目前为止，还未发现影响绿壳蛋胆绿素含量或绿壳颜色深浅的功能基因或CNVs标记的相关报道。ADCY10的英文全称是adenylate cyclase type 10，中午全称是腺苷酸环化酶10，还未发现相关文献报道关于ADCY10基因拷贝数变异与鸡蛋胆绿素含量之间的关联性。本发明发现了ADCY10基因拷贝数变异与绿壳胆绿素的关联性，建立绿壳蛋鸡绿壳色素的ADCY10 CNV分子标记检测和辅助选育方法，可改善绿壳蛋鸡绿壳性状，并实现早期选种、不限性别以及提高选育准确性等目的。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法与应用。本申请发现ADCY10基因拷贝数显著影响绿壳蛋鸡中绿壳的胆绿素含量，该拷贝数变异的检出为绿壳蛋鸡的分子辅助选育提供了科学依据。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，所述CNV标记是指鸡ADCY10基因候选区域的拷贝数变异。具体地，所述CNV标记位于ADCY10基因鸡参考基因组序列(GenBank Chromosome Z,NC_006127.5)所示序列的73664882bp-73668141bp区域内。
本发明的一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，是以绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，以目标基因引物对P1(F1、R1)和参照基因引物对P2(F2、R2)为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增ADCY10基因CNV区域和对照基因，根据定量结果分析ADCY10基因CNV拷贝数。
本发明提供用于扩增所述CNV标记的引物对包括用于定量PCR扩增ADCY10基因的拷贝数变异区域的引物对P1以及扩增作为内参的GAPDH基因部分片段的引物对P2；引物对可高特异性地扩增目标片段。
所述的引物对P1为：
上游引物F1:CTTCAGTGCATCGGTGTGGAC
下游引物R1：CAAGGCCAAGGGCAACCTC
所述的引物对P2为：
上游引物F2:TCACAGCCACACAGAAGACG
下游引物R2：ACTTTCCCCACAGCCTTAGC
本发明以CNV拷贝数高低来鉴定鸡中绿壳蛋胆绿素含量。所述CNV区域拷贝数高的蛋壳胆绿素含量高于拷贝数低的蛋壳胆绿素。
本发明还提供了一种ADCY10基因CNV标记辅助检测绿壳蛋鸡胆绿素含量的专用试剂盒，所述试剂盒含有所述引物对P1和P2以及SYBR Green Master、ddH2O。
所述引物对P2用于扩增内参基因GAPDH，内参基因也可以用已被证明具有稳定拷贝数的其他基因作为内参基因。
本发明还提供所述CNV标记在辅助绿壳蛋鸡育种中的应用。
所述的应用包括如下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)以上述提取的鸡基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的目标基因引物对P1和参照基因引物对P2，分别进行实时荧光定量PCR扩增反应；
(3)利用2-ΔΔCt方法计算待测样品ADCY10基因CNV片段拷贝数，将拷贝数与绿壳蛋鸡所产的绿壳蛋胆绿素含量进行关联分析；
(4)根据拷贝数高低进行绿壳性状的品种辅助选育。
所述荧光定量PCR提供了优选的扩增体系和反应程序。
所述荧光定量PCR所用的扩增体系以20μL计为：10ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的上、下游引物各1μL、2x SYB Green Master 10μL,ddH2O 7μl。
所述荧光定量PCR所用的反应程序为：①预变性95℃,10min；②扩增反应95℃变性10s,60℃退火30s，39个循环；③绘制熔解曲线,95℃5s,65℃1min。
在步骤(4)，所述所述待测鸡拷贝数高低的判断方法为：根据Log22-ΔΔCt将拷贝数定量结果分为三类：；当-0.5≤Log22-ΔΔCt≤0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于正常型(Normal，N)，即拷贝数正常；Log22-ΔΔCt<-0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于缺失型(Loss，L)，即拷贝数较低；当Log22-ΔΔCt>0.5时待测鸡的拷贝数变异类型属于插入型(Gain，G)，即拷贝数较高；通过拷贝数与绿壳蛋鸡所产的绿壳蛋胆绿素含量进行关联分析，得知上述拷贝数变异类型中，具有插入型(Gain，G)变异类型的个体蛋壳胆绿素含量较高。
在前期的研究中，本申请发明人在鸡Z、1号、4号、6号等染色体上发现了与绿壳颜色差异相关的CNVs(Copy number variation，CNV)500多个，合并成20多个候选区域CNVR(Copy number variation regions,CNVR)；以CNVR区域中的注释基因为候选基因，筛选和鉴定到了ADCY10基因参考序列(GenBank Chromosome Z,NC_006127.5)的73664882bp-73668141bp区域的拷贝数变异；根据参考序列设计特异性引物，以长顺绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，进行拷贝数变异检测，与色素吸光值进行关联统计分析，得出ADCY10基因拷贝数变异与蛋壳胆绿素色素含量显著关联，ADCY10CNV标记拷贝数高的鸡，其绿壳蛋蛋壳的胆绿素含量也高，利用ADCY10CNV标记拷贝数高低，可以为绿壳蛋的蛋壳色素的分子育种提供理论依据。
由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：
(1)本发明对绿壳蛋鸡的ADCY10基因的拷贝数进行检测，并对该基因的拷贝数与绿壳蛋中的胆绿素、原卟啉等色素含量进行关联分析，通过SPSS15.0软件的统计分析，发现ADCY10基因的拷贝数显著影响绿壳蛋鸡中的蛋壳色素含量，ADCY10基因的拷贝数与原卟啉色素含量呈极显著负相关，与胆绿素含量呈显著正相关，具有插入型(Gain)变异类型、拷贝数较高的个体胆绿素含量较高。该拷贝数变异的检出为绿壳蛋鸡色素沉积性状的分子选育提供了科学依据。
(2)本发明提供的CNV标记不受个体年龄、性别等限制，可用于育种中公鸡的直接选种和母鸡的早期选育，有效加快了绿壳蛋鸡的种质资源改良。
附图说明
图1为实施例1中ADCY10基因在65个长顺绿壳蛋鸡母鸡样本中的相对拷贝数；
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
在前期的比较基因组芯片检测及分析研究中，在鸡Z、1号、4号、6号等染色体上发现了与绿壳颜色差异相关的CNVs(Copy number variation，CNV)500多个，合并成20多个候选区域CNVR(Copy number variation regions,CNVR)；以CNVR区域中的注释基因为候选基因，筛选和鉴定到了ADCY10基因参考序列(GenBank Chromosome Z,NC_006127.5)的73664882bp-73668141bp区域的拷贝数变异；根据参考序列设计特异性引物，以长顺绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，进行拷贝数变异检测，与色素吸光值进行关联统计分析，研究ADCY10基因拷贝数变异与蛋壳色素的关联性，为绿壳蛋色素的分子育种提供理论依据；
1.样本的采集与基因组DNA提取
(1)样本的采集
采集长顺绿壳蛋鸡母鸡65只；翅下静脉采血1～1.5mL，加EDTA－Na2抗凝，－20℃保存备用。
(2)基因组DNA的提取
利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit)按试剂盒说明从血液中提取目的DNA；
2.引物的设计
以NCBI所公布的鸡ADCY10基因为参考序列，查找拷贝数变异区域，利用Prime 5.0软件设计目的片段和参考序列引物；
3.绿壳色素测定
收集个体开产后1个月、4个月和7个月的鸡蛋，取粗中细3点测定蛋壳厚度，紫外分光光度计测定蛋壳溶解液在380nm、412nm和670nm处的吸光值，并以蛋壳厚度和采样时间进行校正，以校正吸光值代表不同的胆绿素含量数据；其中波长412色素吸光值代表原卟啉色素含量，波长670色素吸光值代表胆绿素色素含量；
4.荧光定量PCR
荧光定量PCR扩增体系为20μL：10ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的上下游引物各1μL、2x SYB Green Master 10μL,ddH2O 7μl；荧光定量PCR反应程序为：①预变性95℃,10min；②扩增反应95℃变性10s,60℃退火30s，39个循环；③绘制熔解曲线,95℃5s,65℃1min；
5.拷贝数变异分析
每个待测DNA样品稀释到统一浓度后，分别用目标序列和参考序列的引物进行PCR扩增,每个扩增反应做3个重复；根据仪器的操作说明得到CT值，利用2-ΔΔCt方法进行拷贝数计算和分析，以样本5为拷贝数1进行校正，得到相对拷贝数，相对拷贝数计算结果见表1，分析结果见图1。
表1 ADCY10在65只长顺绿壳蛋鸡母鸡中的拷贝数计算结果
表1是计算后，以样本5为拷贝数1校正后的数据，属于相对拷贝数，分布范围从0.61-2.61之间，说明不同鸡个体之间拷贝数差异明显。
6.ADCY10基因不同拷贝数与蛋壳色素吸光值相关性分析
依据产蛋表型数据，选择65只母鸡为试验对象，确定ADCY10基因CNV拷贝数，利用SPSS15.0软件，对拷贝数的变化与蛋壳色素吸光值进行皮尔逊相关性分析；相关性分析结果见表2；
表2色素吸光值与ADCY10拷贝数相关分析表
从表2可知，ADCY拷贝数与波长412吸光值(代表原卟啉含量)的相关系数为负值，其相关检验P值为0.001，小于0.01，说明ADCY10拷贝数与蛋壳原卟啉含量呈极显著负相关。ADCY拷贝数与波长670吸光值(代表胆绿素含量)的相关系数为正值，其相关检验P值为0.018，小于0.05，说明ADCY10拷贝数与蛋壳胆绿素含量呈显著正相关。
7.ADCY10基因拷贝数变异类型与蛋壳色素吸光值关联性分析
根据2-ΔΔCt方法计算ADCY10基因CNV拷贝数，将拷贝数定量结果分为三类：；当-0.5≤Log22-ΔΔCt≤0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于正常型(Normal，N)，即拷贝数正常；Log22-ΔΔCt<-0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于缺失型(Loss，L)，即拷贝数较低；当Log22-ΔΔCt>0.5时待测鸡的拷贝数变异类型属于插入型(Gain，G)，即拷贝数较高；用SPSS22.0软件一般线性模型和多重比较进行关联性分析。关联性分析结果见表3。
表3色素吸光值与ADCY10拷贝数变异的关联性分析
注：平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著；括号里面的数值n表示不同拷贝数变异类型的样本频数。
从表3结果可知，ADCY10基因拷贝数不同变异类型中，Gain类型(拷贝数较高)个体的波长412吸光值显著低于Normal(拷贝数正常)和Loss类型(拷贝数较低)的个体，而波长670吸光值则显著高于Normal(拷贝数正常)和Loss类型(拷贝数较低)的个体，说明Gain类型(拷贝数较高)个体的蛋壳原卟啉色素含量较低，而蛋壳胆绿素色素含量较高，因此，ADCY10基因拷贝数的Gain类型变异类型可以作为绿壳蛋鸡蛋壳色素选择的CNV分子标记。
8.CNV标记在辅助绿壳蛋鸡育种中的应用方法
蛋鸡翅下静脉采血1～1.5mL，加EDTA－Na2抗凝，－20℃保存；利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit)按试剂盒说明从血液中提取目的DNA；以从血液中提取目的DNA为模板，以目标基因引物对P1(F1、R1)和参照基因引物对P2(F2、R2)为引物，通过实时荧光定量PCR反应，利用2-ΔΔCt方法计算待测样品ADCY10基因CNV片段拷贝数，根据Log22-ΔΔCt将拷贝数定量结果分为三类：正常型(Nomal，N)，-0.5≤Log22-ΔΔCt≤0.5；缺失型(Loss，L)，Log22-ΔΔCt<-0.5；插入型(Gain，G)，Log22-ΔΔCt>0.5。根据拷贝数的相对高低和变异类型进行绿壳蛋鸡蛋壳性状的CNV标记辅助选育。
综上所述，本发明对鸡的ADCY10基因的拷贝数进行检测，并对该基因的拷贝数与鸡绿壳色素含量进行关联分析，通过SPSS15.0等软件的统计分析，发现鸡ADCY10基因的拷贝数显著影响鸡的蛋壳色素含量，即鸡ADCY10基因的拷贝数与蛋壳原卟啉含量呈极显著负相关，与胆绿素含量呈显著正相关，该拷贝数变异的检出为绿壳蛋鸡的蛋壳色素性状的分子辅助选育提供了科学依据。本发明提供的CNV标记为绿壳蛋鸡鸡种的蛋壳色素选育提供了理论基础，该CNV标记不受个体年龄、性别等限制，可用于育种中公鸡的直接选种，也可以用于母鸡的早期选育，可加快地方鸡种的种质资源改良。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同腰间的含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，其特征在于，所述CNV标记是指蛋鸡ADCY10基因候选区域的拷贝数变异。
2.如权利要求1所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，其特征在于，所述CNV标记位于ADCY10基因鸡参考基因组序列(GenBank Chromosome Z,NC_006127.5)所示序列的73664882bp-73668141bp区域内。
3.如权利要求1所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关CNV标记方法，其特征在于，以绿壳蛋鸡基因组DNA为模板，以目标基因引物对P1(F1、R1)和参照基因引物对P2(F2、R2)为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增ADCY10基因CNV区域和对照基因，根据定量结果分析ADCY10基因CNV拷贝数，根据拷贝数高低进行绿壳蛋鸡蛋壳色素的辅助选育。
4.如权利要求1所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记方法，其特征在于，所述的目标基因引物对P1为：
上游引物F1:CTTCAGTGCATCGGTGTGGAC
下游引物R1：CAAGGCCAAGGGCAACCTC
所述的参照基因引物对P2为：
上游引物F2:TCACAGCCACACAGAAGACG
下游引物R2：ACTTTCCCCACAGCCTTAGC。
5.根据权利要求4所述的用于鸡ADCY10基因CNV标记的引物对，其特征在于：所述目标基因引物对P1是用于定量PCR扩增ADCY10基因的拷贝数变异区域，所述参照基因引物对P2是用于扩增内参基因GAPDH的部分片段，所述内参基因GAPDH为已被证明具有稳定拷贝数的基因。
6.如权利要求1-5任一项所述的与绿壳蛋胆绿素含量相关的CNV标记在辅助绿壳蛋鸡育种中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)以上述提取的鸡基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的目标基因引物对P1和参照基因引物对P2，分别进行实时荧光定量PCR扩增反应；
(3)利用2-ΔΔCt方法计算待测样品ADCY10基因CNV片段拷贝数，将拷贝数与绿壳蛋鸡所产的绿壳蛋胆绿素含量进行关联分析；
(4)根据拷贝数高低进行绿壳性状的品种辅助选育。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在步骤(2)所述荧光定量PCR所用的扩增体系以20μL计为：10ng/μL模板DNA 1μL、10μmol/L的上、下游引物各1μL、2x SYB Green Master10μL,ddH2O 7μL。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在步骤(2)，所述荧光定量PCR所用的反应程序为：①预变性95℃,10min；②扩增反应95℃变性10s,60℃退火30s，39个循环；③绘制熔解曲线,95℃5s,65℃1min。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在步骤(4)，所述所述待测鸡拷贝数高低的判断方法为：根据Log22-ΔΔCt将拷贝数定量结果分为三类：；当-0.5≤Log22-ΔΔCt≤0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于正常型(Normal，N)，即拷贝数正常；Log22-ΔΔCt<-0.5时，待测鸡的拷贝数变异类型属于缺失型(Loss，L)，即拷贝数较低；当Log22-ΔΔCt>0.5时待测鸡的拷贝数变异类型属于插入型(Gain，G)，即拷贝数较高；通过拷贝数与绿壳蛋鸡所产的绿壳蛋胆绿素含量进行关联分析，得知上述拷贝数变异类型中，具有插入型(Gain，G)变异类型的个体蛋壳胆绿素含量较高。
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