CN103773857A - 一种通过检测edn3基因拷贝数差异来鉴定乌鸡肤色基因型的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴定乌鸡肤色基因型的试剂盒，包括（1）内参基因GAPDH扩增引物；（2）目的基因EDN3扩增引物；（3）校样品DNA；（4）荧光定量PCR反应液；（5）双蒸水。采用本发明的试剂盒以待检样品DNA为模板，对目的基因EDN3和内参基因GAPDH进行实时荧光定量PCR反应，并以校样品DNA为对照，分别记录Ct值，计算得到待检样品的EDN3基因拷贝数，进而根据拷贝数差异判断乌鸡肤色的Fm基因型。本试剂盒操作无需构建标准曲线，简便快速，可重复性好，检测效率高；经鸡种测交验证，本发明方法能准确反映乌鸡个体的肤色Fm纯合与杂合。应用本检测方法有助于加快筛查乌鸡肤色纯合度，指导优质乌鸡新品系的目标选育，并为后续商业化配套杂交提供可靠种质保障。

Description

一种通过检测EDN3基因拷贝数差异来鉴定乌鸡肤色基因型的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测乌鸡EDN3基因拷贝数差异的分子生物学试剂盒，属于农业生物诊断技术领域。 

背景技术

拷贝数变异（CNVs）是新发现的一种与单核苷酸多态（SNPs）同等重要的基因组结构变异，人类研究中表明，CNVs可导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见病，同时也与许多多因子疾病及身高等表型相关。乌肤、乌骨、乌肉等黑色性状是乌鸡的最特征性表观之一，这种体内黑色素的沉积现象也称真皮黑色素过度沉着（Dermal hyperpigmentation）或纤维化黑色变（Fibromelanosis，Fm）。在生产中，有效区分肤色黑色性状的纯杂度有助于加快乌鸡新品系的选育进程，并为后续商业化配套杂交提供可靠种质保障。肤色遗传观察研究已表明，乌鸡的肤色性状主要是由常染色体Fm显性基因和性连锁ID色素抑制基因共同作用的结果。Dorhorst等通过全基因组SNP-性状关联分析，明确了鸡Fm基因位于20号染色体的10.3-13.1Mb、ID基因位于Z染色体的72.3Mb处。进一步地研究更发现，与白皮肤鸡不同的是，在乌鸡的Fm区域内存在着复杂基因重组，造成约130kb的重复区间（CNVs），包含有EDN3、SLMO2、TUBB1等5个基因，其中EDN3基因是与黑色素的形成和沉积密切相关的。因此，通过检测Fm区域内EDN3基因的拷贝数差异应能准确地反映鸡种肤色的黑与白，并能通过拷贝数的差异对群体的纯杂度进行遗传评价。 

实时荧光定量PCR（real-time fluorogenetic quantitative PCR，FQ-PCR）是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。SYBR Green I是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链结构的小沟中。其处于游离状态时,检测不到荧光信号，当结合dsDNA后荧光强度明显增强，即被荧光探测系统检测到，荧光强度的增加与初始模板量相关，可以进行定量DNA分析，其优势在于检测方法简便，同时降低了检测成本。但是，由于该染料能够结合任何dsDNA分子，因此不能保证PCR的特异性。当然，通过优化PCR的反应条件，可以减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生；另外，也可以借助熔解曲线分析法来区分非特异性产物和引物二 聚体而进行定性诊断。在定量方法上，实时荧光定量PCR分为绝对定量与相对定量两种。绝对定量法需构建标准品及标准曲线，通过已知的标准曲线来推算样品模板的绝对量。相对定量法是指同时扩增待测目的基因片段和一个作为内参照的管家基因片段（反应在2管中分别进行，也可在同一管中进行），测得两者的Ct值之差，即ΔCt。比较不同待测样本DNA的ΔCt值与正常样本DNA的ΔCt值，即可通过2^-ΔΔCt计算公式对未知样本目的基因的原始拷贝数作出判断，从而对病理状态作出判断或诊断。该方法的特点在于使用了对照样品，使得不同来源、不同实验处理、不同时间点检测的样品基因变化具有了可比性；并且无需构建标准曲线，比较简便。该方法一是需要目的基因与内参基因的扩增效率相近；二是需要扩增效率尽量接近于100%最佳，这两点都可以通过一系列反应条件优化来实现。 

传统的基因拷贝数检测技术有免疫印迹、荧光探针杂交、多重可扩增探针杂交、多重连接探针杂交技术等，但大多存在检测过程复杂、繁琐耗时、成本高、放射性危害、假阳性、敏感度不高等缺点。本发明利用实时荧光定量PCR技术，对鸡基因组的EDN3基因拷贝数差异进行检测，仅需荧光PCR仪器和少量基因组DNA即可准确检测，实现了快速、简便、准确检测CNVs。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测乌鸡EDN3基因拷贝数差异的试剂盒。该试剂盒能简便快速、准确可靠地检测乌鸡个体的EDN3基因拷贝数，有效区分乌鸡肤色的Fm纯合与杂合。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种通过检测EDN3基因拷贝数差异来鉴定乌鸡肤色基因型的试剂盒，其特征在于包括以下组成： 

（1）内参基因GAPDH扩增引物； 

Forward:5’-CAG CTC CCT CAG CTG ATG C-3’； 

Reverse:5’-TCC ACA ATG CCA AAG TTG TC-3’； 

（2）目的基因EDN3扩增引物； 

Forward:5’-CAC GTA ACA TCC TTC TGA CAG C-3’； 

Reverse:5’-ATC ATA AAC AAA CAG CCA AAT C-3’； 

（3）校样品DNA； 

（4）荧光定量PCR反应液； 

（5）双蒸水。 

进一步地，所述校样品DNA为确定包含单拷贝EDN3基因序列和GAPDH基因序列的鸡 基因组DNA。 

所述荧光定量PCR反应液成分包含：PCR缓冲液；SYBR Green I染料；MyCl₂、Taq DNA聚合酶；dNTPs。 

本发明还提供了一种利用上述试剂盒检测乌鸡EDN3基因拷贝数的方法，步骤包括： 

（1）以校样品DNA为模板，分别利用目的基因EDN3和内参基因GAPDH引物，进行实时荧光定量PCR扩增，每个反应三个重复，分别记录循环数（Ct1和Ct2）； 

（2）以待测乌鸡的血液基因组DNA为模板，分别利用目的基因EDN3和内参基因GAPDH引物，进行实时荧光定量PCR扩增，每个反应三个重复，分别记录循环数（Ct3和Ct4）； 

（3）利用2^-ΔΔCt法计算得到待测乌鸡的EDN3基因拷贝数，计算公式为：基因拷贝数=2^^{-（（样品的目的基因平均Ct3-内参基因平均Ct4）-（校样品的目的基因平均Ct1-内参基因平均Ct2））}。 

采用本发明的试剂盒以待检样品DNA为模板，对目的基因EDN3和内参基因GAPDH进行实时荧光定量PCR反应，并以校样品DNA为对照，分别记录Ct值，计算得到待检样品的EDN3基因拷贝数，进而根据拷贝数差异判断乌鸡肤色的Fm基因型。本试剂盒操作无需构建标准曲线，简便快速，可重复性好，检测效率高；经鸡种测交验证，本发明方法能准确反映乌鸡个体的肤色Fm纯合与杂合。应用本检测方法有助于加快筛查乌鸡肤色纯合度，指导优质乌鸡新品系的目标选育，并为后续商业化配套杂交提供可靠种质保障。 

附图说明

图1是目的基因EDN3熔解曲线。 

图2是目的基因EDN3扩增曲线。 

图3是内参基因GAPDH熔解曲线。 

图4是内参基因GAPDH扩增曲线。 

图5是目的基因和内参基因PCR扩增片段琼脂糖电泳图 

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步说明本发明。 

实施例1EDN3基因拷贝数检测 

1实验仪器与材料 

实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad OPTICON2，美国）；超低温冰箱（Thermo，美国）；高速冷冻离心机（Eppendorf5417R，德国）；梯度PCR仪（ABI PCR system9700，美国）；可 调式微量移液器（Eppendorf，德国）；GEL EQ电泳凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）；紫外可见分光光度计（BioSpec-nano，日本）。 

2鸡血液基因组DNA提取 

采集伊莎蛋鸡B系（棕色羽、白肤、红冠、白胫）、兴安麻鸡（麻羽、白肤、红冠、青胫）、东乡绿壳蛋鸡（黑羽为主、乌肤、乌冠、黑或青胫）等鸡种个体的血液，于75%乙醇中保存。采用AxyPrep总血基因组DNA小量试剂盒（Axygen，美国）提取鸡血液全基因组DNA。提取后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；紫外可见分光光度计（BioSpec-nano，日本）测定DNA浓度。将DNA浓度统一稀释到5ng/μL。 

3引物设计 

本发明针对NCBI数据库中Gallus gallus基因组目的基因EDN3（NC_006107.3）和内参基因GAPDH（NC_006088.3）的序列设计出PCR引物，引物交由上海英骏生物技术有限公司合成。由于引物的特异性，可以获得纯净单一的扩增产物；同时两对引物扩增效率一致，可显著提高EDN3基因检测的稳定性。 

表1引物序列 

Table1The primer sequences 

4校样品的准备 

校样品DNA的要求是确定包含单拷贝数的EDN3基因序列和GAPDH基因序列，因此选择稳定表达白色皮肤的引进蛋鸡品种纯系（伊莎蛋鸡B系）。 

提取伊莎蛋鸡B系的血液基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用紫外可见分光光度计测定DNA摩尔浓度，将DNA浓度稀释到5ng/μL，作为校样品。-20℃保存。 

5实时荧光定量PCR（real-time fluorogenetic quantitative PCR） 

分别以校样品DNA和待检样品DNA为模板，用OPTICON2实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）进行扩增，每个样品三个重复。反应条件如下：94℃，30sec，然后进入PCR循环，94℃5sec，60℃40sec，72℃30sec，40个循环；最后72℃延伸5min。绘制熔解曲线，65℃-95℃，每0.2℃读板一次。反应体系见表2。 

表2实时荧光定量PCR反应体系 

Table2Reaction system of real-time quantitative PCR 

目的基因EDN3熔解曲线、扩增曲线见附图1、图2；内参基因GAPDH熔解曲线、扩增曲线见附图3、图4。 

PCR反应结束后将产物置于4℃保存。取产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳确保产物单一且大小正确，见附图5。 

6数据统计 

校样品DNA、待测样品均重复三次，分别确定各样品内参基因GAPDH和目的基因EDN3的Ct值，利用2^-ΔΔCt法计算待测样品相对于校样品的基因拷贝数差异，计算公式为： 

基因拷贝数=2^^{-（（样品的目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值）-（校样品的目的基因平均Ct值-内参基因平均Ct值））}。 

计算得到的数据采用SPSS21.0软件（SPSS Inc.，美国）进行统计分析。基因拷贝数统一用平均数±标准差（mean±STD）表示，Student’s t-test法进行差异显著性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 

实施例2不同鸡种个体的肤色Fm基因型分析 

根据实施例1的方法，分别检测东乡绿壳蛋鸡（黑羽为主、乌肤、乌冠、黑或青胫）、兴安麻鸡（麻羽、白肤、红冠、青胫）、伊莎蛋鸡B系（棕色羽、白肤、红冠、白胫）等鸡种个体的EDN3基因拷贝数，结果见表3。由表3可见，白皮肤兴安麻鸡、伊莎蛋鸡B系的EDN3基因拷贝数与校样品基本一致，为1.0左右；东乡绿壳蛋鸡的EDN3基因拷贝数与校样品存在倍数差异。据此判断与待测乌鸡肤色相关的Fm基因型：当EDN3基因拷贝数为2.0左右时为纯合的Fm/Fm；当基因拷贝数为1.5左右时为杂合的Fm/fm；当基因拷贝数为1.0左右时为纯合的fm/fm。 

表3不同鸡种的EDN3基因拷贝数 

Table3Different chickens’EDN3gene copy number 

实施例3测交验证试验 

将已知EDN3基因拷贝数的东乡绿壳蛋鸡公鸡，按公母比1:6的比例，与伊莎蛋鸡B系母鸡繁殖下一代。如果东乡♂基因型为Fm/Fm纯合，则F1子代公、母鸡的肤色均应为黑色；如果东乡♂基因型为Fm/fm杂合子，则F1子代公、母鸡的肤色中会出现白色，且白肤比例大致趋于50%。测交试验结果见表4，肤色分离统计数据证实了EDN3基因拷贝数差异检测方法的准确性。 

表4测交验证结果 

Table3Cross test’s results 

本试剂盒操作无需构建标准曲线，简便快速，可重复性好，检测效率高；经鸡种测交验证，本发明方法能准确反映乌鸡个体的肤色Fm纯合与杂合。应用本检测方法有助于加快筛查乌鸡肤色纯合度，指导优质乌鸡新品系的目标选育，并为后续商业化配套杂交提供可靠种质保障。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州市农业科学研究院

 

<120>  一种通过检测EDN3基因拷贝数差异来鉴定乌鸡肤色基因型的试剂盒

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cagctccctc agctgatgc                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tccacaatgc caaagttgtc                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cacgtaacat ccttctgaca gc                                              22

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

atcataaaca aacagccaaa tc                                              22

 

 

Claims (4)

1.一种通过检测EDN3基因拷贝数差异来鉴定乌鸡肤色基因型的试剂盒，其特征在于试剂盒包括：

（1）内参基因GAPDH扩增引物；

Forward:5’-CAGCTCCCTCAGCTGATGC-3’；

Reverse:5’-TCCACAATGCCAAAGTTGTC-3’；

（2）目的基因EDN3扩增引物；

Forward:5’-CACGTAACATCCTTCTGACAGC-3’；

Reverse:5’-ATCATAAACAAACAGCCAAATC-3’；

（3）校样品DNA；

（4）荧光定量PCR反应液；

（5）双蒸水。

2.如权利要求1所述的试剂盒中，其特征在于：所述校样品DNA为确定包含单拷贝EDN3基因序列和GAPDH基因序列的鸡基因组DNA。

3.如权利要求1所述的试剂盒中，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液成分包含：PCR缓冲液、SYBR Green I染料、MyCl₂、Taq DNA聚合酶、dNTPs。

4.利用权利要求1所述的试剂盒检测EDN3基因拷贝数的方法，其特征在于包括步骤：

（1）以校样品DNA为模板，分别利用目的基因EDN3和内参基因GAPDH引物，进行实时荧光定量PCR扩增，每个反应三个重复，分别记录循环数（Ct1和Ct2）；（2）以待测乌鸡的血液基因组DNA为模板，分别利用目的基因EDN3和内参基因GAPDH引物，进行实时荧光定量PCR扩增，每个反应三个重复，分别记录循环数（Ct3和Ct4）；

（3）利用2^-ΔΔCt法计算得到待测乌鸡的EDN3基因拷贝数，计算公式为：基因拷贝数=2^^{-（（样品的目的基因平均Ct3-内参基因平均Ct4）-（校样品的目的基因平均Ct1-内参基因平均Ct2））}。

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