CN104830843A - 用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用。该引物组合物包括2对引物对，其中，1对引物对为SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列如SEQ ID NO.1、2所示；另一对引物对为SLCO1B3非插入序列引物，序列如SEQ ID NO.1、3所示。以待测鸡的DNA基因组为模板，用所述引物对其进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，可以通过检测扩增出的209bp和312bp条带来鉴定待测鸡是否产绿壳蛋，同时可以鉴定鸡绿壳蛋基因型。

Description

用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴别绿壳蛋鸡的引物组合物及其应用。

背景技术

分子标记辅助选择(MAS，marker assisted selection)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。目前，MAS技术应用主要集中在基因聚合(Gene pyramiding)、基因渗入(Gene transgression)、根据育种计划构建基因系等方面。在家禽育种上，分子辅助标记选择运用的非常广泛。如对羽速，胫长，及裸颈性状的表型选择非常成功，而且广泛应用与生产，以相应的快慢羽基因(Kk)，性连锁矮小基因(dwarf，dw)及裸颈基因作为分子标记进行MAS的技术，在育种和生产中也逐渐得到应用。

SLCO1B3基因属于有机阴离子转运蛋白(organicanion-transporting polypeptide)家族，能帮助胆盐类物质跨膜运输至卵壳腺，卵壳腺上皮细胞将胆绿素分泌至蛋壳中，使得蛋壳最终呈现绿色。David Wragg和Joram M.Mwacharo等人通过RT-PCR(real-time PCR)的检测在美国和欧洲本地鸡种Mapuche fowl的研究上发现SLCO1B3基因在母鸡的输卵管和壳腺部有过量的表达。他们通过全基因组相关联分析(GWAS)的方法发现鸡3号染色体上EAV-HP的长末端重复序列转插入到了鸡1号染色体SLCO1B3基因和SLCO1C1基因之间，这就是SLCO1B3过量表达的原因。另一个候选基因HMOX1，则未过量表达。由于SLCO1B3基因SLCO1C1之间存在EAV-HP插入序列促使SLCO1B3基因过量表达，从而产生绿壳蛋。绿壳蛋基因型(LS)相对非绿壳蛋基因型(CC)为显性，所以在母鸡体细胞中只要包含一条SLCO1B3基因的染色体单链就可以出现绿壳蛋的表型，而如果公鸡是杂合子，则理论上后代一半群体中含有非绿壳蛋基因型，而但在表型选育种无法将这一部分剔除，从而选育精准度不高，所以有必要对进行分子标记选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴别绿壳蛋鸡的引物组合物及其应用。

本发明中用于鉴别绿壳蛋鸡及其基因型的引物组合物，包括2对引物对，其中，1对引物对为SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列为：上游引物：5’-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3’，下游引物：5’-GGACGAGCGAACGGAGAC-3’，如SEQ ID NO.1、2所示；另一对引物对为SLCO1B3非插入序列引物，序列为：上游引物：5’-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3’，下游引物：5’-ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT-3’，如SEQ ID NO.1、3所示。

所述引物组合物可以应用于鉴别绿壳蛋鸡的基因型。

应用所述引物组合物鉴别绿壳蛋鸡基因型的方法，包括如下步骤：以待测鸡的DNA基因组为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果：若只得到209bp的条带，则待测鸡的SLCO1B3基因基因型为LS/LS显性纯合型；若只得到312bp的条带，则待测鸡的SLCO1B3基因基因型为CC/CC隐性纯合型；若得到209bp和312bp的两条带，则待测鸡的SLCO1B3基因基因型为为LS/CC杂合型。。

其中，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；之后，72℃延伸5min；反应体系：25微升体系，2×PCR Master Mix 12.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物1(10μM)0.5μL，下游引物2(10μM)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌过的超纯水9.5μL。

本发明还保护所述引物组合物在制备鉴别绿壳蛋鸡及其基因型试剂盒中的应用。

本发明还包括含有权利要求1所述的引物组合物的试剂盒，及其在鉴别绿壳蛋鸡及其基因型中的应用。

本发明还包括一种用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的分子标记，显性SLCO1B3基因分子标记的序列如SEQ ID NO.4所示，隐性SLCO1B3基因分子标记的序列如SEQ IDNO.6所示。该分子标记可用于鉴别绿壳蛋鸡的基因型。

根据Ensemble数据库的信息，鸡SLCO1B3基因共20032bp，位于1号染色体的65,317,306-65,337,388bp。SLCO1B3基因SLCO1C1之间存在EAV-HP插入序列，插入位点位于鸡1号染色体基因序列的65，319，447处。本发明通过设计合成3条引物用于多重PCR扩增，扩增SLCO1B3基因插入EAV-HP引物序列为序列1和序列2组成的引物组合物，扩增SLCO1B3非插入引物序列为序列1和序列3组成的引物组成物。可以通过检测扩增产物来鉴定待测鸡的SLCO1B3基因基因型。

附图说明

图1：SLCO1B3基因插入EAV-HP测序图；

图2：SLCO1B3基因非插入EAV-HP测序图；

图3：SLCO1B3基因EAV-HP插入序列的三种基因型琼脂糖电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以包含SLCO1B3基因的待测鸡全基因组DNA为模板，设计特定的引物对以引物对扩增鸡SLCO1B3基因EAV-HP插入片段序列，将扩增产物直接在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，电泳完毕后采用凝胶成像系统拍照，判定个体基因型进行判定。具体实施方法：

(1)特定引物的设计：

以NCBI公布的红色原鸡序列(NC_006093.2)和文献《Endogenous RetrovirusEAV-HP Linked to Blue Egg Phenotype in Mapuche Fowl》中公布序列做为参考，利用Primer6.0设计PCR引物，

其EAV-HP插入片段扩增序列为：

上游引物：ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG，(序列表中的序列1)

下游引物：GGACGAGCGAACGGAGAC，(序列表中的序列2)。

其扩增产物长度为209bp；

非插入片段扩增序列为：

上游引物：ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG，(序列表中的序列1)

下游引物：ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT，(序列表中的序列2)

其扩增产物长度为312bp。

(2)鸡样本的采集：

以2个鸡品种/系作为检测对象，其中绿壳蛋鸡从江西引进，属于培育品种，旧院黑鸡属于地方品种。具体采集样本见下表：

表1 试验材料

(3)鸡血样基因组DNA的提取

①冷冻血液在室温融化以后，取10μL移至离心管中，加入500μL STE缓冲液，10μL SDS，加入10μL蛋白酶K(浓度为10μg/uL)，混合，上下充分摇动，37℃摇床水浴2小时，然后55℃水浴过夜。

②将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，轻摇离心管20分钟，直至两相混合形成乳浊液，4℃，12000r/min离心10分钟。

③取上清，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

④取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇混合液(24:23:1)，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

⑤取上清，加入等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

⑥取上清，加入2倍体积的预冷-20℃冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。

⑦4℃，12000r/min离心10分钟，去上清，然后加4℃预冷的70％乙醇快速冲洗两次，12000r/min离心10分钟，去上清。

⑧将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入适量(100-200μL)TE(pH8.0)缓冲液溶解，置4℃冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于4℃、-20℃、-70℃中备用。

注意在抽吸上清液时，尽量小心勿将中间的蛋白质层抽出。

(4)PCR扩增

反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；之后，72℃延伸5min，4℃保存。

反应体系：25微升体系，2×PCR Master Mix12.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物1(10μM)0.5μL，下游引物2(10μM)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌过的超纯水9.5μL。

利用下游引物(序列2、序列3)，扩增目的片段，扩增产物检测用1.0％琼脂糖凝胶，点样量2.5μL，扩增片段(209bp(绿壳蛋基因等位基因)、312bp(非绿壳蛋等位基因))与目的片段大小一致且特异性好。

(5)扩增基因与公布序列的对比

SLCO1B3基因及EAV-HP插入序列与公布序列对比：

说明：测序绿壳蛋序列.seq:绿壳蛋序列.seq identity＝91.87％(192/209)gap＝0.00％(0/209)，序列相似度达91.87％。

SLCO1B3基因无EAV-HP插入序列与公布序列对比：

非绿壳蛋序列拼接.seq:slco1b3基因最新序列.seq identity＝96.78％(301/311)gap＝0.32％(1/312)，序列相似度达96.78％。

(6)电泳及基因型判定：

将产物进行测序，并将测序结果放入DNA star中的SeqMan软件进行序列拼接，得到209bp SLCO1B3基因及EAV-HP插入序列测序产物(绿壳蛋产物)和312bpSLCO1B3基因无EAV-HP插入序列蛋测序产物(非绿壳蛋产物)，拼接完成后用DNAman进行测序结果与公布序列进行比对，其中，209bp的绿壳蛋产物与公布序列的相似度为91.87％，312bp非绿壳蛋产物相似度为96.78％，可以初步确定为目的片段。

将扩增产物于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳完毕后进行拍照。电泳图如图3所示，图中可见三种不同的带型，扩增带型分别定义为LS/LS、LS/CC和CC/CC，其中LS/LS为纯合子绿壳蛋基因型，只出现209bp的条带，LS/CC为杂合子绿壳蛋基因型，出现209bp和312bp的条带，CC/CC为非绿壳蛋基因型，只出现312bp的条带。

(7)鸡SLCO1B3基因及EAV-HP插入序列的基因和基因型频率统计分析

①基因型频率：指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于PCR方法的检测结果为显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率。

基因型频率＝基因型个数/检测群体总数

②等位基因频率：记为Pi，表示在一个群体中某一等位基因的数量与占据同一基因座位的全部等位基因总数的比例，取值0-1之间。

Pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+……(ijn)]/2N；

Pi：第i个等位基因的频率；

i：纯合等位基因；

j1、j2、……jn：与i共显的第1到第n个等位基因；

表2 SLCO1B3基因及EAV-HP插入序列基因型频率和等位基因频率及遗传多态指标

结果显示：通过引物序列组合物扩增出的基因，可以准确的鉴别绿壳蛋鸡及其基因型。SLCO1B3基因插入序列基因型LS/LS能够作为产绿壳蛋的分子遗传标记。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物，其特征在于，包括2对引物对，其中，1对引物对为SLCO1B3基因插入EAV-HP序列引物，序列为：上游引物：5’-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3’，下游引物：5’-GGACGAGCGAACGGAGAC-3’，如SEQID NO.1、2所示；另一对引物对为SLCO1B3非插入序列引物，序列为：上游引物：5’-ATCAGGAAGGTGTGAATGACTTG-3’，下游引物：5’-ACAGAAGTTATACTACCACACGAAT-3’，如SEQ ID NO.1、3所示。

2.权利要求1所述的引物在鉴别绿壳蛋鸡基因型中的应用。

3.一种应用权利要求1所述引物鉴别绿壳蛋鸡基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测鸡的DNA基因组为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果：若只得到209bp的条带，则待测鸡的SLCO1B3基因基因型为LS/LS显性纯合型；若只得到312bp的条带，则待测鸡的SLCO1B3基因基因型为CC/CC隐性纯合型；若得到209bp和312bp的两条带，则待测鸡的SLCO1B3基因基因型为为LS/CC杂合型。

4.根据权利要求3所述的鉴别绿壳蛋鸡基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；之后，72℃延伸5min；反应体系：25微升体系，2×PCR Master Mix 12.5μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物1(10μM)0.5μL，下游引物2(10μM)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌过的超纯水9.5μL。

5.权利要求1所述的引物在制备鉴别绿壳蛋鸡基因型的试剂盒中的应用。

6.用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物。

7.权利要求6所述的试剂盒在鉴别绿壳蛋鸡基因型中的应用。

8.一种用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的分子标记，其特征在于：显性SLCO1B3基因分子标记的序列如SEQ ID NO.4所示，隐性SLCO1B3基因分子标记的序列如SEQ ID NO.6所示。

9.如权利要求8所述分子标记在鉴别绿壳蛋鸡基因型中的应用。