CN102134606B - 鸡crbp1基因遗传变异的检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法，包括提取鸡血样基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为：TAAATTTATAGTTGCGGTCAT，下游引物序列为：AGTTCCAGGTGACGGGTGAG；将扩增产物进行凝胶电泳并拍照，分析电泳结果。其中鸡基因组第14604位点G/T多态性与产蛋性状(如产蛋量、开产体重、开产蛋重等)相关，选出的单核苷酸多态性位点以辅之于育种，可以加快畜禽育种进程。

Description

鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法和应用

技术领域

本发明涉及基因变异的检测方法，具体涉及鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法和应用。

背景技术

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。第1代分子标记限制性片段长度多态性(RFLP)主要研究对象是由限制性酶切位点的差异造成的DNA片段长度多态性；第2代分子标记是数目可变的串联重复序列(VNTR)，包括小卫星(minisatellite)和微卫星(microsatellite)。与前二代分子标记相比，SNPs具有以下特点：(1)数量多、覆盖密度大，据估计平均每1000bp就会出现一个。目前已检测出93％的人类基因包含SNPs，98％的SNPs其距离不超过5kb，因此，可以在几乎每个基因的内部或附近提供一系列标记；(2)由于SNPs一般只有2个等位基因，在检测时只需要通过一个简单的“+/-”方式即可进行基因分型，这使得检测、分析易于实现自动化；(3)遗传稳定性强，与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNPs具有更高的遗传稳定性；(4)多态性丰富，SNPs包含了目前已知DNA多态性的80％以上，是最常见的遗传变异类型。基于单核苷酸多态性的上述优点，研究SNP有助于解释不同个体表形性状的差异，不同群体和个体对疾病、环境因子等反应的差异。

目前对SNP进行检测的方法较多，而大多数实验室采用的是成本相对较低、技术易掌握、检出率较高、快捷、安全和步骤简单的PCR-SSCP技术。该方法原理是：经PCR扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并确保成为DNA单链，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同，PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因靶DNA中发生单碱基置换，或个别碱基插入或缺失时，因迁移产生变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异，即多态型。

SNP有非同义cSNP、同义cSNP、内含子区SNP、调控区的rSNP几类，均能从不同角度影响基因功能，其中非同义cSNP由于改变基因编码的氨基酸，从而影响基因功能；同义cSNP可通过改变mRNA的二级结构、翻译速度等影响基因功能的发挥；内含子区SNP可通过改变剪接位点的活性来影响基因功能；调控区的rSNP则可通过影响启动子元件来调节基因的功能。

CRBP1是一类与维生素A(VA)代谢有关的疏水性小分子，担任着转运视黄醇(VA)的任务，从而参与体内许多生物学过程，如视觉、繁殖、上皮细胞的维持、骨的生长发育等。Su等(2004)以79个人组织和61鼠组织为研究材料，采用微阵列技术制作了CRBP1基因的表达模式图，其结果显示，该基因在机体表达水平表现出组织差异性，在下丘脑、子宫、卵巢、睾丸几个繁殖轴组织中均有表达，以卵巢表达量最高。RICHARD等(1996)分别采用免疫组织化学、甲硫氨酸标记亲和层析两种方法仅从小鼠子宫的间质细胞中分离CRBP1。因此研究CRBP1基因遗传变异和分子遗传特征对动物生长发育、繁殖具有重要理论意义和实践意义。

迄今为止，国内外均未见鸡CRBP1基因遗传变异的研究，由于中国地方鸡种CRBP1基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与产蛋性状(如产蛋量、开产体重、开产蛋重等)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明的目的在于，采用PCR-SSCP技术检测鸡CRBP1基因的单核苷酸多态性，并将其与生产性状进行关联分析，以筛选出SNP位点以辅之于育种，加快畜禽育种进程。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种鸡CRBP1基因遗传变异的检测方法，其特征在于包括提取鸡血样基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为：TAAATTTATAGTTGCGGTCAT，下游引物序列为：AGTTCCAGGTGACGGGTGAG；将扩增产物进行凝胶电泳并拍照，分析电泳结果。

本发明的一个实施方式中，其中PCR扩增步骤包括30-40个循环的变性、退火、延伸步骤。

本发明的一个实施方式中，其中PCR扩增为对包括鸡CRBP1基因第14604位点的基因进行扩增。

本发明的一个实施方式中，PCR扩增片段长度为320bp。

本发明的一个实施方式中，还包括对基因片段进行测序。

本发明还涉及一种或一对PCR扩增引物，其序列为TAAATTTATAGTTGCGGTCAT或AGTTCCAGGTGACGGGTGAG。

本发明还涉及鸡CRBP1基因第14604位点G/T多态性在畜禽育种中的应用。

本发明还涉及将所述的检测方法在鸡育种中的应用。

本发明还涉及所述的PCR扩增引物在鸡CRBP1基因第14604位点G/T多态性检测中的应用。

本发明根据CRBP1基因的序列设计引物，分别以2个鸡品种/系的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到的鸡的CRBP1基因的部分序列与NCBI公布的原鸡的序列进行比较发现在编码区第14604位存在SNP多态性。

针对上述第14604位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增包含SNP位点的基因片段，然后进行高温变性再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对2个鸡品种/系的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与鸡产蛋性状(开产体重、300日龄产蛋量、开产蛋重、平均产蛋间隔)进行关联分析，该SNP位点的TT基因型可以做为一个提高鸡300日龄产蛋量的候选分子遗传标记。

附图说明

图1PCR扩增产物的凝胶电泳结果；

图2PCR扩增产物的测序验证；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

(1)特定引物的设计：针对鸡CRBP1基因第14604位点发生密码子突变而可能引起剪接位点的活性进而影响基因功能的单核苷酸多态性，以NCBI公布的原鸡序列(NC_006096.2REGION：6984276..7001797)为参考，利用Primer5.0设计能够扩增包括14604位点的PCR引物，其引物序列M对为：上游引物：TAAATTTATAGTTGCGGTCAT(14480～14500)，下游引物：AGTTCCAGGTGACGGGTGAG(14780～14799)。扩增片段长度为320bp。对不同品系和个体的血样混合成DNA池后以该对引物进行扩增，得到与目的片段大小一致的片段，经双向测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现在14604位存在G/T多态性。

(2)鸡样本的采集：以2个鸡品种/系作为检测对象，具体采集样本见下表。

(3)鸡血样基因组DNA的提取

①冷冻血液在室温融化以后，取10μL移至离心管中，加入500μLSTE缓冲液，10μL SDS，加入10μL蛋白酶K(浓度为10μg/uL)，混合，上下充分摇动，37℃摇床水浴2小时，然后55℃水浴过夜。

②将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，轻摇离心管20分钟，直至两相混合形成乳浊液，4℃，12000r/min离心10分钟。

③取上清，再加入等体积苯酚，轻摇离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

④取上清，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇混合液(24∶23∶1)，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

⑤取上清，加入等体积氯仿，缓慢颠倒离心管10分钟，4℃，12000r/min离心10分钟。

⑥取上清，加入2倍体积的预冷-20℃冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。

⑦4℃，12000r/min离心10分钟，去上清，然后加4℃预冷的70％乙醇快速冲洗两次，12000r/min离心10分钟，去上清。

⑧将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入适量(100-200μL)TE(pH8.0)缓冲液溶解，置4℃冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于4℃、-20℃、-70℃中备用。

注意在抽吸上清液时，尽量小心勿将中间的蛋白质层抽出。

(4)PCR扩增

PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix 5μL、ddH₂O 3.4μL、引物(10pmol/μL)各0.4μL、模板DNA(50ng/mL)0.8μL，共10μL)采用的是混合法，即先把引物、酶、ddH₂O比扩增量多一点的份数混匀后分装，最后加入模板短暂离心后进行PCR扩增，扩增程序为94℃预变性5min→(94℃变性30s→50.7℃退火30s→72℃30s)×35cycle→72℃延伸10min.

(5)电泳及基因型判定：

将扩增产物99℃变性5min后于10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后进行硝酸银染色拍照。根据电泳结果直接判定个体基因型，两条带的为杂合子，上面一条带为GG纯合型，下面一条带的为TT纯合子，具体见附图1。

(6)不同基因型个体PCR产物的测序验证

对不同基因型个体各5个50μl大体系扩增，经琼脂糖凝胶检测有目的条带后直接送华大公司纯化测序，结果见附图2，双峰为杂合型个体。

(7)鸡CRBP1基因SNP位点的基因和基因型频率统计分析

①基因型频率：指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于PCR-SSCP方法的检测结果为共显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率。

基因型频率＝基因型个数/检测群体总数

②等位基因频率：记为Pi，表示在一个群体中某一等位基因的数量与占据同一基因座位的全部等位基因总数的比例，取值0-1之间。

Pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+……(ijn)]/2N

Pi：第i个等位基因的频率

i：纯合复等位基因

j1、j2、……jn：与i共显的第1到第n个等位基因

鸡CRBP1基因第14604位SNP基因频率分布表

(8)基因效应与性状的关联分析

①产蛋性能数据：开产日龄、开产体重、开产蛋重、300日龄产蛋量、最大连产天数、平均产蛋间隔。

②关联分析模型：Y_ij＝μ+B_i+G_j+e

其中，Y_ij：个体表型观测值；μ：群体均值；B_i：品种或品系固定效应；G_j：基因型固定效应；e：随机残差效应。

③软件：使用SPSS16.0软件包GLM程序计算基因多态位点对鸡产蛋性状的遗传效应分析，分析结果用最小二乘均数和标准误表示。

鸡CRBP114604SNP与产蛋性状的关联分析

注：上标不同大写字母表示同个性状不同基因型间差异极显著。

结果显示：该位点TT基因型可作为提高300日龄产蛋量的分子遗传标记。

Claims (6)

1.一种鸡CRBP1基因第14604位点G/T多态性的检测方法，其特征在于，包括提取鸡血样基因组DNA；对基因组DNA进行PCR扩增，在PCR扩增时使用的上游引物序列为：TAAATTTATAGTTGCGGTCAT，下游引物序列为：AGTTCCAGGTGACGGGTGAG；将扩增产物高温变性后进行凝胶电泳鉴定，并对扩增的基因片段测序；其中PCR扩增包括鸡CRBP1基因第14604位点的基因片段，PCR扩增片段长度为320bp。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中PCR扩增步骤包括30～40个循环的变性、退火、延伸步骤。

3.一对用于鸡CRBP1基因第14604位点G/T多态性检测的PCR扩增引物，其序列为TAAATTTATAGTTGCGGTCAT和AGTTCCAGGTGACGGGTGAG。

4.鸡CRBP1基因第14604位点TT基因型在提高鸡300日龄产蛋量中的应用，其中所述的鸡是指二郎山山地鸡02品系或二郎山山地鸡03品系。

5.权利要求1所述的检测方法在筛选鸡300日龄高产蛋量中的应用，其中所述的鸡是指二郎山山地鸡02品系或二郎山山地鸡03品系。

6.权利要求3所述的PCR扩增引物在鸡CRBP1基因第14604位点G/T多态性检测中的应用，其中所述的鸡是指二郎山山地鸡02品系或二郎山山地鸡03品系。

Images