CN102776273B - 猪 mlc2 5, 侧翼启动子区 snp 作为猪胴体性状的遗传标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪 MLC2的5’侧翼启动子片段作为猪胴体性状的遗传标记及制备方法与应用。该遗传标记具有如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的第53bp处分别存在一个C/A和A/C的突变，该等位基因的突变引起DraIII-RFLP的多态性。利用该遗传标记对大白猪和梅山猪F₂代进行了与猪胴体性状的关联分析，检测了不同基因型的启动子的转录活性。本发明还公开了该遗传标记的分型检测方法，为猪胴体性状分子标记辅助选择提供了新的遗传标记和检测方法。

Description

猪 MLC2 5, 侧翼启动子区 SNP 作为猪胴体性状的遗传标记及应用

技术领域

本发明涉及猪育种与猪的分子标记辅助选择领域，具体涉及一种与猪的胴体性状相关基因MLC25’侧翼启动子片段的克隆及其作为猪胴体性状遗传标记的应用。 

背景技术

人类对畜禽生产性能的选择从无意识到有意识已有几千年的历史，而从表型选择实践到基因型选择理论的探讨仅是近几十年的事情。在对畜禽生产性能进行选择时，主要是依靠对其目标性状的标记，而先前的生化免疫标记和细胞遗传标记检测位点数目有限、多态性贫乏。20世纪80年代以后，分子遗传标记技术的诞生和逐步完善，使动物育种学家们又迅速把具有丰富多态的DNA分子标记应用到动物育种理论中。从而出现了以DNA分子标记技术为主的畜禽经济性状标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)育种。它借助分子标记来选择数量性状的基因型，同时利用标记信息和个体表型信息，可以更为准确地估计育种值，提高选择效率，大大加快育种进程。 

DNA分子标记是指能反应生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它能直接反映基因组DNA间的差异。从1974年Grozdicker首创了第一代分子标记至今，DNA分子标记先后产生了三代几十个种类。第一代为RFLP，第二代为SSR、RAPD、AP-PCR、EST等，第三代为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP是由美国麻省理工学院的Lander ES于1996年提出的(Lander ES.The new genomics：global views ofbiology.Science.1996，274：536-539)。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。SNP标记在大多数基因组中存在较高的频率、数量丰富，其有望成为最重要最有效的分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区SNP(coding-region SNP，cSNP)、基因周边SNP(perigenic SNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)三类。SNP在DNA分子上分布不均匀，在非转录区SNP频率要高于转录区SNP频率，这可能是受进化中选择的压力影响。转录区的SNP一般与蛋白的表达有关，而非转录区的SNP则可以调控基因的表达。所以这两类SNP不仅都可以作为分子标记，还可能与一些动物的生产性状有直接关系。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，位于结构基因5′端上游区，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它。因此，研究功能基因5’侧翼序列启动子中的SNP可能有更重要的生物学功能，能够影响基因的表达。 

MLC2(myosin light chain 2)编码肌球蛋白轻链2，是肌球蛋白的重要组分(肌球蛋白的凝聚状态以及热诱导时的凝胶特性对肉制品的质构、脂肪和水的结合能力等有很大影响)，对肌球蛋白的结构和功能显示重要调节作用，在肌肉的发生过程中起着调控重链表达的作用。MLC2属于肌钙蛋白C超家族，能够可逆的由肌球蛋白轻链磷酸酯酶MLCP脱磷酸化和Ca²⁺/CaM依赖的肌球蛋白轻链激酶MLCK磷酸化，参与调节肌动蛋白与肌球蛋白互作、Ca²⁺敏感性、葡萄糖转运和影响肌肉性能的其他相关参数。另外，MLC2 也是一种丝氨酸/苏氨酸激酶的底物，能被有丝分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，参与多种细胞信号途径。Davoli等已将其定位于猪的3号染色体短臂(Davoli et al.Identification of SNPs，mapping and analysis of allele frequencies in two candidate genes for meat production traits：the porcine myosin heavy chain 2B(MYH4)and the skeletal muscle myosin regulatory light chain 2(HUMMLC2B).Anim Genet.2003，34：221-225)，徐德全等从杂交亲代大白猪与子代长大猪的背最长肌的消减cDNA文库中筛选到其EST，利用电脑克隆和SMART等技术，获得了其cDNA全长序列和全部内含子序列(GenBank登录号分别为AY754870和AY870651，Xu et al.Identification of a differential gene HUMMLC2B between F1 hybrids Landrace×Yorkshire and their female parents Yorkshire.Gene，2005，352：118-126)。但有关猪MLC2启动子区SNP的研究至今还未见报道。因此在分子水平上研究猪MLC2基因启动子区的SNP，分析其与猪胴体等经济性状关系，具有重要的意义。 

发明内容

本发明目的在于克隆猪MLC25’侧翼启动子区225bp的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1(大白猪)和SEQ ID NO：2(梅山猪)所示。通过对2个猪种的上述序列进行Cluster W比对，寻找SNP位点，建立相应的SNP分型方法，分析其与与猪胴体性状的关系，为猪的胴体性状标记辅助选择提供有用的遗传标记。 

本发明通过以下技术方案实现： 

选择中国地方猪种梅山猪和外来的欧洲大白猪为实验材料，从猪血液中提取基因组DNA，以猪MLC2基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物： 

正向引物F：5’TATCCTTCTGTCCTCCTG 3’， 

反向引物R：5’CTCTATGACCTTGGACTTG 3’。 

利用该引物进行PCR扩增，PCR产物回收、克隆、测序后，利用Cluster W进行序列比对。 

本发明提供了猪MLC25’侧翼启动子区即位于该225bp扩增片段内部的1处核苷酸多态性(SNP)，即：在所述的序列表SEQ ID NO：1的53bp处存在一个C/A的突变，在序列表SEQ ID NO：2的53bp处存在一个A/C突变，上述等位基因的突变导致HinfI酶切位点的改变。其SNP位点如图2所示。 

本发明提供了检测上述序列53bp处A/C变异的HinfI-RFLP基因型分型方法。 

进一步本发明提供了利用HinfI-RFLP方法确定不同基因型个体与猪胴体性状之间的相关关系的关联分析的应用。 

本发明进一步克隆了不同基因型大白猪和梅山猪的MLC2基因5’侧翼启动子901bp序列。分别构建重组质粒，转染C2C12细胞，观察不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子序列在细胞中的活性。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是所克隆到的大白猪MLC2基因5’侧翼启动子区的核苷酸序列，长度为225bp。 

序列表SEQ ID NO：2是所克隆到的梅山猪MLC2基因5’侧翼启动子区的核苷酸序列，长度为225bp。 

图1是大白猪和梅山猪MLC2基因5’侧翼启动子区225bp片段的扩增条带：图中：M为DL2000Marker； 泳道1-3为以大白猪基因组DNA为模板的扩增条带；泳道4-5为以梅山猪基因组DNA为模板的扩增条带。 

图2是大白猪和梅山猪MLC2基因5’侧翼启动子区225bp序列的比对结果和SNP位点。 

图3是MLC25’侧翼区HinfI-RFLP检测结果：琼脂糖浓度为2％；图中泳道M为DL2000Maker； 

图4是不同基因型大白猪和梅山猪的MLC2基因5’侧翼901bp启动子PCR扩增：图中M为DL2000Marker；泳道1-3为以大白猪基因组DNA为模板的扩增条带；泳道4-5为以梅山猪基因组DNA为模板的扩增条带。 

图5是用于分析不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子活性的PGL3-basic载体结构示意图。 

图6是不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子转染C2C12细胞的结果。 

具体实施方式

实施例1利用苯酚抽提法提取大白猪和梅山猪血液总DNA 

将现场所采大白猪(来自华中农业大学试验猪场，为常规报道的品种，下同)新鲜血液加入0.5M乙二胺四乙酸(即EDTA，购自武汉市江润精细化工有限责任公司)作为抗凝剂(按血液量体积比的1/10)，并摇匀，防止凝血。 

白细胞分离： 

(1)4℃，6000rpm，离心10min，去血清。 

(2)加入2倍体积双蒸水，轻轻摇匀沉淀10min，破碎红细胞。 

(3)4℃，6000rpm，离心10min，去上层红细胞浆。 

(4)利用0.9％NaCl洗涤沉淀，轻轻摇匀10min。 

(5)4℃，6000rpm，离心10min，弃上清，得到白细胞沉淀。 

总DNA提取： 

(1)在白细胞沉淀或肌肉组织磨碎浆液中，加入等体积1×SET(1ml)，蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度100μg/mL，10％十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度0.5％，摇匀，55℃水浴摇床中温育过夜消化。 

(2)在消化液中加入等体积的Tris饱和酚，轻轻摇匀15min，于4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。 

(3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。 

(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。 

(5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，小心混匀后可见白色絮状DNA沉淀。 

(6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水溶解DNA。 

(7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测 DNA提取质量。 

实施例2：猪MLC25’侧翼启动子区特异DNA片段的获得及SNP检测方法的建立 

选择外来血缘猪“大白猪”和中国地方猪种“梅山猪”(来自华中农业大学试验猪场，为常规报道的品种)为试验材料，以猪MLC2基因(登录号AY754870)的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物： 

正向引物F：5’TATCCTTCTGTCCTCCTG 3’ 

反向引物R：5’CTCTATGACCTTGGACTTG 3’ 

分别以大白猪(国外血缘猪品种)和梅山猪(中国地方猪品种)血液基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增(见图1)。 

PCR反应体系见表1。 

表1PCR反应体系 

PCR反应条件见表2所示。 

表2PCR反应条件 

PCR产物经回收、克隆后，进行序列测定。测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。经Cluster W比对分析，序列比对结果见图2。上述片段大小为225bp，该序列53bp处存在A/C变异，该等位基因的突变引起了HinfI酶切位点多态性。 

取PCR扩增产物8.5μl，加入限制性内切酶HinfI 0.5μl，1μl 10×buffer，37℃酶切。酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下观察并记录酶切结果。当53bp处碱基都为A时存在HinfI酶切位点，酶切结果检测到两个片段计为AA型(53bp+172bp)；当突变位点为C时HinfI不识别该位点，酶切结果只检测到一条带，计为CC型(225bp)；当A和C都存在是，酶切结果为3条带，计为AC型(225bp+53bp+172bp)。结果如 图3所示。 

实施例3：本发明克隆的遗传标记与猪胴体性状的关联分析及应用 

选择中国湖北省武汉市华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室于2000年、2003年、2004年组建的249头大白猪×梅山猪F₂(Liu et al.Association of MYF5 and MYOD1 gene polymorphisms and meat quality traits in Large White×Meishan F₂ pig populations.Biochem Genet.2008，46：720-732)代资源群体为实验材料根据HinfI-RFLP方法分型结果，分析猪MLC2基因5’侧翼启动子区HinfI-RFLP不同基因型与猪胴体性状的相关关系。采用SAS统计软件glm程序进行单标记方差分析，模型如下： 

模型Y_ijk＝μ+G_i+S_j+Y_k+βcov_ijk+e_ijk

Y_ijk为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1分别代表AA、AC和CC基因型，显性效应用1，-1和1分别代表AA、AC和CC基因型)；S_j、Y_k为固定效应，分别为性别、年份效应；β为屠宰体重的回归系数，cov_ijk为屠宰体重协变量，e_ijk为残差效应。 

表3猪MLC2基因5’侧翼序列不同基因型与猪胴体性状的统计分析表 

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)；基因效应^*表示p＜0.05，^**表示p＜0.01 

所检测的249头大白猪×梅山猪F₂代个体中，不同基因型与猪胴体性状间的统计分析结果见表3。由表3可以看出，HinfI-RFLP基因型不同时，屠宰率、胴体体重、眼肌高、眼肌宽存在显著差异。对于屠宰率、眼肌宽、胴体体重加性效应显著或极显著。 

实施例4不同基因型MLC2基因5’侧翼启动子重组质粒转染C2C12活性分析 

以猪MLC2基因的mRNA序列为种子，在猪的基因组中进行比对，根据其5’侧翼序列设计如下引物(斜体加粗部位为酶切位点)： 

正向引物F：5’CGAGCTCCCTTCTGTCCTCCTG 3’ 

反向引物R：5’CCCAAGCTTCAAGGCAGTGGCTCT 3’ 

以实施例1所提的大白猪和梅山猪的DNA为模板进行PCR扩增(见图4)，PCR反应体系见表4。 

表4PCR体系 

PCR反应条件见表5 

表5PCR反应条件 

扩增产物经回收(参见百泰克胶回收试剂盒说明书)，连接到pMD18-T载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司中国代理商)上，转化进入大肠杆菌DH5α挑取阳性克隆提取质粒(参见天根公司生产的质粒小提试剂盒，按试剂盒说明书操作)。经SacI和HindIII双酶切，回收该两个片段及PGL3-basic(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司中国代理商)空载体，经T4连接酶过夜连接，转化进入大肠杆菌DH5α挑取阳性克隆提取质粒(参见Omega E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit说明书)。 

转染前一天，取一瓶生长良好的细胞经胰酶消化后，加入2ml新鲜不含任何抗生素的10％FBS(购自美国Gibco公司产品)细胞培养液，用吸管将细胞完全吹散形成均匀的细胞悬液后，用细胞计数板对细胞进行计数。计算出24孔细胞培养板共需细胞量(每孔细胞数目约为0.5-2×10⁵)。向其内加入额外的新鲜的不含任何抗生素的10％FBS细胞培养液(总体积12mL)，吹打均匀后，每孔分装500μL细胞悬液，轻轻晃动培养板摇匀细胞后置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。 

待细胞密度达到80％～90％时进行转染(转染步骤参见invitrogen Lipofectamine^TM 2000)。本试验以PGL3-basic(购自Promega)为阴性对照，PGL3-control(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司中国代理商)为阳性对照，以PRL-TK(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美 国Promega公司中国代理商)做内参质粒(用以校正转染效率)，以Lipofectamine^TM 2000做转染试剂，每个缺失片段进行3次重复以校正误差。 

细胞转染48小时后进行收集，用1×磷酸盐缓冲液(PBS，配制方法为：将NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·H₂O 1.56g，KH₂PO₄ 0.2g倒入盛有800ml双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，调节PH至7.4，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液)清洗细胞两次。用吸管吸干PBS后，每孔加入100μl 1×PLB(Passive Lysis Buffer，4体积的ddH₂O加入1体积的PLB原液)。室温下置于摇床温和摇动20min。将细胞裂解液加入灭过菌的1.5mL离心管中，用于测定双荧光素酶活性。 

双荧光素酶活性测定采用Promega公司的Dual- 

Reporter Assay System进行分析(具体操作参考Dual- 

Reporter Assay and Dual- 

Reporter 1000 Assay Systems)。转染结果发现含有AA基因型的重组质粒活性是含有CC型重组质粒的30多倍(见图6)。 

Claims (1)

1.猪MLC2基因5’侧翼启动子片段在猪屠宰率、胴体体重分子标记检测中的应用，其特征在于所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，在所述的SEQ ID NO:1的53bp处存在一个C/A突变，在SEQ ID NO:2的53bp处存在一个A/C突变，导致HinfI酶切位点的改变，引起HinfI-RFLP多态性。

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