CN104561327B - 一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法，属于食品检测技术领域。本发明的方法采用SEQ ID NO.1‑6所述的引物对待测样品进行荧光定量PCR检测，根据Ct值判断食品中是否含有马和驴源性成分。本发明检测方法可实现一个反应同时对马和驴两种动物源性成分进行快速鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，最低检测限为100fg，能满足大批量、快速鉴别检测马和驴源性成分的要求，并能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度，具有较好的社会效益。

Description

一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体地说涉及检测食品中马和驴源性成分的双重荧光PCR检测方法。
背景技术
近年来，动物源性食品在人们日常膳食中的比例逐步增大，各种冷鲜肉、精深加工的半成品肉、熟肉制品等消费比例逐年上升。但不同物种的肉品质和价格存在很大差异，给掺杂掺假创造了极大的利润空间。为了谋取经济利益，有些不法企业和商贩在肉制品中使用低成本肉代替高价位肉的现象时有发生。这不仅严重侵害了消费者的健康和权益，还会涉及宗教信仰，导致民族问题，同时直接影响到国家的形象，社会的和谐发展以及政府的公信力。因此，研究出一种准确、快速、可靠地鉴别动物源性成分的方法，就非常有必要。
随着分子生物学方法在食品检验中的应用不断深入，食品中动物源性成分的鉴别技术也在不断发展，鉴别精度和检测灵敏度的不断提高，目前已初步形成了以基因检测为基础的方法体系。以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已成为食品中动物源性成分鉴定的核心方法。物种特异性PCR根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现动物源性成分特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别可能的物种成分。多重PCR能够实现混合物中多个物种同时检测。近年来，实时荧光PCR技术是动物源性成分检测中研究最多的方法，与普通PCR相比，具有特异性强、灵敏度高、重现性好、有效降低污染等优点。
哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)在遗传上相对独立，具有基因组小、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、DNA降解小等优势。基于动物线粒体DNA的荧光PCR检测技术在动物源性成分鉴别中具有广阔的应用前景。
目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，然而，针对马和驴动物源性成分同时检测的双重荧光PCR方法尚未见报导。因此，建立动物源性产品中马、驴源性成分双重实时荧光PCR检测方法，对提高突发事件应急处理能力，提升食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法。
本发明首先提供用于检测、马和驴源性成分的引物对以及荧光探针，其中用于检测马源性成分的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示，探针序列如SEQ ID NO.5所示；用于检测驴源性成分的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示，探针序列如SEQ IDNO.6所示，两条探针分别标记不同的荧光素。
在本发明的实施例中，SEQ ID NO.5所示的探针以FAM荧光素标记，SEQ ID NO.6所示的探针以VIC荧光素标记。
本发明提供了上述引物对和荧光探针在检测马和驴源性成分中的应用。
本发明提供了上述引物对和荧光探针在制备检测马和驴源性成分试剂盒中的应用。
含有本发明引物对和荧光探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于荧光定量PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具，例如DNA裂解液、荧光定量反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为马基因组DNA和驴基因组DNA。
进一步地，本发明的试剂盒其20μL工作体系为：
本发明试剂盒的工作程序为：预变性95℃10min；再经95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
有FAM和VIC荧光同时被检出，且Ct值均<35.0时，判定为阳性，表明从样品中同时检出马和驴源性成分；
有FAM荧光被检出，且Ct值<35.0，但无VIC荧光，判定为阳性，表明从样品中检出马源性成分；
有VIC荧光被检出，且Ct值<35.0，但无FAM荧光，判定为阳性，表明从样品中检出驴源性成分；
无FAM和VIC荧光被检出，Ct值≥35.0，判定为为阴性。
本发明提供了一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法，该方法以蛋白酶K消化法提取的肉制品DNA为模板，利用SEQ ID NO.1-4所述的引物和SEQ ID NO.5-6所述的荧光探针进行双重荧光定量PCR扩增，根据Ct值判定结果。
本发明方法中，双重荧光定量PCR的条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为食品中马和驴源性成分的检测提供了新的方法。本发明所述的荧光RCR技术可以准确快速的实现对食品中马和驴源性成分的鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，不仅能为检测马和驴源性食品提供新的方法，而且能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测马源成分特异性检测结果。
图2为本发明试剂盒检测驴源成分特异性检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1引物的设计
经大量比对GenBank中COX 1基因，选取COX 1基因高度保守且具有物种特异性基因序列为模板，设计马COX 1/驴COX 1特异性引物对和Taqman MGB探针，分别命名为马COX1-F(P1)、马COX 1-R(P2)、驴COX 1-F(P3)、驴COX 1-R(P4)、马COX 1-FAM-MGB-Probe(Probe-P5)、驴COX 1-VIC-MGB-Probe(Probe-P6)，用于双重Taqman MGB实时荧光PCR扩增的引物和探针序列如下：
P1：5`-AACCCCCCTATTCGTTTGATCT-3`
P2：5`-ACGGTCTGTGAGAAGCATGGT-3`
P3：5`-AGCCTCCTAATCCGTGCTGAA-3`
P4：5`-ATGCATGGGCAGTTACAATAACA-3`
P5：5`-FAM-AGCCCTCCCGGTCC-MGB-3`
P6：5`-VIC-ACCCTGCTGGGAGAT-MGB-3`
实施例2荧光定量PCR检测方法的建立
1、提取样品DNA
(1)取马肉或驴肉样本各0.2g，尽量剪碎。置于1.5ml离心管中加入1ml的细胞裂解缓冲液，20μl蛋白酶K(500μg/ml)，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12,000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
(2)加入等体积的苯酚:氯仿混合液(1:1)，振荡混匀，12,000rpm离心10min。
(3)取上清液至另一管，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12,000rpm离心10min。
(4)取上清液至另一管，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀10min，12,000rpm离心10min。
(5)弃上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min。
(6)重复步骤5。
(7)弃上清，将沉淀至室温干燥5min。
(8)加50μl TE或dd H2O溶解沉淀，然后置于4℃或-20℃保存备用。
2、采用实施例1的2对引物和2条探针，以上述DNA为模板，以马基因组DNA和驴基因组DNA为阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，建立荧光定量PCR检测体系。
其20μL总工作体系为：
其工作程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。
每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
有FAM和VIC荧光同时被检出，且Ct值均<35.0时，判定为阳性，表明从样品中同时检出马和驴源性成分；
有FAM荧光被检出，且Ct值<35.0，但无VIC荧光，判定为阳性，表明从样品中检出马源性成分；
有VIC荧光被检出，且Ct值<35.0，但无FAM荧光，判定为阳性，表明从样品中检出驴源性成分；
无FAM和VIC荧光被检出，Ct值≥35.0，判定为为阴性；
实施例3特异性试验
为验证本试剂盒的特异性，以马、驴基因组DNA为阳性对照，以猪，牛，绵羊，山羊，鸡，鸭，鸽子，鹌鹑，火鸡，鸵鸟，灰雁，猫，小鼠，家犬，兔子，狍子，狐狸，水貂，骆驼，鹿，三文鱼，虹鳟鱼，鲈鱼，鲫鱼，草鱼。共25个物种为检测对象，以dd H2O为空白对照，采用实施例2建立荧光定量PCR检测体系对上述26个物种进行检测。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。实验结果见图1，图2。
扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。实验结果：马的Ct值为18，驴的Ct值为17，其余25个物种的CT值均大于35。该实验证明本试剂盒具有良好的物种特异性。
实施例4灵敏度试验
为验证本试剂盒的灵敏度，分别将马、驴基因组DNA梯度稀释为：1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl的稀释液，并以这些稀释液作为阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，利用实施例2建立的荧光定量PCR方法，验证本发明方法的灵敏度。
扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct值。每个稀释梯度设10个平行样本，实验结果为10个样本Ct值的平均值。实验结果见表1。结果显示本发明的荧光定量PCR方法可检测到约100fg的马驴源性成分，可检测到低于100fg的驴源性成分。说明本发明方法具有良好的灵敏度。
表1本发明方法对马源成分的灵敏度检测结果
表2本发明方法对驴源成分的灵敏度检测结果
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.同时检测马和驴源性成分的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQID NO.1-4所示。
2.与权利要求1所述的引物对配合使用的荧光探针，其特征在于，荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，两条探针以不同的荧光素标记。
3.权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针在检测马和驴源性成分中的应用。
4.权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针在制备检测马和驴源性成分试剂盒中的应用。
5.一种同时检测马和驴源性成分的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：DNA裂解液、荧光定量反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为马基因组DNA和驴基因组DNA。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其20μL PCR反应体系为：
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
9.一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法，其特征在于，以蛋白酶K消化法提取的食品中DNA，以其为模板，利用权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的荧光探针进行双重荧光定量PCR扩增，根据Ct值判定结果。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，双重荧光定量PCR的条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。
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