CN101935653A - 一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。本发明提供了序列表的序列1和2所示DNA组成的引物对。本发明的方法包括如下步骤：以基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增只有一种产物，且如序列3所示，待测鸡为候选的绿壳基因纯合子；如果PCR扩增有两种产物，分别如序列3和4所示，待测鸡为候选的绿壳基因杂合子；如果PCR扩增只有一种产物，且如序列4所示，待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。本发明在绿壳基因的定位区域内找到与绿壳性状显著关联的13bp缺失标记，不论是公鸡还是母鸡均可在当代的雏鸡中进行选择。本发明可以弥补常规育种方法的不足，缩短育种周期，提高育种的准确性。

Description

一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。

背景技术

禽蛋的蛋壳颜色按主要色系可分为三种类型，白壳、褐壳和绿壳(Lang，M.R.，and J.W.Wells.1987.A review of eggshell pigmentation.World’s Poult.Sci.J.43：238-245.)。绿壳蛋以其独特的蛋壳颜色，一直以来都吸引着国内外研究者的目光。国外研究比较多的是智利的安克纳(Araucano)绿壳蛋鸡。在我国，产绿壳蛋的品种有四川旧院鸡、河南卢氏鸡、湖北江汉鸡及江西东乡绿壳蛋鸡。在这些品种中，研究最多的是东乡绿壳蛋鸡。

Punnett(1933)发现绿壳性状是由显性单基因控制的质量性状(Punnett RC.Genetic studies in poultry：IX.The blue egg.J Genet，1933，27：465～470.)，显性纯合子和杂合子均表现出绿壳特性。这意味着对于绿壳个体，无法根据表型来判断其基因型是否纯合，也就无法彻底从群体中淘汰隐性(非绿壳)基因。绿壳蛋鸡生产中存在的一个关键问题是绿壳性状很难提纯，后代经常会出现褐壳个体。

绿壳鸡蛋在市场上非常受消费者欢迎，不仅在我国，日本的绿壳鸡蛋价格也远高于其他鸡蛋。现在，绿壳蛋鸡饲养量在逐步加大，江西、上海、湖北、河南、北京等地是绿壳蛋鸡主要饲养地。目前，绿壳蛋鸡品种选育和商品化生产面临着一些技术难题，主要问题是蛋壳颜色的保持和产蛋数量的提高。蛋壳颜色方面，由于绿壳性状由显性基因控制，隐性基因不易淘汰，使得绿壳蛋鸡群体中总是出现一些产褐壳蛋的个体，群体的纯度难以提高；产蛋数量方面，由于绿壳基因还没有被克隆，绿壳蛋鸡的杂交利用受到限制，杂交以后易出现绿壳基因的分离。在实际生产中，因蛋壳颜色属限性性状，只能在母鸡产蛋后表现。所以，利用常规育种手段，选育绿壳群体至少要等24周后个体开产才能进行，而对公鸡的选择也只能通过后裔测定来完成，选择的周期长，进展缓慢。此外，要想在绿壳群体中彻底淘汰隐性基因，需要通过测交的方法检出杂合个体。当对某一待测个体进行测交时，需观测到5个以上的后代均产绿壳时，才有95％的把握认定待测个体基因型为显性纯合。这样需要进行大量的测交，不仅延长选育的周期，还造成很高的财力、人力负担。

尽管，对绿壳基因的定位工作已经开展了有30多年，但目前该基因尚未被准确定位。早在上世纪30年代Bruckner和Zartman就注意到绿壳(O)和豆冠(P)存在连锁关系(Bruckner，J.H.，and F.B.Hutt，1939.Linkage of pea comb and blue egg in the fowl.Science 90：88.)。在1973年Zartman利用两个转座子标记将豆冠基因定位于1号染色体短臂上，从而证明绿壳基因也位于鸡1号染色体上(Zartman DL.Location of the pea comb gene.Poult Sci.，1973，52(4)：1455-62.)。Bitgood 等(1980，1983，1985，2000)通过回交设计，首次将绿壳基因定位于鸡1号染色体短臂，并得出绿壳和豆冠间的遗传距离是3.1-4.23cM(Bitgood JJ，Shoffner RN，Otis JS，Briles WE.Mapping of the genes for pea comb，blue egg，barring，silver，and blood groups A，E，H，and P in the domestic fowl.Poult Sci.，1980，59(8)：1686-93.；Bitgood JJ，Otis JS，Shoffner RN.Refined Linkage Value for Comb and Blue Egg：Lack of Effect of Pea Comb，Blue Egg，and Naked on Aage at First egg in the Domestic Fowl.Poult Sci.，1983，62：235-238.；Bitgood J.J.Locating pea comb and blue egg in relation to the centromere of chromosome 1 in the chicken.Poult Sci.，1985，64：1411～1414.；Bitgood JJ，Briles RW，Briles WE.Further tests for genetic linkages of three morphological traits，three blood groups，and break points of two chromosome translocations on chromosome one in the chicken.Poult Sci.2000，79(3)：293-5.)。Bartlett等(1996)利用鸡的内源病毒ev1对绿壳基因进行了定位，结果是O和P间的距离是4.1cM(Bartlett，J.R.，C.P.Jones，and E.J.Smith.1996.Linkage analysis of endogenous viral element1，blue eggshell，and pea comb loci in chickens.J.Hered.1996，87：67-70.)。这项工作较Bitgood改进之处在于Bartlett所用的ev1标记，在染色体上插入位点已知(Chrlp：68，099，410bp-68，099，950bp)。王晓通(2008)利用1个SNP标记和3个微卫星标记，将绿壳基因定位到Chrlp：67，296，991bp-69，140，571bp之间1.8Mb的区段内(王晓通.鸡绿壳蛋色素形成的生理学与遗传学分析.中国农业大学博士论文，2008，6)。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。

本发明提供的专用引物对是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

本发明还保护所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子(OO)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(oo)中的应用。

本发明提供的辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子(OO)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(oo)的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)根据PCR产物辅助鉴定：如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列3所示，待测鸡为候选的绿壳基因纯合子；如果PCR扩增产物有两种，分别如序列表的序列3和序列4所示，则待测鸡为候选的绿壳基因杂合子；如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列4所示，则待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。

所述待测鸡具体可为东乡绿壳蛋鸡。

步骤(3)中，具体可通过SSCP电泳检测所述PCR产物。

目前有多种SNP分型方法，如SNP芯片、时间飞行质谱、直接测序、焦磷酸测序、SNPlex、taqman探针法等；这些方法虽然通量高、准确性好，但也存在费用昂贵、对仪器试剂要求高的缺点；在很大程度上限制了这些技术的推广普及。在传统的SNP分型方法中，应运最普遍的是SSCP法(single strand conformation polymorphism)和RFLP法(restriction fragment length polymorphism)。这两种方法虽然在通量上无法与上述方法相比，但具有操作简便、廉价、对仪器试剂要求低，易普及推广的优点。SSCP是基于DNA构象检测PCR产物单链碱基微小差异的方法，因其检测敏感、快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用；但该方法的试验结果受多种因素的影响，如试验操作的技巧、环境温度、PCR产物浓度、PCR扩增位点碱基构成、电压、PAGE胶的浓度和交联度等，因而重复性比较差。SSCP操作时必须经过变性的步骤，对于一些高GC位点，因为退火温度较高，一般很难维持单链状态，这样的位点不适合用此项技术来分型。本发明提供的标记的本质是13bp缺失，多碱基缺失远比单碱基的转换或颠换对单链构像的影响大，所以更适合用SSCP技术检测标记的基因型。

所述的引物对可用于制备辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒，包括所述的引物对。

所述引物对，所述方法或所述试剂盒均可用于绿壳蛋鸡育种。如需对绿壳蛋鸡进行杂交以提高产蛋数，而同时要求保留绿壳特性，该标记可用以对绿壳位点的变化进行跟踪，从而在杂交后代中保持绿壳性状。

本发明还保护一种绿壳蛋鸡育种方法，是采用绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子进行育种；所述绿壳基因纯合子是所述方法鉴定的。

本发明可以弥补常规育种方法的不足，缩短育种周期，提高育种的准确性。本发明的优点：(1)建立在绿壳基因精细定位的基础之上，在定位区域内找到13bp缺失标记，该标记与绿壳性状显著关联，根据标记基因型推断个体为绿壳的准确性大于93％，依据标记基因型推断绿壳基因型的准确性可达92.16％；(2)不受性别限制；(3)绿壳蛋鸡开产时间通常为21-24周，本发明在个体雏鸡阶段即可推断出个体表型及基因型，可以早选择早淘汰，可缩短育种时间，加快育种进程，节省饲养成本。

附图说明

图1为SSCP检测结果及对应基因型测序结果；测序结果中，方框内为13bp缺失序列，箭头标出了缺失位置。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Gene Amp PCR System 9700：PERKIN ELMER公司，USA。凝胶成像系统：Alpha Innotech公司。

实施例1、13bp缺失多态的发现及引物对的设计

东乡绿壳蛋鸡是我国著名的绿壳蛋鸡品种，因绿壳基因(O)为显性基因，所以群体中仍存在部分携带隐性基因(o)的杂合子。绿壳基因纯合子之间产生的后代，产蛋性状不发生分离，都产绿壳蛋。绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子之间会产生约1∶1的绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子，从而使非绿壳基因传代下去。绿壳基因杂合子之间产生的后代，会出现产褐壳蛋的个体(非绿壳基因纯合子)，造成纯种不纯的尴尬局面。即东乡绿壳蛋鸡中，根据绿壳基因(O)可分为三种基因型：绿壳基因纯合子(OO)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(oo)；其中绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子产绿壳蛋，为东乡绿壳群体；非绿壳基因纯合子产褐壳蛋，为东乡褐壳群体。

一、13bp缺失多态的发现

在测序时发现一个与绿壳性状显著关联的SNP标记。与东乡绿壳群体相比，东乡褐壳群体存在13bp的缺失(Chrlp：67，419，892bp-67，419，904bp)。将该标记命名为13bp缺失。

二、引物对的设计

基于该13bp缺失的上下游序列，设计特异引物对如下(5’-3’)：

F：ATCTATAAAGGAGCAAGG(序列表的序列1)；

R：ATGAGGGTAAGAGGACAC(序列表的序列2)。

目的片段长度342bp。如果仅得到342bp的PCR产物，样本为候选的绿壳基因纯合予；如果仅得到329bp的PCR产物，样本为候选的非绿壳基因纯合子；如果同时得到342bp和329bp的PCR产物，样本为候选的绿壳基因杂合子。

实施例2、应用引物对辅助鉴定东乡绿壳蛋鸡

289只东乡绿壳蛋鸡：购自江西省东乡县华绿种禽养殖场。将每只东乡绿壳蛋鸡分别与白来航鸡杂交：如果子一代都产绿壳蛋，该东乡绿壳蛋鸡为绿壳基因纯合子；如果子一代既有产绿壳蛋的个体又有产褐壳蛋的个体，该东乡绿壳蛋鸡为绿壳基因杂合子；如果子一代都产褐壳蛋，该东乡绿壳蛋鸡为非绿壳基因纯合子。289只东乡绿壳蛋鸡中，104只为非绿壳基因纯合子，150只为绿壳基因纯合子，35只为绿壳基因杂合子。

1、提取基因组DNA

各个样本翅静脉采血，提取高盐法提取基因组DNA。

具体过程如下：

(1)配置溶液

溶液A：100mM Tris-Cl(pH7.5)，100mM EDTA，100mM NaCl，0.5％SDS，室温保存。溶液B：取200ml 5M乙酸钾溶液和500ml 6M氯化锂溶液，充分混匀，4℃保存。

(2)取50-100μl鸡血，加500-550μl溶液A，充分混匀；

(3)65℃恒温水浴2-4小时；

(4)加溶液B 850μl，充分混匀后冰浴15-30分钟；

(5)12000rpm常温离心15分钟；

(6)吸上清600-800μl(如有必要再次12000rpm常温离心15分钟，吸上清)；

(7)加氯仿600μl，充分混合2-3分钟；

(8)12000rpm离心10分钟；

(9)吸取上清约600μl，加异丙醇600μl，充分混合2-3分钟；

(10)12000rpm常温离心10分钟；

(11)去上清，加1ml 70％的酒精洗涤沉淀；

(12)12000rpm常温离心3-5分钟；

(13)去上清，真空离心抽风10分钟；

(14)加TE 200-400μl，55℃水浴10小时；

(15)0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，电压140-150伏，电泳30分钟；

(16)-20℃保存(基因组DNA)。

2、以基因组DNA为模板，用实施例1设计的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系(25μl)：2.5μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，15mmol/L MgCl₂，0.01％明胶)，2μl dNTPs(ATP、TTP、GTP、CTP的浓度均为2.5mmol/L)，两条引物的终浓度均为20μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，50-100ng模板。PCR反应条件：94℃ 5min；然后94℃ 30S，57℃ 30S，72℃ 40S，36个循环；最后72℃ 7min。

3、将PCR扩增产物进行电泳和基因分型

以30％非变性聚丙烯酰胺贮液(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝29∶1)制作1mm厚凝胶为例，具体过程如下：

(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干，用75％乙醇擦拭玻璃板，自然晾干，装板灌胶。

(2)配置12％非变性丙烯酰胺凝胶。

每35ml 12％非变性丙烯酰胺胶：14ml 30％丙烯酰胺，3.5ml 50％甘油，7ml 5×TBE，10.2ml dH₂O，280μl 10％过硫酸铵，20μl TEMED。

(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合1小时，多余的丙烯酰胺4℃保存，随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。

(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。

(5)预电泳10分钟，同时准备点样。

(6)取2ul步骤2的PCR扩增产物置于PCR管中，加8ul变性Buffer，离心混匀，98℃变性10分钟，迅速冰浴10分钟，用微量移液器点样。变性Bufffer：由98体积份的去离子甲酰胺和2体积份的0.5M pH＝8.0EDTA溶液组成。

(7)打开电源，250伏电泳10分钟，将电压调至150伏，电泳18小时。

(8)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心剥下凝胶，置染色液中染色30min。染色液：由硝酸银和ddH₂O组成，硝酸银浓度为0.2％。

(9)染色结束，回收AgNO₃，去离子水洗胶3遍，每次2分钟，洗去多余染色液。

(10)显色液显色，视单链清晰，背景淡黄(时间约10-20min)，立即倒掉显色液，用10％乙酸终止显色反应。显色液为10％(体积百分含量)乙酸水溶液。

(11)照相、保存。

(12)根据染色结果进行基因分型。

将未发生缺失的等位基因定义为A，缺失的等位基因定义为a。AA基因型个体、Aa基因型个体和aa基因型个体的电泳图见图1。绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中，各种基因型的频率见表1。

表113bp缺失标记在绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中的频率

*注：A-正常，a-13bp缺失。

在基因型为AA型时，有大约93％【(4+6)/131*100％＝7％】的把握可以确保该个体为绿壳基因纯合子，基因型为aa时有约98％(2/95*100％＝2％)的把握可以确保个体为非绿壳基因纯合子(褐壳)。因此可以在东乡绿壳蛋鸡中进行13bpdel标记基因型检测，淘汰aa型和Aa型个体，使得绿壳基因纯合子的比例快速提高。

4、PCR扩增产物的测序和基因型验证

将步骤2的PCR扩增产物分别进行测序。测序结果表明：AA基因型个体的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列3所示；aa基因型个体的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列4所示；Aa基因型个体的PCR扩增产物为序列3和序列4所示DNA的混合物。序列4所示DNA与序列3所示DNA相比，差别仅在于缺失了13bp的核苷酸。缺失的13bp为序列表的序列3自5’末端第221-233位核苷酸。

AA基因型和aa基因型的PCR扩增产物的部分测序结果见图1。

实施例3、应用引物对辅助鉴定绿壳基因(O)

鉴于13bp缺失与绿壳性状显著关联，并且该标记落在绿壳基因精细定位的标记区间，推测该标记(A)很可能与绿壳基因(O)有关或存在紧密连锁关系。通过用东乡绿壳公鸡(OOAA)与东乡褐壳母鸡(ooaa)杂交，F₁自交，得到了一个由152个F₂个体组成的分离群体。在分离群体中检测13bpdel标记与绿壳基因的连锁情况，结果显示该标记与绿壳基因(O)存在紧密连锁，重组率为0.04(LOD＝9.53)。由此可知，A与0位于一个单倍型上的概率为96％(1-4％)。因此，当以标记基因型推断绿壳基因型时，准确性可达92.16％(96％*96％)。

Claims (9)

1.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。

2.权利要求1所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中的应用。

3.辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)根据PCR产物辅助鉴定：如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列3所示，待测鸡为候选的绿壳基因纯合子；如果PCR扩增产物有两种，分别如序列表的序列3和序列4所示，则待测鸡为候选的绿壳基因杂合子；如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列4所示，则待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述待测鸡为东乡绿壳蛋鸡。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，通过SSCP电泳检测所述PCR产物。

6.权利要求1所述的引物对在制备辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒中的应用。

7.一种辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒，包括权利要求1所述的引物对。

8.权利要求1所述引物对，权利要求3至5中任一所述方法或权利要求7所述试剂盒在绿壳蛋鸡育种中的应用。

9.一种绿壳蛋鸡育种方法，是采用绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子进行育种；所述绿壳基因纯合子是通过权利要求3至5中任一所述方法鉴定得到的。

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