CN101935653A - 一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。本发明提供了序列表的序列1和2所示DNA组成的引物对。本发明的方法包括如下步骤:以基因组DNA为模板,用所述引物对进行PCR扩增;如果PCR扩增只有一种产物,且如序列3所示,待测鸡为候选的绿壳基因纯合子;如果PCR扩增有两种产物,分别如序列3和4所示,待测鸡为候选的绿壳基因杂合子;如果PCR扩增只有一种产物,且如序列4所示,待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。本发明在绿壳基因的定位区域内找到与绿壳性状显著关联的13bp缺失标记,不论是公鸡还是母鸡均可在当代的雏鸡中进行选择。本发明可以弥补常规育种方法的不足,缩短育种周期,提高育种的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。
背景技术
禽蛋的蛋壳颜色按主要色系可分为三种类型,白壳、褐壳和绿壳(Lang,M.R.,and J.W.Wells.1987.A review of eggshell pigmentation.World’s Poult.Sci.J.43:238-245.)。绿壳蛋以其独特的蛋壳颜色,一直以来都吸引着国内外研究者的目光。国外研究比较多的是智利的安克纳(Araucano)绿壳蛋鸡。在我国,产绿壳蛋的品种有四川旧院鸡、河南卢氏鸡、湖北江汉鸡及江西东乡绿壳蛋鸡。在这些品种中,研究最多的是东乡绿壳蛋鸡。
Punnett(1933)发现绿壳性状是由显性单基因控制的质量性状(Punnett RC.Genetic studies in poultry:IX.The blue egg.J Genet,1933,27:465~470.),显性纯合子和杂合子均表现出绿壳特性。这意味着对于绿壳个体,无法根据表型来判断其基因型是否纯合,也就无法彻底从群体中淘汰隐性(非绿壳)基因。绿壳蛋鸡生产中存在的一个关键问题是绿壳性状很难提纯,后代经常会出现褐壳个体。
绿壳鸡蛋在市场上非常受消费者欢迎,不仅在我国,日本的绿壳鸡蛋价格也远高于其他鸡蛋。现在,绿壳蛋鸡饲养量在逐步加大,江西、上海、湖北、河南、北京等地是绿壳蛋鸡主要饲养地。目前,绿壳蛋鸡品种选育和商品化生产面临着一些技术难题,主要问题是蛋壳颜色的保持和产蛋数量的提高。蛋壳颜色方面,由于绿壳性状由显性基因控制,隐性基因不易淘汰,使得绿壳蛋鸡群体中总是出现一些产褐壳蛋的个体,群体的纯度难以提高;产蛋数量方面,由于绿壳基因还没有被克隆,绿壳蛋鸡的杂交利用受到限制,杂交以后易出现绿壳基因的分离。在实际生产中,因蛋壳颜色属限性性状,只能在母鸡产蛋后表现。所以,利用常规育种手段,选育绿壳群体至少要等24周后个体开产才能进行,而对公鸡的选择也只能通过后裔测定来完成,选择的周期长,进展缓慢。此外,要想在绿壳群体中彻底淘汰隐性基因,需要通过测交的方法检出杂合个体。当对某一待测个体进行测交时,需观测到5个以上的后代均产绿壳时,才有95%的把握认定待测个体基因型为显性纯合。这样需要进行大量的测交,不仅延长选育的周期,还造成很高的财力、人力负担。
尽管,对绿壳基因的定位工作已经开展了有30多年,但目前该基因尚未被准确定位。早在上世纪30年代Bruckner和Zartman就注意到绿壳(O)和豆冠(P)存在连锁关系(Bruckner,J.H.,and F.B.Hutt,1939.Linkage of pea comb and blue egg in the fowl.Science 90:88.)。在1973年Zartman利用两个转座子标记将豆冠基因定位于1号染色体短臂上,从而证明绿壳基因也位于鸡1号染色体上(Zartman DL.Location of the pea comb gene.Poult Sci.,1973,52(4):1455-62.)。Bitgood 等(1980,1983,1985,2000)通过回交设计,首次将绿壳基因定位于鸡1号染色体短臂,并得出绿壳和豆冠间的遗传距离是3.1-4.23cM(Bitgood JJ,Shoffner RN,Otis JS,Briles WE.Mapping of the genes for pea comb,blue egg,barring,silver,and blood groups A,E,H,and P in the domestic fowl.Poult Sci.,1980,59(8):1686-93.;Bitgood JJ,Otis JS,Shoffner RN.Refined Linkage Value for Comb and Blue Egg:Lack of Effect of Pea Comb,Blue Egg,and Naked on Aage at First egg in the Domestic Fowl.Poult Sci.,1983,62:235-238.;Bitgood J.J.Locating pea comb and blue egg in relation to the centromere of chromosome 1 in the chicken.Poult Sci.,1985,64:1411~1414.;Bitgood JJ,Briles RW,Briles WE.Further tests for genetic linkages of three morphological traits,three blood groups,and break points of two chromosome translocations on chromosome one in the chicken.Poult Sci.2000,79(3):293-5.)。Bartlett等(1996)利用鸡的内源病毒ev1对绿壳基因进行了定位,结果是O和P间的距离是4.1cM(Bartlett,J.R.,C.P.Jones,and E.J.Smith.1996.Linkage analysis of endogenous viral element1,blue eggshell,and pea comb loci in chickens.J.Hered.1996,87:67-70.)。这项工作较Bitgood改进之处在于Bartlett所用的ev1标记,在染色体上插入位点已知(Chrlp:68,099,410bp-68,099,950bp)。王晓通(2008)利用1个SNP标记和3个微卫星标记,将绿壳基因定位到Chrlp:67,296,991bp-69,140,571bp之间1.8Mb的区段内(王晓通.鸡绿壳蛋色素形成的生理学与遗传学分析.中国农业大学博士论文,2008,6)。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。
本发明提供的专用引物对是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。
本发明还保护所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子(OO)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(oo)中的应用。
本发明提供的辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子(OO)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(oo)的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测鸡的基因组DNA;
(2)以基因组DNA为模板,用所述引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
(3)根据PCR产物辅助鉴定:如果PCR扩增产物只有一种,且如序列表的序列3所示,待测鸡为候选的绿壳基因纯合子;如果PCR扩增产物有两种,分别如序列表的序列3和序列4所示,则待测鸡为候选的绿壳基因杂合子;如果PCR扩增产物只有一种,且如序列表的序列4所示,则待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。
所述待测鸡具体可为东乡绿壳蛋鸡。
步骤(3)中,具体可通过SSCP电泳检测所述PCR产物。
目前有多种SNP分型方法,如SNP芯片、时间飞行质谱、直接测序、焦磷酸测序、SNPlex、taqman探针法等;这些方法虽然通量高、准确性好,但也存在费用昂贵、对仪器试剂要求高的缺点;在很大程度上限制了这些技术的推广普及。在传统的SNP分型方法中,应运最普遍的是SSCP法(single strand conformation polymorphism)和RFLP法(restriction fragment length polymorphism)。这两种方法虽然在通量上无法与上述方法相比,但具有操作简便、廉价、对仪器试剂要求低,易普及推广的优点。SSCP是基于DNA构象检测PCR产物单链碱基微小差异的方法,因其检测敏感、快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用;但该方法的试验结果受多种因素的影响,如试验操作的技巧、环境温度、PCR产物浓度、PCR扩增位点碱基构成、电压、PAGE胶的浓度和交联度等,因而重复性比较差。SSCP操作时必须经过变性的步骤,对于一些高GC位点,因为退火温度较高,一般很难维持单链状态,这样的位点不适合用此项技术来分型。本发明提供的标记的本质是13bp缺失,多碱基缺失远比单碱基的转换或颠换对单链构像的影响大,所以更适合用SSCP技术检测标记的基因型。
所述的引物对可用于制备辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒。
本发明还保护一种辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒,包括所述的引物对。
所述引物对,所述方法或所述试剂盒均可用于绿壳蛋鸡育种。如需对绿壳蛋鸡进行杂交以提高产蛋数,而同时要求保留绿壳特性,该标记可用以对绿壳位点的变化进行跟踪,从而在杂交后代中保持绿壳性状。
本发明还保护一种绿壳蛋鸡育种方法,是采用绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子进行育种;所述绿壳基因纯合子是所述方法鉴定的。
本发明可以弥补常规育种方法的不足,缩短育种周期,提高育种的准确性。本发明的优点:(1)建立在绿壳基因精细定位的基础之上,在定位区域内找到13bp缺失标记,该标记与绿壳性状显著关联,根据标记基因型推断个体为绿壳的准确性大于93%,依据标记基因型推断绿壳基因型的准确性可达92.16%;(2)不受性别限制;(3)绿壳蛋鸡开产时间通常为21-24周,本发明在个体雏鸡阶段即可推断出个体表型及基因型,可以早选择早淘汰,可缩短育种时间,加快育种进程,节省饲养成本。
附图说明
图1为SSCP检测结果及对应基因型测序结果;测序结果中,方框内为13bp缺失序列,箭头标出了缺失位置。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。Gene Amp PCR System 9700:PERKIN ELMER公司,USA。凝胶成像系统:Alpha Innotech公司。
实施例1、13bp缺失多态的发现及引物对的设计
东乡绿壳蛋鸡是我国著名的绿壳蛋鸡品种,因绿壳基因(O)为显性基因,所以群体中仍存在部分携带隐性基因(o)的杂合子。绿壳基因纯合子之间产生的后代,产蛋性状不发生分离,都产绿壳蛋。绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子之间会产生约1∶1的绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子,从而使非绿壳基因传代下去。绿壳基因杂合子之间产生的后代,会出现产褐壳蛋的个体(非绿壳基因纯合子),造成纯种不纯的尴尬局面。即东乡绿壳蛋鸡中,根据绿壳基因(O)可分为三种基因型:绿壳基因纯合子(OO)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(oo);其中绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子产绿壳蛋,为东乡绿壳群体;非绿壳基因纯合子产褐壳蛋,为东乡褐壳群体。
一、13bp缺失多态的发现
在测序时发现一个与绿壳性状显著关联的SNP标记。与东乡绿壳群体相比,东乡褐壳群体存在13bp的缺失(Chrlp:67,419,892bp-67,419,904bp)。将该标记命名为13bp缺失。
二、引物对的设计
基于该13bp缺失的上下游序列,设计特异引物对如下(5’-3’):
F:ATCTATAAAGGAGCAAGG(序列表的序列1);
R:ATGAGGGTAAGAGGACAC(序列表的序列2)。
目的片段长度342bp。如果仅得到342bp的PCR产物,样本为候选的绿壳基因纯合予;如果仅得到329bp的PCR产物,样本为候选的非绿壳基因纯合子;如果同时得到342bp和329bp的PCR产物,样本为候选的绿壳基因杂合子。
实施例2、应用引物对辅助鉴定东乡绿壳蛋鸡
289只东乡绿壳蛋鸡:购自江西省东乡县华绿种禽养殖场。将每只东乡绿壳蛋鸡分别与白来航鸡杂交:如果子一代都产绿壳蛋,该东乡绿壳蛋鸡为绿壳基因纯合子;如果子一代既有产绿壳蛋的个体又有产褐壳蛋的个体,该东乡绿壳蛋鸡为绿壳基因杂合子;如果子一代都产褐壳蛋,该东乡绿壳蛋鸡为非绿壳基因纯合子。289只东乡绿壳蛋鸡中,104只为非绿壳基因纯合子,150只为绿壳基因纯合子,35只为绿壳基因杂合子。
1、提取基因组DNA
各个样本翅静脉采血,提取高盐法提取基因组DNA。
具体过程如下:
(1)配置溶液
溶液A:100mM Tris-Cl(pH7.5),100mM EDTA,100mM NaCl,0.5%SDS,室温保存。溶液B:取200ml 5M乙酸钾溶液和500ml 6M氯化锂溶液,充分混匀,4℃保存。
(2)取50-100μl鸡血,加500-550μl溶液A,充分混匀;
(3)65℃恒温水浴2-4小时;
(4)加溶液B 850μl,充分混匀后冰浴15-30分钟;
(5)12000rpm常温离心15分钟;
(6)吸上清600-800μl(如有必要再次12000rpm常温离心15分钟,吸上清);
(7)加氯仿600μl,充分混合2-3分钟;
(8)12000rpm离心10分钟;
(9)吸取上清约600μl,加异丙醇600μl,充分混合2-3分钟;
(10)12000rpm常温离心10分钟;
(11)去上清,加1ml 70%的酒精洗涤沉淀;
(12)12000rpm常温离心3-5分钟;
(13)去上清,真空离心抽风10分钟;
(14)加TE 200-400μl,55℃水浴10小时;
(15)0.7%琼脂糖凝胶电泳检测,电压140-150伏,电泳30分钟;
(16)-20℃保存(基因组DNA)。
2、以基因组DNA为模板,用实施例1设计的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。PCR反应体系(25μl):2.5μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl,100mmol/L Tris·Cl,15mmol/L MgCl2,0.01%明胶),2μl dNTPs(ATP、TTP、GTP、CTP的浓度均为2.5mmol/L),两条引物的终浓度均为20μmol/L,1U Taq DNA聚合酶,50-100ng模板。PCR反应条件:94℃ 5min;然后94℃ 30S,57℃ 30S,72℃ 40S,36个循环;最后72℃ 7min。
3、将PCR扩增产物进行电泳和基因分型
以30%非变性聚丙烯酰胺贮液(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1)制作1mm厚凝胶为例,具体过程如下:
(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净,烘干,用75%乙醇擦拭玻璃板,自然晾干,装板灌胶。
(2)配置12%非变性丙烯酰胺凝胶。
每35ml 12%非变性丙烯酰胺胶:14ml 30%丙烯酰胺,3.5ml 50%甘油,7ml 5×TBE,10.2ml dH2O,280μl 10%过硫酸铵,20μl TEMED。
(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶,插入梳子,室温聚合1小时,多余的丙烯酰胺4℃保存,随时观察凝胶聚合情况,并补加丙烯酰胺。
(4)凝胶聚合好后,向电泳槽加入1×TBE,用注射器冲洗加样孔。
(5)预电泳10分钟,同时准备点样。
(6)取2ul步骤2的PCR扩增产物置于PCR管中,加8ul变性Buffer,离心混匀,98℃变性10分钟,迅速冰浴10分钟,用微量移液器点样。变性Bufffer:由98体积份的去离子甲酰胺和2体积份的0.5M pH=8.0EDTA溶液组成。
(7)打开电源,250伏电泳10分钟,将电压调至150伏,电泳18小时。
(8)电泳结束后关上电泳仪,放出电泳液,小心剥下凝胶,置染色液中染色30min。染色液:由硝酸银和ddH2O组成,硝酸银浓度为0.2%。
(9)染色结束,回收AgNO3,去离子水洗胶3遍,每次2分钟,洗去多余染色液。
(10)显色液显色,视单链清晰,背景淡黄(时间约10-20min),立即倒掉显色液,用10%乙酸终止显色反应。显色液为10%(体积百分含量)乙酸水溶液。
(11)照相、保存。
(12)根据染色结果进行基因分型。
将未发生缺失的等位基因定义为A,缺失的等位基因定义为a。AA基因型个体、Aa基因型个体和aa基因型个体的电泳图见图1。绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中,各种基因型的频率见表1。
表113bp缺失标记在绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中的频率
*注:A-正常,a-13bp缺失。
在基因型为AA型时,有大约93%【(4+6)/131*100%=7%】的把握可以确保该个体为绿壳基因纯合子,基因型为aa时有约98%(2/95*100%=2%)的把握可以确保个体为非绿壳基因纯合子(褐壳)。因此可以在东乡绿壳蛋鸡中进行13bpdel标记基因型检测,淘汰aa型和Aa型个体,使得绿壳基因纯合子的比例快速提高。
4、PCR扩增产物的测序和基因型验证
将步骤2的PCR扩增产物分别进行测序。测序结果表明:AA基因型个体的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列3所示;aa基因型个体的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列4所示;Aa基因型个体的PCR扩增产物为序列3和序列4所示DNA的混合物。序列4所示DNA与序列3所示DNA相比,差别仅在于缺失了13bp的核苷酸。缺失的13bp为序列表的序列3自5’末端第221-233位核苷酸。
AA基因型和aa基因型的PCR扩增产物的部分测序结果见图1。
实施例3、应用引物对辅助鉴定绿壳基因(O)
鉴于13bp缺失与绿壳性状显著关联,并且该标记落在绿壳基因精细定位的标记区间,推测该标记(A)很可能与绿壳基因(O)有关或存在紧密连锁关系。通过用东乡绿壳公鸡(OOAA)与东乡褐壳母鸡(ooaa)杂交,F1自交,得到了一个由152个F2个体组成的分离群体。在分离群体中检测13bpdel标记与绿壳基因的连锁情况,结果显示该标记与绿壳基因(O)存在紧密连锁,重组率为0.04(LOD=9.53)。由此可知,A与0位于一个单倍型上的概率为96%(1-4%)。因此,当以标记基因型推断绿壳基因型时,准确性可达92.16%(96%*96%)。
Claims (9)
1.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。
2.权利要求1所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中的应用。
3.辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的方法,包括如下步骤:
(1)提取待测鸡的基因组DNA;
(2)以基因组DNA为模板,用权利要求1所述引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物;
(3)根据PCR产物辅助鉴定:如果PCR扩增产物只有一种,且如序列表的序列3所示,待测鸡为候选的绿壳基因纯合子;如果PCR扩增产物有两种,分别如序列表的序列3和序列4所示,则待测鸡为候选的绿壳基因杂合子;如果PCR扩增产物只有一种,且如序列表的序列4所示,则待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述待测鸡为东乡绿壳蛋鸡。
5.如权利要求3或4所述的方法,其特征在于:步骤(3)中,通过SSCP电泳检测所述PCR产物。
6.权利要求1所述的引物对在制备辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒中的应用。
7.一种辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒,包括权利要求1所述的引物对。
8.权利要求1所述引物对,权利要求3至5中任一所述方法或权利要求7所述试剂盒在绿壳蛋鸡育种中的应用。
9.一种绿壳蛋鸡育种方法,是采用绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子进行育种;所述绿壳基因纯合子是通过权利要求3至5中任一所述方法鉴定得到的。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110105 |