CN106011284B - 一种与西瓜果肉硬度相关的分子标记Hf2-Indel及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与西瓜果肉硬度相关的分子标记Hf2‑Indel及其应用。本发明基于97103全基因组序列及PI296341‑FR重测序信息，根据插入缺失位点设计标记，通过利用野生硬瓤西瓜PI296341‑FR与栽培西瓜97103杂交后的重组自交系后代定位群体对西瓜硬肉基因进行精细定位，开发的紧密连锁的分子标记Hf2‑Indel。通过实验证明：本发明的分子标记Hf2‑Indel可以进行西瓜果肉硬度品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的。

Description

一种与西瓜果肉硬度相关的分子标记Hf2-Indel及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与西瓜果肉硬度相关的分子标记Hf2-Indel及其应用。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)属于葫芦科重要作物，占世界蔬菜作物面积的7％，全球年产量约为90,000,000吨(http://faostat.fao.org)。我国西瓜产销量位于世界第一，是我国具有国际竞争力和较大经济增长空间的重要园艺作物。随着西瓜全基因组序列的发布，如何挖掘重要功能基因，提高西瓜果实品质是分子育种工作的关键。如何寻找控制西瓜重要性状的关键基因，是目前西瓜分子生物学研究的首要内容。
西瓜果肉硬度是重要的商品性状。目前市场青睐果肉较硬的西瓜品种，此类品种果实耐储运，并便于果实切片及拼盘；而大部分传统栽培品种果肉松脆。如何有效培育硬肉西瓜品种是目前西瓜育种工作的热点。利用分子标记辅助育种可以大大缩短育种周期，提高育种效率，而确定西瓜果实硬度控制基因的位置，开发稳定可用的分子标记是这项工作的前提。目前国内外对西瓜果实硬度基因的相关研究较少，尚未能对硬度基因进行精确定位。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质的新用途。
本发明提供了检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质在如下(1)-(6)中至少一种中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度；
(2)制备鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的产品；
(3)鉴定或辅助鉴定待测西瓜为非硬肉西瓜品种还是硬肉西瓜品种；
(4)制备鉴定或辅助鉴定待测西瓜为非硬肉西瓜品种还是硬肉西瓜品种的产品；
(5)选育非硬肉西瓜品种；
(6)选育硬肉西瓜品种。
上述应用中，所述检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质为PCR扩增含有所述DNA片段甲或所述DNA片段乙的引物。
上述应用中，所述引物为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的方法是检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙，
若待测西瓜含有DNA片段甲且不含有DNA片段乙，则待测西瓜为或候选为非硬肉西瓜品种；
若待测西瓜含有DNA片段乙且不含有DNA片段甲，则待测西瓜为或候选为硬肉西瓜品种。
上述方法中，所述检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的方法为如下X1)或X2)：
X1)直接测序西瓜个体的基因组DNA；
X2)测序含有DNA片段甲或DNA片段乙的PCR扩增产物；
所述PCR扩增产物所用的引物为如下1)或2)：
1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸。
本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的产品。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的产品为检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质。
上述产品中，所述检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质为如下Y1)或Y2)或Y3)或Y4)：
Y1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；
Y2)由序列A所示的单链DNA分子和序列B所示的单链DNA分子组成的引物对B；
所述序列A为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；
所述序列B为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；
Y3)含有Y1)所述引物对A或Y2)所述引物对B的PCR试剂；
Y4)含有Y1)所述引物对A或Y2)所述引物对B或Y3)所述PCR试剂的试剂盒。
上述DNA片段甲或上述DNA片段乙也属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供一种选育非硬肉西瓜品种的方法或一种选育硬肉西瓜品种的方法。
本发明提供的选育非硬肉西瓜品种的方法是选育含有DNA片段甲且不含有DNA片段乙的西瓜；
本发明提供的选育硬肉西瓜品种的方法是选育含有DNA片段乙且不含有DNA片段甲的西瓜。
上述应用或上述方法或上述产品中，
所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述非硬肉西瓜为果肉硬度值小于12.5Kg/cm2的西瓜；
所述硬肉西瓜为果肉硬度值大于或等于12.5Kg/cm2的西瓜。
上述应用或上述方法或上述产品中，所述果肉硬度值是采用手持硬度计(KMH-51,KIYA SEISAKUSHD，LTD.)对待测西瓜的果实中心瓤进行检测，得到的数值。
本发明基于97103全基因组序列及PI296341-FR重测序信息，根据插入缺失位点(InDel，Insertion/Deletion)设计标记，通过利用野生硬瓤西瓜PI296341-FR与栽培西瓜97103杂交后的重组自交系后代定位群体对西瓜硬肉(Hard flesh，Hf)基因进行精细定位，开发的紧密连锁的分子标记Hf2-Indel。通过实验证明：本发明的分子标记Hf2-Indel可以进行西瓜果肉硬度品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的。
附图说明
图1为果实硬度基因QTL定位结果图。
图2为实施例1中引物对Hf2-Indel F和Hf2-Indel R对父本(硬肉)、母本(非硬肉)及F1代，21份重测序群体及部分RILs群体的PCR扩增反应条带的电泳图。其中，97为亲本97103的简写，PI为亲本PI296341FR的简写，F1为亲本杂交后的第1代。
图3为实施例1中Hf2-Indel F和Hf2-Indel R对自然群体的PCR扩增反应条带的电泳图。其中，97为亲本97103的简写，PI为亲本PI296341FR的简写，F1为亲本杂交后的第1代。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、西瓜果肉硬度相关的分子标记Hf2-Indel的获得
一、供试材料
供试材料包括父本、母本、F1代、RILs群体；
父本为：PI296341-FR，为典型野生类型西瓜材料，果实硬度高，含糖量低；
母本为：97103，为典型的东亚类型西瓜栽培品种，果肉脆易裂，含糖量高；
F1代为：以上述PI296341-FR父本，97103为母本进行杂交获取的F1代；
RILs群体为：上述F1代自交多代获得的RILs群体，共103株(详见表1)；
21份重测序群体为：经过检验的西瓜核心种质资源(详见表2)；
上述各个供试材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心种质资源库保存的种质资源材料。
表1、西瓜RILs材料及其单株果肉硬度鉴定结果
(标记检测A为非硬肉带型，B为硬肉带型，AB为两种带型均具有)
表2、西瓜21个基因组重测序材料及其单株果肉硬度鉴定结果
(标记检测A为非硬肉带型，B为硬肉带型，AB为两种带型均具有)
二、西瓜果肉硬度相关的分子标记Hf2-Indel的获得
1、RILs群体的单株果肉硬度鉴定
采用手持硬度计(KMH-51,KIYA SEISAKUSHD，LTD.)检测步骤一中的RILs群体和21份重测序群体材料的果实中心瓤，得到果肉硬度的数值(果肉硬度值小于12.5Kg/cm2的西瓜为非硬肉西瓜品种，果肉硬度值大于或等于12.5Kg/cm2的西瓜为硬肉西瓜品种)，各供试材料分别种植三次取平均值，以确保果肉硬度数值的准确性。RILs群体和21份重测序群体的单株果肉硬度鉴定结果分别如表1和表2所示。
2、西瓜果肉硬度基因的初步定位分析
利用Joinmap4.0软件对RILs群体的果肉硬度表型数据与该RILs群体所构建的高密度分子标记遗传图谱进行遗传连锁分析，初步定位目标基因区间。高密度分子标记遗传图谱的构建方法记载于文献“A High Resolution Genetic Map Anchoring Scaffolds ofthe Sequenced Watermelon Genome，PLoS One，2012“中。将果肉硬度基因Hard flesh(Hf)定位在西瓜6号及9号染色体上，分别命名为Hf1，Hf2，图1为西瓜果肉硬度基因初步定位结果图。
3、候选InDel的获得
利用西瓜全基因重测序结果，对自然资源中已经重测序的21份材料在初步定位基因区间内进行基因组序列比对，发现初定位区间的9号染色内有一处InDel的变化与果肉硬度连锁。比较硬肉西瓜品种中该位点序列，在非硬肉西瓜品种中该位点有80bp的序列插入。获取与西瓜材料表型性状完全符合的候选InDel位点。
4、利用网上公布的西瓜全基因组序列信息(西瓜全基因序列信息来源于西瓜基因组信息网站，网站为http://www.iwgi.org)，针对上述候选InDel位点设计与西瓜果肉硬度基因Hardflesh2(Hf2)连锁的分子标记Hf2-Indel：
Hf2-Indel-F(上游引物序列)：5’-GATGCTCGAATAGCATGTCTTG-3’(序列1)；
Hf2-Indel-R(下游引物序列)：5’-CTGGAAATAAAGGAAGTAGCACG-3’(序列2)。
上述引物由上海生工公司北京合成部合成。
三、Hf2-Indel标记的初步验证
利用Hf2-Indel标记对父本、母本、F1代和RILs群体进行验证，结果如表2所示。结果显示位于西瓜基因组9号染色体上发生的插入与果肉硬度风味共分离，Hf2-Indel标记与定位在9号染色体上的西瓜果肉硬度基因Hf2紧密连锁；说明该InDel位点以及利用该InDel位点所设计的Hf2-Indel标记在鉴别西瓜果肉硬度上有较高的利用价值，可以有效地运用于西瓜分子辅助育种。具体步骤如下：
1、基因组DNA提取
分别提取RILs群体的基因组DNA；DNA提取方法在参照Murry等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673)的基础上改进而成；具体步骤如下：
ⅰ.取上述各供试材料的叶片1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；
ⅱ.将上述混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀后冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提两次，得到上清液A；
ⅲ.向上述上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液(75％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干后加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A；
ⅳ.向上述溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提一次，得到上清液B；
ⅴ.向上述上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；
ⅵ.用70％乙醇洗涤上述DNA沉淀，吹干后加适量ddH2O溶解DNA，得到各自的基因组DNA；再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定所述的各自的基因组DNA的浓度，再用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测各自的基因组DNA的提取质量。上述生化试剂购自北京益利精细化学品有限公司。
2、PCR扩增
分别以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用Hf2-Indel-F和Hf2-Indel-R引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。
上述PCR扩增反应的反应体系为：2μL含15mM MgCl2的10×Buffer；2μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；2μL浓度为10mM PCR上、下游混合引物(上下游引物各1μL)；50ng模板DNA；ddH2O补足到20μL；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
上述PCR扩增反应的反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃20s，56℃20s，72℃30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸5min；阶段4：4℃保持。其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；
3、扩增产物的检测
取4μL上述各个PCR扩增产物，加入1μl 10×Loading Buffer，移液器混匀后取点入1％琼脂糖凝胶中进行电泳(110V/500mA电泳，时间为30min)并进行测序。
图2为父本、母本、F1及21份重测序群体Hf2-Indel标记检测结果。其中，泳道1为分子量Marker；泳道2为母本PCR产物；泳道3为父本PCR产物；泳道4为F1代的PCR产物，泳道5-25为21份重测序自然资源的PCR产物。结果表明：Hf2-Indel标记在双亲、F1和21份重测序自然资源的非硬肉材料中均可以扩增出大小为265bp(序列3)的条带，而硬肉材料中均可以扩增出大小为185bp(序列4)的条带。
因此可以通过如下方法鉴定或辅助鉴定待测西瓜为非硬肉西瓜品种还是硬肉西瓜品种：用Hf2-Indel标记对待测西瓜进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测PCR扩增产物的大小；
若PCR扩增产物含有大小为185bp的片段且不含有大小为265bp的片段，则待测西瓜为或候选为硬肉西瓜品种；
若PCR扩增产物含有大小为265bp的片段且不含有大小为185bp的片段，则待测西瓜为或候选为非硬肉西瓜品种。
实施例2、Hf2-Indel标记的验证
为进一步验证实施例1中的Hf2-Indel标记与西瓜果肉硬度基因Hf2的连锁关系，利用自然群体进行验证。具体步骤如下：
1、供试材料
供试材料为自然资源群体；自然群体为：在1484份西瓜资源库中123份具有代表性的西瓜种质资源构成的自然群体(详见表3)；表3中各个供试材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心种质资源库保存的种质资源材料。
表3、123份西瓜种质资源构成的自然群体单株材料及其单株果肉硬度鉴定结果
(标记检测中A为非硬肉带型，B为硬肉带型，AB为两种带型均具有)
注：材料名称带“*”标记的为鉴定结果与硬度检测结果不符合的资源名称。
1、基因组DNA提取
分别提取自然群体的基因组DNA；DNA提取方法在参照Murry等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673)的基础上改进而成；具体步骤如下：
ⅰ.取上述各供试材料的叶片1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；
ⅱ.将上述混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀后冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提两次，得到上清液A；
ⅲ.向上述上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液(75％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干后加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A；
ⅳ.向上述溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提一次，得到上清液B；
ⅴ.向上述上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；
ⅵ.用70％乙醇洗涤上述DNA沉淀，吹干后加适量ddH2O溶解DNA，得到各自的基因组DNA；再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定所述的各自的基因组DNA的浓度，再用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测各自的基因组DNA的提取质量。上述生化试剂购自北京益利精细化学品有限公司。
2、PCR扩增
分别以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用Hf2-Indel-F和Hf2-Indel-R引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。
上述PCR扩增反应的反应体系为：2μL含15mM MgCl2的10×Buffer；2μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；2μL浓度为10mM PCR上、下游混合引物(上下游引物各1μL)；50ng模板DNA；ddH2O补足到20μL；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
上述PCR扩增反应的反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃20s，56℃20s，72℃30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸5min；阶段4：4℃保持。其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler；
3、扩增产物的检测
取4μL上述各个PCR扩增产物，加入1μl 10×Loading Buffer，移液器混匀后取点入1％琼脂糖凝胶中进行电泳(110V/500mA电泳，时间为30min)。
图3为自然群体材料Hf2-Indel标记检测结果。其中，PI为亲本PI296341-FR，F1为亲本杂交后的第1代。结果表明：Hf2-Indel标记在自然群体材料的非硬肉材料只可以扩增出大小为265bp(序列3)的条带，而硬肉材料只可以扩增出大小为185bp(序列4)的条带。上述检测结果进一步证实了本发明的Hf2-Indel标记可以用于西瓜果肉硬度的分子标记辅助育种。

Claims (6)

1.检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质在如下（1）-（6）中至少一种中的应用：
（1）鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度；
（2）制备鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的产品；
（3）鉴定或辅助鉴定待测西瓜为非硬肉西瓜品种还是硬肉西瓜品种；
（4）制备鉴定或辅助鉴定待测西瓜为非硬肉西瓜品种还是硬肉西瓜品种的产品；
（5）选育非硬肉西瓜品种；
（6）选育硬肉西瓜品种；
所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述非硬肉西瓜为果肉硬度值小于12.5 Kg/cm2的西瓜；
所述硬肉西瓜为果肉硬度值大于或等于12.5 Kg/cm2的西瓜。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的物质为PCR扩增含有所述DNA片段甲或所述DNA片段乙的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述引物为如由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A。
4.一种鉴定或辅助鉴定待测西瓜果肉硬度的方法，是检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙，
若待测西瓜含有DNA片段甲且不含有DNA片段乙，则待测西瓜为或候选为硬肉西瓜品种；
若待测西瓜含有DNA片段乙且不含有DNA片段甲，则待测西瓜为或候选为非硬肉西瓜品种；
所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述非硬肉西瓜为果肉硬度值小于12.5 Kg/cm2的西瓜；
所述硬肉西瓜为果肉硬度值大于或等于12.5 Kg/cm2的西瓜。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测西瓜含有DNA片段甲还是DNA片段乙的方法为如下X1）或X2）：
X1）直接测序西瓜个体的基因组DNA；
X2）测序含有DNA片段甲或DNA片段乙的PCR扩增产物；
所述PCR扩增产物所用的引物为由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A。
6.一种选育硬肉西瓜品种的方法，是选育含有DNA片段甲且不含有DNA片段乙的西瓜；
或一种选育非硬肉西瓜品种的方法，是选育含有DNA片段乙且不含有DNA片段甲的西瓜；
所述DNA片段甲的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述DNA片段乙的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述非硬肉西瓜为果肉硬度值小于12.5 Kg/cm2的西瓜；
所述硬肉西瓜为果肉硬度值大于或等于12.5 Kg/cm2的西瓜。
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