CN101864476B - 一种用pcr鉴定刀鲚和凤鲚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性鉴别刀鲚与凤鲚的PCR技术。根据刀鲚与凤鲚线粒体DNA控制区(D-loop)和细胞色素b(Cytochrome b)基因的保守序列，设计出两对特异引物，制定了便捷的鉴别刀鲚与凤鲚的PCR反应体系。提取鱼肌肉DNA进行PCR扩增，取扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测，如P1F/R引物对扩增产物存在1220bp DNA条带，P2F/R引物对无扩增，则确定所检鲚鱼为刀鲚；如P1F/R引物对无扩增，P2F/R引物对产物存在280bp DNA条带，则可确定为凤鲚。本方法为形态学上无法鉴别的不同发育时期刀鲚与凤鲚的定性检测提供了快速、可靠的分子生物学鉴定技术。
Description
技术领域：
本发明是一种定性刀鲚和凤鲚的准确检测方法，具体地说是利用分子生物学技术对鲚属刀鲚、凤鲚物种的定性的检测方法。
技术背景：
自20世纪60年代，线粒体DNA(mtDNA)得到证实以来，目前很多种动物的mtDNA的全序列已经全部测定。mtDNA为细胞核外遗传物质，以母系单性遗传、结构简单、在世代遗传中不发生重组、进化速度快为特点。mtDNA在种间、种内群体间和群体内具有广泛的多态性，线粒体DNA因其种属特异性强，在分子进化中有许多独特的优越性，是研究动物种间进化、进行种属鉴定、特异的遗传标记，现已广泛应用在分子分类学等领域。
发明人根据mtDNA的基本特性，设计出特异的引物，利用分子分类学方法找到刀鲚和凤鲚mtDNA上的种属特异性片段，从而定性检测鲚属鱼类中的刀鲚和凤鲚。与其他分子生物学方法相比，这种方法具有其优越性，在水产捕捞鱼种鉴定，法医学鉴定以及食品检测等方面都可以应用。本研究方法方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高，填补了目前国内将分子生物学标准用于鲚属鱼类物种鉴别方面的空白。
发明内容：
本专利寻找出一种新的可以快速可靠的将鲚属鱼类中不同发育时期的刀鲚(包括太湖湖鲚、短颌鲚))、凤鲚进行鉴定的分子标记。结果，在部分测序基础上，本研究筛选出了利用控制区D-loop序列和cytochrome b基因序列设计的两对引物(P1F/P1R、P2F/P2R)通过一次PCR，琼脂糖凝胶电泳显示特征条带的有无，即可将从形态学上鉴定出的刀鲚(包括太湖湖鲚、短颌鲚))、凤鲚进行鉴定。
与其他分子生物学方法相比，这种方法具有其优越性，在水产捕捞鱼种鉴定，法医学鉴定以及食品检测等方面都可以应用。本研究方法方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高，填补了目前国内将分子生物学标准用于鲚属鱼类物种鉴别方面的空白。
本发明的目的是为了公布一种基于分子分类学基础上刀鲚和凤鲚鱼苗定性的检测方法。其检测方法为：
1、DNA的提取：
取鲚属鱼类的刀鲚(包括太湖湖鲚、短颌鲚)及凤鲚背部肌肉取约200mg装入1.5ml的Eppendorf管中，总DNA提取用苯酚-氯仿法，参照分子克隆第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔)。
2、DNA样品浓度的测定：
DNA样品的浓度通过核酸蛋白分析仪(型号：Eppendorf AG 22331Hamburg )和电泳-EB染色的荧光强度双重测定。
3、引物设计：
根据Genbank公布鲚属鱼类线粒体DNA序列，经同源性比对后，利用Primer 5.0软件辅助设计引物。
3.1扩增引物：
(1)刀鲚(包括太湖湖鲚及短颌鲚)扩增引物名称及序列：
P 1F：5’一CACATCGCCCGAGGACTA一3’
P1R：5’一ACTCCTGCAATGACGAATG一3’
刀鲚(包括太湖湖鲚及短颌鲚)扩增片段长度：约1220bp
(2)凤鲚扩增引物名称及序列：
P2F：5’-gccatatactctccttggtgaca-3’
P2R：5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’
凤鲚扩增片段长度：约280bp
4、PCR反应：
4.1P1F/P1R PCR反应体系及反应条件：
总反应体系为30ul，其中含DNA模板1ul(100ng)，dNTPs 2ul(各2.5mM)，10×PCR缓冲液3ul，外部正反向引物各1ul(10uM)，Taq DNA聚合酶0.2ul(1U)，无菌超纯水补足至30ul。扩增反应条件为：94℃5min，94℃40s，50℃35s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸8min。
4.2P2F/P2R PCR反应体系及反应条件：
总反应体系为30ul，其中含DNA模板1ul(100ng)，dNTPs 2ul(各2.5mM)，10×PCR缓冲液2.5ul，外部正反向引物各1ul(10uM)，Taq DNA聚合酶0.2ul(1U)，无菌超纯水补足至30ul。扩增反应条件为：94℃5min，94℃30s，45℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸8min。
5、扩增产物鉴定：
PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度为1％，加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭。电泳缓冲液为0.5×TBE，以DL2000DNA Marker作为DNA分子量标准。电泳条件为10V/cm电压，电泳1h后在凝胶成像系统中拍照分析。
PCR结束后根据记录结果直接分析。
6、结果：
6.1DNA提取：
分别利用-20℃冻存的刀鲚(包括湖鲚和短颌鲚)、凤鲚肌肉，抽提获得总DNA。核酸蛋白分析仪测量所提取DNA样品的OD260/OD280的值不小于1.5，并进行电泳检测后，根据测得的浓度将DNA样品浓度稀释到50ng/ul，4℃保存。再以稀释的DNA为模板进行PCR扩增。
6.2引物P1F/P1R特异性扩增分析：
以刀鲚(包括湖鲚和短颌鲚)、凤鲚DNA为模板，分别用两对引物对线粒体基因进行扩增，结果只有刀鲚(包括湖鲚和短颌鲚)、凤鲚扩增出1220bp左右的片段，凤鲚无条带，引物PiF/P1R的扩增结果见图1。
6.3引物P2F/P2R特异性扩增分析：
以刀鲚(包括湖鲚和短颌鲚)、凤鲚DNA为模板，分别用两对引物对线粒体基因进行扩增，结果只有凤鲚扩增出280bp左右的片段，其他鱼类无条带，引物P2F/P2R的扩增结果见图2。
6.4扩大样本量验证
引物P1：刀鲚类群(包括刀鲚40、湖鲚10、短颌鲚16)出现1200bp左右的特征条带，刀鲚66尾，其中57尾有特征条带，即出现率86.4％。
凤鲚24尾，24尾全无条带，即出现率为0％；
引物p2：刀鲚类群(包括刀鲚36、湖鲚10、短颌鲚16)62尾，有52尾未出现280bp左右
Claims (1)
1.一种PCR鉴定刀鲚和凤鲚的方法，其特征在于用苯酚-氯仿法提取总DNA；根据刀鲚与凤鲚线粒体DNA控制区和细胞色素b基因的保守序列，设计出两对特异引物，制定了便捷的鉴别刀鲚与凤鲚的PCR反应体系；特异性引物具体如下：P1F：5’-cacatcgcccgaggacta-3’，P1R：5’-actcctgcaatgacgaatg-3’；P2F：5’-gccatatactctccttggtgaca-3’，P2R：5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’；进行PCR扩增种特异性DNA序列基因，最后电泳鉴定。
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