CN103421907A - 一种鉴定药用植物三叶青的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种鉴定药用植物三叶青的方法，通过三叶青的特异性核苷酸序列以及基于该序列的特异性引物，利用PCR技术鉴定三叶青。本发明设计的引物，具有极高的专一性，在12个不同种源的三叶青中均可扩增出1800bp左右条带，与16个近缘物种和三叶青伪品土圜的DNA均不反应，可以快速、准确地鉴别三叶青。本发明方法用很少量样品即可完成整个鉴定操作，鉴定结果准确、灵敏度高，为药用植物三叶青的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上伪品仿冒三叶青欺骗消费者的问题。

Description

一种鉴定药用植物三叶青的方法

技术领域

本发明属于属于中药鉴定技术领域，具体地说是涉及一种利用核苷酸序列、聚合酶链反应引物鉴定三叶青的方法。 

背景技术

三叶青（Tetrastigmahemsleyanum Diels et Gilg），又名三叶崖爬藤，是中国特有的珍稀药用植物，分布于中国长江以南地区，为民间常用的中草药（中国植物志，1998）。其块根入药具有免疫调节、保肝、抗肿瘤、抗病毒、抗出血热、抗炎、镇痛及解热等多种功效。 

近年来，三叶青的抗肿瘤作用日益受到科研成果的认可，临床和民间用药的需求极大，价格节节攀升。然而三叶青的供应基本依赖野生资源，在利益的趋势下，其野生资源被滥采滥挖，资源蕴藏量的急剧下降（蹇京蓉，2012），无法满足市场需要。因此市场上出现了以廉价近缘种或土圜等常见伪品滥竽充数以谋取暴利的现象，难以保证用药的安全性和有效性。综合上述原因，有必要开发出一种实用性高，能快速、准确鉴定三叶青的方法。 

中药现代化步伐的加快对中药标准化提出了新的要求，标准化生产是中药产业发展和打入国际市场的关键，也是目前大力推行的GAP（Good agriculturing Practice, 中药材生产质量管理规范）的工作核心。而种质标准和科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提，因此中药材鉴定的方法要满足快速、准确和标准化等要求。然而目前三叶青的鉴定方法主要依据形态学（黄成勇，2002）和化学成分（李瑛琦等，2003），甚至仅依靠经验判断，尚未见到运用现代分子生物学手段建立DNA快速鉴定技术的研究报道。因此，有必要研发真实可靠的DNA分子标记快速鉴定三叶青，解决药材市场上真伪混杂、品质良莠不齐等问题。 

本发明涉及的部分参考文献： 

中国植物研究所.中国植物志第48卷第2册, 1998.北京, 科学出版社；

蹇京蓉.中药三叶青资源状况及其对策研究[J].中国药物经济学,2012(2):228-230；

黄成勇，辛宁，石艳辉．三叶崖爬藤的显微鉴别. 中药材, 2002, 25(8): 548-549；

李瑛琦, 陆文超, 于治国.三叶青的化学成分研究[J].中草药2003,34(11):982-983。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定三叶青的方法。本发明从遗传本质上客观准确地鉴定所有常见种源的三叶青。具体通过以下步骤实现： 

（1）提供用于三叶青鉴定的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ NO 1所示。该核苷酸片段来源于ISSR通用引物UBC843扩增所得的三叶青特异性核苷酸序列。ISSR通用引物UBC843扩增的带型中，三叶青与近缘种相比有特异性条带存在，该条带在伪品土圜中亦不具有，因此能根据此条带区分三叶青和其他易混物种。该特异性核苷酸序列的结构特征如SEQ NO 1所示，除ISSR引物结合位点外长1773bp，其中带下划线的部分（49-69bp和1748-1766bp）分别为本发明的三叶青专一性聚合酶链反应引物Thk1和Thk2的结合位点。

该三叶青特异性核苷酸序列可通过如实施例1所述的方法得到；或者按已知的该序列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。 

SEQ NO 1： 

5’-aatcattctt ctgtgaaatc aaaacctgat gcaccataaa actggagatc gtattttcct        60

actcttgttt ctcatggcat catccaaaac ttccatgaaa tcgaactcat cagtggattc          120

ctacattttc ccgatttctt tgatttctcc tatttgcttt ccttgacaag gtgagaacag            180

tcggctcttc ctcctcgtac aagatatcat cttaatcgca tttagaattc tttgcccttt            240

tcaggatggt tcagcctttt cctcttgaga ttctctgttt ttgtattcaa atttgagttt             300

gaagtttgaa tgaatttgta gataaagagg gagatgactt ttctacaaca cacttctctc         360

tctctaaaac atcaatcaag cttttctatc gcaacagtgt cataaggttt ctatgacttc           420

ttgatggtgt ttgttgagct catattcttg tattcagtaa gtgcttttac gcttgtgatg            480

aatttatgat attttctgtt aaattaggtt ttctctgttt gaagaagcta atttaataat            540

tttgaggttt ttttttccat gaatcgattg ggacttttat ctgttggtac aatttatcca            600

tggatgcttc cattattgca gatgggaatc ttgtcctatg cttttgtctt agaacttctt            660

ccttcatttt gcatcaaaac gaactcctct cgcttctcac actgctttta gttgctgaac           720

aaaatgagga aagaaagatt gaaattttcc aaactgaaaa tgataaaagc tctgctcaat       780

tgaactgagt acttctttaa atttcttcag aacggtccac ttttgggcct tctattcata           840

attcctttta taaaaaagag cttattcaca ctttaattga tctgacttct atctaaaaag           900

ttttcaagaa agaaaagaga aatgatggct tctaacaatg tattgtgtaa gttgagaaaa         960

aagatgacag aaaattttga atctcatttc tgtttccttt tagttttcca aagatttttt             1020

gcttgctttt atttatttat tattatcatt attctttcca atggagcaac gcttttaatc              1080

tttgatcgat tcaaaggaaa acggggagga taaaagacac tgagttattg ggaacattgt         1140

tttttatata atgtttgtct ctcctcaacc acagaagttg agtgaagatt gtttatatat            1200

atatctacag ggtttgcaga agtctctata tactacttgc caatcttttt gaaggcatgg           1260

ccactgcttt gtttttaaat tttctcaaat taaacttagt ttccagcatg acatggtggt            1320

tgaccagtgc caaggctttg attagtcctt tttcctaatc tcatatggat tttttatgga             1380

ctctcagtta atattcctta ttacatgtgg tggcaggatg aggacacaga atgatagaaa          1440

aatgtcaaaa ctggagggct tcaggaaaaa attaagttaa ttatgtagca tcaagagttc         1500

acatttttca tacataaata agaagttggc actagggcca tatgtttcct tgatgggaaa          1560

atctgctcca ataatagtga ggattggtga agggtgaaaa ttatttcaga aattggtaaa         1620

tatatcaggg aatagtacat gccaagggca atatagccga ttgatgcaca tagcaagcca        1680

tcagtaagct gtatgggatt ttatgaggcc atagaagaac actacattaa atcattatca         1740

tctatcacga agatggagaa agtgaggaaa gag-3’                              1773

（2）提供来源于上述DNA片段的三叶青专一性聚合酶链反应引物。该引物来源于所述SEQ NO 1核酸序列的1段或2段19或21个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化、且其核苷酸变化量不超过10%的序列。所述引物的核苷酸序列为：SEQ NO 2：5'-TCGTATTTTCCTACTCTTGTT-3' （简称ThK1）和SEQ NO 3 ：5'-CTCACTTTCTCCATCTTCG-3' （简称ThK2）。

本发明的上述三叶青专一性聚合酶链反应引物，可按照预先根据三叶青特异性核苷酸序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到（利用可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成）。 

（3）鉴定三叶青的方法：采用常规PCR法：以前面所述的本发明的聚合酶链反应引物（优选为Thk1和Thk2）为PCR引物，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行：94℃ 5 min，（94℃  30 sec，61℃ 45 sec，72℃ 1.5 min，）35cycles， 72℃ 10 min， 4℃保温；若在分子量1800bp左右有条带出现，则为三叶青；若在分子量1800bp左右没有条带出现，则不是三叶青。 

本发明放到另一个目的是提供一种鉴定药用植物三叶青的方法在鉴定药用植物三叶青中的应用。 

本发明的上述三叶青专一性聚合酶链反应引物，具有极高的专一性，在12个不同种源的三叶青中均可扩增出1800bp左右条带，与16个近缘物种和三叶青伪品土圜的DNA均不反应；虽与4个近缘种（尾叶崖爬藤、海南崖爬藤、红花崖爬藤、单叶红枝崖爬藤）的反应为阳性，但近缘种扩增条带大于2300bp，并且在1800bp处没有扩增条带出现，因此不影响该引物鉴定的有效性。所以，利用该核酸引物，通过PCR方法可以快速、准确地鉴别三叶青。为该物种的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上伪品仿冒三叶青欺骗消费者的问题。 

本发明用少量样品即可完成整个鉴定操作，鉴定结果准确、灵敏度高，ThK1和ThK2为三叶青专一性聚合酶链反应引物，若为市场伪品如土圜或近缘种，则目的长度（1800bp左右）扩增结果为阴性，为药材市场提供一种药用植物三叶青的快速准确鉴定真伪方法。 

附图说明

图1是采用ISSR引物UBC843进行PCR扩增的电泳图（框内的条带为三叶青特有的条带，分子量为1800bp左右）。图中1-15分别为浙江武义、浙江淳安、浙江南山、浙江富阳、贵州湄潭、重庆金佛山、湖北兴山、江西井冈山、福建三明、湖南张家界、台湾、海南尖峰岭、四川峨眉山、广西粗江、广西桂林15个产地的野生三叶青， 16-34分别为红枝崖爬藤、尾叶崖爬藤、海南崖爬藤、七小叶崖爬藤、富宁崖爬藤、毛脉崖爬藤、广西崖爬藤、毛枝崖爬藤、扁担藤、柔毛网脉崖爬藤、红花崖爬藤、十字崖爬藤、单叶红枝崖爬藤、喜马拉雅崖爬藤、细齿崖爬藤、毛叶崖爬藤、蒙自崖爬藤、狭叶崖爬藤、无毛崖爬藤， 35为土圜。M是分子量。 

图2-1，2-2，2-3是采用三叶青专一性聚合酶链反应引物ThK1和ThK2对12个产地的三叶青(图2-1中36-44，图2-2中45-47)、19个近缘种(图2-2中48-58，图2-3中59-66)和伪品土圜(图2-3中67)的叶片样品进行检测的扩增电泳图（仅三叶青在1800bp左右有条带，少数几个近缘种反应亦为阳性，但扩增条带长度为2000bp以上）。M是分子量。 

图3 是采用分子探针ThK1和ThK2对市场主要产区的正品三叶青块根样品（68-71）和市场伪品土圜块根样品（72）的扩增电泳图。M是分子量。 

具体实施方法

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：三叶青特异性核苷酸序列的制备

1 基因组DNA的提取

采用改良PlantZol法提取叶片或块根样品的基因组DNA。步骤如下：

（1）取约0.05克的硅胶干燥叶片，加入少量PVP粉，置入磨样管中，用BIO101磨样机研磨，SPEED 4.5, TIME 40s；或加入约0.1g干燥块根粉末。

（2）迅速加入65℃预热的PlantZol提取缓冲液(含2%b-巯基乙醇) 800－1000ul， 65℃水浴60分钟。 

（3）冷却至室温，加1000ul的氯仿：异戊醇（24：1），混合均匀(缓慢颠倒)5-10分钟，室温 12000rpm 离心5分钟。 

（4）吸取上层水相，再加入1000ul的氯仿：异戊醇（24:1）抽提，重复步骤（3）。 

（5）吸取上层水相，加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于放置1小时或过夜。10000rpm离心15min，使DNA附着离心管管底，弃水相。 

（6）加75%乙醇浸洗2-3次，用无水乙醇清洗一次，去乙醇，风干。用适量0.1×TE溶解DNA沉淀，-20 ℃保存备用。 

用ISSR通用引物UBC843进行PCR扩增，扩增体系如下表1所示： 

PCR程序为：

4℃保温。

PCR产物电泳图结果见图1，红色框内的条带（分子量为1800bp左右）是采用ISSR引物UBC843进行PCR扩增时寻找到的三叶青在近缘种中的特有条带。如图1所示，三叶青共12个种源的45个个体在分子量1800bp左右均有条带出现，而其他物种和市场常见伪品土圜没有条带出现。因此，此条带即为三叶青的特有条带。 

序列测定

PCR结束后，PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，对只在三叶青中出现的特异性ISSR片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒（Sangon，Shanghai，China）回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体（Sangon，Shanghai，China）上，转化到大肠杆菌感受态细胞中。目的片段采用引物M13+/-于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中<210>1序列所示的核苷酸组成与排列。

实施例2：三叶青（长度）专一性核酸分子探针Thk1和Thk2的制备

在获得三叶青特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Premier 5.0(Vinary Singh, 1998)软件设计，得出Thk1和Thk2（分别为序列表中<400>所示的2和3）的核苷酸组成与排列是用于鉴定三叶青的良好寡核苷酸片段。根据Thk1和Thk2的核苷酸组成的排列（序列表中<210>2和<210>3序列所示的核苷酸组成与排列），在DNA自动合成仪上合成得到。

实施例3：三叶青的鉴定（常规PCR方法）

1.      DNA的提取：采用改良PlantZol法提取叶片或块根基因组DNA。

2.      PCR反应体系为表2： 

3.      PCR操作：取两个0.5毫升PCR管，按照步骤2分别加入24微升PCR混合液，然后一管加入DNA1微升，另一管加入1微升PCR混合液（对照），放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：

4℃保温。

PCR扩增结果用含有0.1%EB的1.5%琼脂糖胶电泳检测。 

电泳结果显示12个不同产地（图2-1中36浙江武义、37浙江宁坡、38贵州湄潭、39湖北兴山、40江西井冈山、41福建三明、42湖南张家界、43重庆金佛山、44海南尖峰岭、图2-2中45四川峨眉山、46广西龙胜、47广西桂林）的三叶青反应为阳性，在分子量1800bp左右(2000bp以下)有条带出现；4个近缘种(图2-2中48尾叶崖爬藤，49海南崖爬藤，50红花崖爬藤，51单叶红枝崖爬藤)，在分子量1800bp左右没有扩增条带出现，只在2300bp左右出现条带。因此，三叶青扩增序列与近缘种同源序列对比具有长度特异性（差异500bp以上），即只有三叶青在分子量1800bp左右(2000bp以下)有条带出现。其余15个近缘物种（图2-2中52红枝崖爬藤、53七小叶崖爬藤、54富宁崖爬藤、55毛脉崖爬藤、56广西崖爬藤、57毛枝崖爬藤、58扁担藤，图2-3中59柔毛网脉崖爬藤、60十字崖爬藤、61喜马拉雅崖爬藤62细齿崖爬藤、63毛叶崖爬藤、64狭叶崖爬藤、65蒙自崖爬藤、66无毛崖爬藤）和三叶青伪品土圜（图2-3中67）的DNA均不反应。 

对市场上购买块根检测结果显示：产自浙江、广西、福建、云南（图3中68-71）的正品三叶青块根样品扩增反应为阳性，而市场盛行的伪品块根（土圜，图3中72）的DNA不反应。 

表明：采用Thk1和Thk2进行PCR检测，若样品中有三叶青则1800bp左右目的长度序列的扩增反应为阳性，反之则为阴性，说明Thk2和Thk2引物的专一性。 

<110> 浙江大学

<120> 一种鉴定药用植物三叶青的方法

<160>  3

 

<210>  1

<211>  1773

<212>  DNA

<213> 三叶青（Tetrastigmahemsleyanum Diels et Gilg）

<400>  1

5’-aatcattctt ctgtgaaatc aaaacctgat gcaccataaa actggagatcgtattttcct       60

actcttgtttctcatggcat catccaaaac ttccatgaaa tcgaactcat cagtggattc          120

ctacattttcccgatttctt tgatttctcc tatttgcttt ccttgacaag gtgagaacag            180

tcggctcttcctcctcgtac aagatatcat cttaatcgca tttagaattc tttgcccttt            240

tcaggatggttcagcctttt cctcttgaga ttctctgttt ttgtattcaa atttgagttt             300

gaagtttgaatgaatttgta gataaagagg gagatgactt ttctacaaca cacttctctc         360

tctctaaaacatcaatcaag cttttctatc gcaacagtgt cataaggttt ctatgacttc           420

ttgatggtgtttgttgagct catattcttg tattcagtaa gtgcttttac gcttgtgatg            480

aatttatgatattttctgtt aaattaggtt ttctctgttt gaagaagcta atttaataat            540

tttgaggtttttttttccat gaatcgattg ggacttttat ctgttggtac aatttatcca            600

tggatgcttccattattgca gatgggaatc ttgtcctatg cttttgtctt agaacttctt            660

ccttcattttgcatcaaaac gaactcctct cgcttctcac actgctttta gttgctgaac           720

aaaatgaggaaagaaagatt gaaattttcc aaactgaaaa tgataaaagc tctgctcaat       780

tgaactgagtacttctttaa atttcttcag aacggtccac ttttgggcct tctattcata           840

attccttttataaaaaagag cttattcaca ctttaattga tctgacttct atctaaaaag           900

ttttcaagaaagaaaagaga aatgatggct tctaacaatg tattgtgtaa gttgagaaaa         960

aagatgacagaaaattttga atctcatttc tgtttccttt tagttttcca aagatttttt             1020

gcttgcttttatttatttat tattatcatt attctttcca atggagcaac gcttttaatc              1080

tttgatcgattcaaaggaaa acggggagga taaaagacac tgagttattg ggaacattgt         1140

tttttatataatgtttgtct ctcctcaacc acagaagttg agtgaagatt gtttatatat            1200

atatctacagggtttgcaga agtctctata tactacttgc caatcttttt gaaggcatgg           1260

ccactgctttgtttttaaat tttctcaaat taaacttagt ttccagcatg acatggtggt            1320

tgaccagtgccaaggctttg attagtcctt tttcctaatc tcatatggat tttttatgga             1380

ctctcagttaatattcctta ttacatgtgg tggcaggatg aggacacaga atgatagaaa          1440

aatgtcaaaactggagggct tcaggaaaaa attaagttaa ttatgtagca tcaagagttc         1500

acatttttcatacataaata agaagttggc actagggcca tatgtttcct tgatgggaaa          1560

atctgctccaataatagtga ggattggtga agggtgaaaa ttatttcaga aattggtaaa         1620

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tcagtaagctgtatgggatt ttatgaggcc atagaagaac actacattaa atcattatca         1740

tctatcacgaagatggagaa agtgaggaaagag-3’                              1773

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>人工序列

<400>  2

tcgtattttc ctactcttgt t             21

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>人工序列

<400>  3

ctcactttct ccatcttcg              19

 

Claims (3)

1.一种鉴定药用植物三叶青的方法，其特征是，通过以下步骤实现：

（1）提供用于三叶青鉴定的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ NO 1所示，该核苷酸片段来源于ISSR通用引物UBC843扩增所得的三叶青特异性核苷酸序列，除ISSR引物结合位点外长1773bp，其中带下划线的部分49-69bp和1748-1766bp分别为本发明的三叶青聚合酶链反应引物Thk1和Thk2的结合位点；

（2）提供来源于上述DNA片段的三叶青专一性聚合酶链反应引物，所述引物的核苷酸序列为：SEQ NO 2：5'-TCGTATTTTCCTACTCTTGTT-3' 或SEQ NO 3 ：5'-CTCACTTTCTCCATCTTCG-3'；

（3）鉴定三叶青的方法：采用常规PCR法：以步骤（2）所述的PCR引物，进行PCR反应，具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行：94℃  5 min，（94℃  30 sec，61℃ 45 sec，72℃ 1.5 min，）循环35次，72℃ 10 min，4℃保温；若在分子量1800bp左右有条带出现，则为三叶青；若在分子量1800bp左右没有条带出现，则不是三叶青。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定药用植物三叶青的方法，其特征在于，步骤（2）所述引物来源于SEQ NO 1核酸序列的1段或2段19或21个核苷酸的的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化、且其核苷酸变化量不超过10%的序列。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定药用植物三叶青的方法在鉴定药用植物三叶青中的应用。

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