CN103993097A - 一种小核糖核酸的电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于微量微小RNA的电化学检测方法，包括以下步骤：固定在电极表面报告DNA与阻塞DNA形成双链a；阻塞DNA与靶标微小RNA分子结合，形成双链b，使阻塞DNA从电极表面脱离；引物DNA与双链b中阻塞DNA末端序列结合，自我复制形成DNA双链c，并将靶标微小RNA置换下来；被置换下来的靶标微小RNA又重新回到工作电极表面，与其他的双链a反应，N次循环反应后，电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，进而电化学信号也越来越强，从而实现对单分子微小RNA的电化学检测。同样的原理还可推广到DNA，siRNA的检测中，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及小核糖核酸检测技术领域，特别涉及一种对痕量小核糖核酸的电化学单分子检测方法。
背景技术
microRNA(微小RNA)是一类长度约为21～25个核苷酸的小分子RNA，通过与mRNA(信使RNA)互补结合，在转录后水平抑制靶基因的表达microRNA普遍存在于多细胞生物中，而且数量可观，约占整个基因组基因总数2％左右。microRNA在生物进化过程中高度保守，并已被证实参与和调控了包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程，以及包括肺癌、白血病在内的多种疾病发生过程。研发人员监测大量已知microRNA在免疫反应中表达的变化，从而发现其在生理病理状态下的重要作用。除此之外研发人员还可以发现和鉴定出新的生物标志物，从而达到监测免疫细胞的信号转导和组织器官的分化的目的。由于microRNA细胞特异性以及“时空”特异性的特点，近年来其在干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用，逐渐被科学家们发现。通过监测大量已知microRNA在免疫反应中表达的变化，研发人员可以在较短的时间内发现新的干细胞分化的标志microRNA；此外通过对已知的microRNA标志物表达量的检测，可以达到对干细胞的多能性以及分化进行监测的目的。根据国内外的相关报告，某些microRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。根据microRNA在人体中起到的调节蛋白生成的特殊作用，我们认为其在未来临床检测应用方面具有广阔的前景。
现在常见的检测靶标microRNA的方法有深度测序(Deep Sequencing)基因芯片(Micro-Array)、实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)等。
上述方法大多需要大型、较昂贵设备的支持，检测成本较高，不适合常规的分析检测，因此需要发展一种简单、成本低又灵敏的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单的检测靶标微小RNA的方法。本发明所述电化学单分子检测方法是一种非常简便的分析方法，通过三电极系统中电信号的变化可以直接判断出待测样品中是否存在靶标微小RNA，操作简单，抗干扰能力强，能快速、精确的实现对靶标微小RNA的检测。
本发明提供一种靶标微小RNA的电化学单分子检测方法，包括以下步骤：
步骤一 固定在工作电极表面的报告DNA与阻塞DNA形成双链a，打开报告DNA的茎环结构；
步骤二 靶标microRNA与双链a中的阻塞DNA结合，形成双链b，使阻塞DNA从工作电极表面脱离，报告DNA自发形成茎环结构；
步骤三 引物DNA与双链b中阻塞DNA末端序列结合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA双链c，同时将靶标microRNA置换下来；
步骤四 被置换下来的靶标microRNA又重新回到工作电极表面，与其他的工作电极表面的双链a发生反应；
步骤五 经过上述N次循环反应后，工作电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，工作电极表面电信号会越来越强，从而实现对单分子微小RNA的电化学单分子检测。
优选的，所述报告DNA5′端带有可以修饰到电极表面的基团(如巯基，氨基等)，报告DNA3′端带有电信号分子。
优选的，所述阻塞DNA通过与报告DNA互补配对被固定与电极表面，
但不是直接连接与工作电极表面。
优选的，所述阻塞DNA上有一段可以与靶标微小RNA配对的碱基序列。
优选的，靶标microRNA是可以重复利用的。
优选的，所述报告DNA与阻塞DNA形成双链a时，报告DNA3′端电信号分子远离金电极表面，电信号减弱。
优选的，所述报告DNA在单分子链状态下形成茎环结构时报告DNA3′端带有电信号分子，靠近工作电极表面，增强电信号。
本发明提供一种靶标microRNA的检测方法，包括以下步骤：报告DNA与阻塞DNA形成双链，双链形成可在修饰到电极表面之前，亦可在报告DNA固定到电极表面之后；靶标microRNA分子与阻塞DNA结合，形成双链，并从电极表面脱离，报告DNA单链自发形成茎环结构，并使末端电信号分子靠近电极表面；之后引物DNA与阻塞DNA末端序列结合，并在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成双链DNA，并将靶标microRNA置换下来；被置换下来的靶标microRNA又重新回到电极表面，与其他的报告-阻塞双链作用，再结合引物，扩增，置换，如此循环，电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，进而电信号也越来越强，从而实现对痕量靶标microRNA的电化学单分子检测。
本发明的有益效果是，本发明所述电化学单分子检测方法是一种非常简便的分析方法，通过三电极系统中电信号的变化可以直接判断出待测样品中是否存在靶标microRNA，操作简单，抗干扰能力强，能快速、精确的实现对靶标microRNA的检测，适于在临床应用，如肺癌、白血病、肿瘤等疾病的诊断。同样的原理还可推广到DNA，si RNA的检测中，应用前景广泛。
附图说明
图1是本发明所述靶微小RNA的电化学检测方法的技术流程图。
图2是应用本发明所述微小RNA的电化学检测方法对样品进行检测的交流阻抗谱测试图。
图3是应用本发明加入所述微小RNA反应前后的电化学响应信号。
图4是应用本发明所述靶微小RNA的电化学检测方法的一种靶微小RNA标准曲线图。
具体实施方式
本发明中涉及到的名词：
所述靶标微小RNA：根据不同需要所要检测的微小RNA种类。
所述茎环结构包括三个部分：(1)环状区，一般为长度15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合；(2)茎干区，通常为长度5～8碱基的互补序列，茎干区通过氢键共价连接形成二级结构；(3)带电基团，本发明所述报告DNA5′端带有可以修饰到电极表面的基团或分子(如巯基，氨基，生物素，抗生物素等)，报告DNA3′端带有电信号分子。
所述引物DNA：是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
所述DNA聚合酶：是细胞复制DNA的重要作用酶，以DNA为复制模板，从将DNA由5′端点开始复制到3′端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、d NTP等的情况下)及其相辅的活性。
本发明涉及三组核酸序列，单链报告DNA(信标DNA)，阻塞DNA(阻断DNA)和引物DNA。其中，报告DNA末端一端带有可以修饰到电极表面的基团，(如巯基，氨基等)另一端则带有电信号分子，且该报告DNA序列可以形成颈环结构。阻塞DNA为报告DNA的互补序列，同时其中有一段可以与靶标微小RNA分子互补配对。
本发明提供一种靶标微小RNA的电化学检测方法，包括以下步骤：如图1所示：
步骤一 固定在工作电极表面的报告DNA与阻塞DNA形成双链a，打开报告DNA的茎环结构；
步骤二 靶标微小RNA与双链a中的阻塞DNA结合，形成双链b，使阻塞DNA从工作电极表面脱离，报告DNA自发形成茎环结构；
步骤三 引物DNA与双链b中阻塞DNA末端序列结合，形成双链c，同时将靶标微小RNA置换下来；
步骤四 被置换下来的靶标微小RNA又重新回到工作电极表面，与其他的工作电极表面的双链a发生反应；
步骤五 经过上述N次循环反应后，工作电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，工作电极表面电信号会越来越强，从而实现对单分子微小RNA的电化学单分子检测。
所述步骤一中还包括按照靶标微小RNA种类的不同，设计不同的阻塞DNA和报告DNA分子单链，设计成的阻塞DNA要有一端序列可以与靶标微小RNA特异性结合；设计成的报告DNA分子单链包括三部分：(1)环状区，一般为长度15～30碱基的序列，能与阻塞DNA特异性结合；(2)茎干区，通常为长度5～8碱基的互补序列，茎干区通过氢键共价连接形成二级结构；(3)带电集团，本发明所述报告DNA5′端带有可以修饰到电极表面的基团(如巯基，氨基等)，报告DNA3′端带有电信号分子。利用本领域熟知的方法合成出上述符合要求的报告DNA之后，可以将报告DNA共价结合于工作电极表面，再将其与阻塞DNA形成双链a，或者可以先将报告DNA与阻塞DNA形成双链a之后，双链a再共价结合于工作电极表面。
所述步骤二中报告DNA自发形成茎环结构的同时，会将报告DNA3′端带有的电信号分子拉近工作电极，使工作电极表面产生电信号。本发明所述方法中所述检测电信号强度的电极系统是三电极系统，其中工作电极优选金电极。
所述步骤三中还包括引物DNA和DNA聚合酶的加入，引物DNA为本领域人员熟知的通用引物。根据样品的不同，检测靶标微小RNA种类不同，所对应的阻塞DNA序列也不同，选用哪一种通用引物还要根据阻塞DNA序列的不同而确定。引物DNA5′端是可连接于阻塞DNA3′端的，并且引起阻塞DNA单链分子在DNA聚合酶的作用下，形成DNA双链分子c，在合成双链分子c的同时，将靶标微小RNA重新释放出来，回到电极表面，进入循环反应。
经过上述N次循环反应后，工作电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，工作电极表面电信号会越来越强，从而实现对单分子微小RNA的电化学单分子检测。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例和附图对本发明提供的微小RNA的检测方法进行详细描述，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施，但不能将他们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：
1)根据所测样品确定靶标微小RNA序列为UAGC UUAU CAGA CUGAUGUU GA；(3′-5′)
2)根据所要检测的靶标微小RNA序列合成阻塞DNA，序列为：AGAA TCTCAACA TCAG TCTG ATAA GCAT；(3′-5′)
3)根据阻塞DNA序列合成报告DNA：Fc-TAT CAGA CTGA TGTT GAGATTCT GATA-(C)6-SH-(C)6；(3′-5′)
4)引物DNA：GAGA TTCT(3′-5′)
5)将合成的报告DNA分子溶于含有10mM Tris-HCl，10mM TCEP，1mMEDTA，0.1M NaCl的溶液中，终浓度为1μM。将金电极浸泡入上述溶液中，放置过夜。然后将金电极冲洗干净，浸泡入1mM巯基己醇中半小时；再将金电极浸泡在1μM浓度的阻塞DNA分子溶液中，静置1小时，形成双链a，打开报告DNA分子的茎环结构
6)将金电极插入样品中，样品中含有的靶微小RNA会与金电极表面的双链a发生置换反应，靶微小RNA与双链a中的第二单链DNA分子结合，形成双链b，使第二单链DNA分子从金电极表面脱离，第一单链DNA分子自发形成茎环结构；
7)在上述混合液中加入引物DNA、DNA聚合酶和dNTP，聚合反应形成双链c，同时将待检测样品中的靶微小RNA置换下来；
8)被置换下来的靶微小RNA又重新回到金电极表面，与金电极表面其他的双链a发生反应。经过上述N次循环反应后，金电极表面的茎环结构的第一单链DNA分子也越来越多，此时，金电极电化学反应会越来越强，最终达到250μA。从而实现对上述靶标微小RNA的电化学单分子的检测；
9)图2为报告DNA分子与阻塞DNA分子形成的双链a修饰的工作电极的阻抗值变化；
10)图3为加入微小RNA反应前后电流的变化；
11)图4为微小RNA浓度的对数值与峰电流大小的线性关系图。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (8)
1.一种用于微量靶标microRNA的电化学检测方法，其特征在于，包括以
下步骤：
步骤一 报告DNA打开茎环结构，与阻塞DNA形成双链a，并被固定到工作电极表面；或者报告DNA固定到电极表面后与阻塞DNA形成双链a
步骤二 靶标microRNA与双链a中的阻塞DNA结合，形成双链b，使阻塞DNA从工作电极表面脱离，报告DNA自发形成茎环结构；
步骤三 引物DNA与双链b中阻塞DNA末端序列结合，在DNA聚合酶的作用下，延伸，形成DNA双链c，同时将靶标microRNA置换下来；
步骤四 被置换下来的靶标microRNA又重新回到工作电极表面，与其他的工作电极表面的双链a发生反应；
步骤五 经过上述N次循环反应后，工作电极表面的茎环结构的报告DNA也越来越多，工作电极表面电信号会越来越强，从而实现对痕量微小RNA的电化学单分子检测。
2.如权利要求1所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，所述靶标microRNA、报告DNA、阻塞DNA和引物DNA均为单链分子。
3.如权利要求1所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，所述报告DNA连接基团和电信号分子，分别位于报告DNA分子两端。
4.如权利要求1所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，所述阻塞DNA通过与报告DNA互补配对被固定于电极表面，但不是直接连接于工作电极表面。
5.如权利要求1所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，所述阻塞DNA上有一段可以与靶标microRNA配对的碱基序列。
6.如权利要求1所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，靶标microRNA是可以重复利用的。
7.如权利要求1或3所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，所述报告DNA与阻塞DNA形成双链a时，报告DNA3′端电信号分子远离金电极表面，电信号减弱。
8.如权利要求3所述的用于靶标microRNA的电化学单分子检测方法，其特征在于，所述报告DNA在单链分子状态下形成茎环结构时报告DNA3′端带有电信号分子，靠近工作电极表面，增强电信号。
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