CN105004780A - 基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法：将电极浸入第一DNA片段分子溶液，在37℃下反应6h，再浸入巯基己醇溶液反应1h；再浸入银纳米颗粒溶液中反应1h，再浸入第二DNA片段分子的溶液中反应0.5h；配制microRNA标准液；再浸入microRNA标准液，加入第三DNA片段分子、Klenow片段和dNTPs，在37℃下反应1h；再浸入Nt.BbvCI溶液中反应1h；采用线性扫描伏安法检测，绘制标准曲线图；按上述方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。本案具有操作简单，灵敏度高，特异性强，背景信号低，适用范围广等优点。

Description

基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法
技术领域
本发明涉及microRNA的检测领域，特别涉及一种基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法。
背景技术
microRNA是一类内源性的具有基因调控功能的非编码RNA，其大小约为18～25个核苷酸。microRNA能够参与细胞内多种调控通路，包括发育、细胞增殖和凋亡、器官形成、造血过程、病毒防御、代谢等。越来越多的研究发现，microRNA在肿瘤发生发展过程中起至关重要的作用，已成为一类理想的肿瘤标记物。所以定量检测microRNA对了解其生物功能，癌症的早期诊断、新药的开发及其他涉及生物的科研项目，都具有十分重要的意义。与传统的核酸检测相比，microRNA具有的一些独有的特点，如序列短，家族序列同源性高及低丰度表达，这些特点增加了其检测的难度。目前检测microRNA的方法主要有Northern印迹分析，微阵列芯片技术，聚合酶链式反应(PCR)等。虽然Northern印迹是当前microRNA分析的标准方法，但操作繁琐，耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，而且对污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。微阵列芯片技术虽然可实现高通量，多组分同时检测，但是其制作和检测费用高；芯片上可利用的样品体积很小，导致灵敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同时优化所有待测的microRNA杂交环境，所以选择性不高。聚合酶链式反应(PCR)是现在定量检测microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，茎环引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。虽然基于聚合酶链式反应的microRNA检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，但是需要逆转录操作，增加了实验的成本和设计的复杂性。随着新的microRNA序列不断发现和对microRNA功能研究的逐步深入，对microRNA的分析检测提出了新要求。因此，开发简单直接，灵敏度高，特异性强，准确检测microRNA的分析技术仍然是一个挑战。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，此法具有操作简单，灵敏度高，特异性强，背景信号低，适用范围广等优点。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，包括以下步骤：
步骤1)将电极浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应6小时，随后将电极浸入含0.1M的巯基己醇的溶液中，在37℃下反应1小时；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一个巯基和一个氨基；
步骤2)将电极浸入含饱和银纳米颗粒的溶液中，在37℃下反应1小时，随后将电极浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应0.5小时；其中，所述第二DNA片段分子能够与所述第一DNA片段分子进行碱基互补配对；
步骤3)分别配制至少四种不同浓度的microRNA标准液；
步骤4)将电极浸入microRNA标准液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5单位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反应1小时；所述第二DNA片段分子能够与游离态的microRNA发生反应形成杂交体，所述第三DNA片段分子能够通过链置换反应将microRNA从该杂交体中再次解离出来，使microRNA回到游离态，起始新一轮的杂交与链置换反应；
步骤5)将电极浸入100μL浓度为0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反应1小时；
步骤6)取出电极，将其作为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为对电极、0.1M的氯化钾溶液为电解液，采用线性扫描伏安法进行检测，将得到的电信号与microRNA标准液的浓度关系绘制成标准曲线图；
步骤7)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入待测液中，按步骤4)～6)的方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。
优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，所述线性扫描伏安法的扫速为100mV/s。
优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，所述microRNA标准液的浓度不超过10nM。
优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，在步骤1)开始前，对电极进行预处理，具体包括：将电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，所述水虎鱼溶液的配方为98％硫酸：30％双氧水＝3:1；使用5000目砂纸分别与粒径为1μm、0.3μm、0.05μm大小的氧化铝浆对电极进行打磨，随后将电极放入乙醇中超声5分钟，再放入纯水中超声5分钟，随后将电极放入50％硝酸中浸泡30分钟，最后在0.5M硫酸中进行清洗。
优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，所述电极为金电极。
优选的是，所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其中，所述银纳米颗粒通过以下方法制得：配制含0.25mM硝酸银与0.25mM柠檬酸三钠的混合溶液，配制10mM的硼氢化钠溶液，将100mL混合溶液与3mL硼氢化钠溶液混合，并剧烈搅拌30分钟；静置过夜后，通过离心得到银纳米颗粒。
本发明的有益效果是：本案提供的检测方法操作简单，灵敏度高，特异性强，背景信号低，适用范围广；引入了DNA信号探针、DNA阻碍探针和DNA引物，并通过在电极表面的杂交反应、恒温链置换反应及核酸酶降解反应，对microRNA起始的信号进行有效放大，最终实现了对极低浓度microRNA的检测，并获得了极小的线性范围。
附图说明
图1为本案提及的针对待测液中microRNA的检测原理图。(图中，1:银纳米颗粒；2：Klenow fragment；3：Nt.BbvCI；4：DNA阻碍探针；5：DNA信号探针；6：microRNA；7：DNA引物)
图2为本案一实施例的对不同浓度的microRNA的线性扫描伏安图。
图3为本案一实施例的microRNA检测的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案提及的基于恒温反应的对待测液中microRNA的检测方法，包括以下步骤：
步骤1)将电极浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应6小时，随后将电极浸入含0.1M的巯基己醇的溶液中，在37℃下反应1小时；其中，第一DNA片段分子是一种DNA信号探针，它需要含有至少一个巯基和一个氨基；巯基可以通过与电极金属表面的共价作用修饰到电极表面，而DNA信号探针上的巯基也不能完全覆盖住整个电极表面，因此需要将电极再次进入到巯基己醇溶液中去，以使得巯基己醇的中的巯基可以填满电极表面上没有DNA片段分子的位置，这样做的目的是可以控制电极表面DNA分子的形态，从而可以降低背景信号，增加检测的灵敏度和电信号的精确度。
步骤2)将电极浸入含饱和银纳米颗粒的溶液中，在37℃下反应1小时，随后将电极浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应0.5小时；其中，第二DNA片段分子是一种DNA阻碍探针，它能够与第一DNA片段分子进行碱基互补配对；银纳米颗粒能与第一DNA片段分子上的氨基反应，从而将银纳米颗粒固定到电极表面，第二DNA片段分子与第一DNA片段分子进行碱基互补配对后，在电极表面形成双链DNA，该双链DNA可以被切刻内切酶(Nt.BbvCI)识别并切割，电极表面的银纳米颗粒会游离到溶液中去，从而在进行电化学检测时无法得到银纳米颗粒的溶出电流峰。而如果在酶切之前，溶液中存在microRNA，通过竞争杂交，microRNA会优先与DNA阻碍探针杂交，从而使电极表面的DNA信号探针由双链状态恢复为单链，无法被Nt.BbvCI切割，银纳米颗粒保留在电极表面，在后续的电化学检测中就能够产生相应的电信号。
步骤3)分别配制至少四种不同浓度的microRNA标准液；
步骤4)将电极浸入microRNA标准液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5单位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反应1小时；第三DNA片段分子是一种DNA引物，第二DNA片段分子与游离态的microRNA发生反应形成杂交体，第三DNA片段分子能够与杂交体进一步杂交，并引发链置换反应，将microRNA从该杂交体中再次解离出来，使microRNA回到游离态，而该恢复游离态的microRNA又可继续参与下一个循环反应，不断地将电极表面的双链DNA解离成单链。但需要注意的是，在单位时间内，microRNA将电极表面的双链DNA解离成单链的数量是固定的，例如：每个microRNA在1min内能解链1个双链，那么反应1小时，就能解链60个双链，因此在检测时，只要严格的统一固定步骤4)的反应时间，那么就能固定microRNA的解链速率，从而获得的标准曲线的精确度将不受影响。Klenow片段又名Klenowfragment，是一种DNA聚合酶的片段，亦称克列诺酶。dNTPs表示三磷酸碱基脱氧核苷酸。nmol＝10-9mol。
步骤5)将电极浸入100μL浓度为0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反应1小时；Nt.BbvCI是一种切刻内切酶。步骤5)的作用是将剩下的双链DNA全部切割，从而保证不干扰由microRNA解链后的单链DNA上的银纳米颗粒所产生的电信号精度。
步骤6)取出电极，将其作为工作电极，以Ag/AgCl(3M)为参比电极、铂丝电极为对电极、0.1M的氯化钾溶液为电解液，采用线性扫描伏安法进行检测，将得到的电信号与microRNA标准液的浓度关系绘制成标准曲线图；
步骤7)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入待测液中，按步骤4)～6)的方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。
作为本案另一实施例，其中，线性扫描伏安法的扫速为100mV/s，通过研究表面，在该扫速下，可以获得更加稳定的电信号。
作为本案另一实施例，其中，microRNA标准液的浓度不超过10nM。由于在绝大多数情况下，待测液中的microRNA浓度极低，因此本方案也是针对对极低浓度的microRNA检测而开发出来的，从检测精度的角度去考量，microRNA标准液的浓度应优选不超过10nM。但这不代表本案提及的技术方案不能检测大于10nM的microRNA浓度，采用本技术方案即便是对大于10nM的microRNA浓度进行检测，也依然具有很高的精确度和灵敏度，只是当对不超过10nM的microRNA浓度进行检测时，其精度和灵敏度更高。
作为本案另一实施例，其中，在步骤1)开始前，对电极进行预处理，预处理的目的是提高电极的修饰效果，降低电极表面的反应活化能，使电极更加积极的参与反应并形成牢固稳定的键合作用力；具体包括：将电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，水虎鱼溶液的配方为98％硫酸：30％双氧水＝3:1；此步骤为出去电极表面的氧化物及不稳定杂质。使用5000目砂纸分别与粒径为1μm、0.3μm、0.05μm大小的氧化铝浆对电极进行打磨，此步为增加电极表面的光洁度，提高电极表面金属纯度，增加电极参与反应的活跃度。随后将电极放入乙醇中超声5分钟，再放入纯水中超声5分钟，随后将电极放入50％硝酸中浸泡30分钟，最后在0.5M硫酸中进行清洗，以充分除去各类顽固的杂质体。
作为本案另一实施例，其中，电极为金电极。
作为本案另一实施例，其中，所用银纳米颗粒通过以下方法制得：配制含0.25mM硝酸银与0.25mM柠檬酸三钠的混合溶液，配制10mM的硼氢化钠溶液，将100mL混合溶液与3mL硼氢化钠溶液混合，并剧烈搅拌30分钟；静置过夜后，通过离心得到银纳米颗粒。通过重悬可获得饱和的银纳米颗粒溶液。
采用本案的方法可实现70aM浓度的microRNA检测上限，线性范围为1fM～1pM。(pM＝10-12mol/L，fM＝10-15mol/L，aM＝10-18mol/L)
图2和图3为本案一实施例的检测结果，该实施例中所用电极为金电极，所用的DNA、RNA序列为：
表1
图2为对不同浓度的microRNA的线性扫描伏安图，说明了随着microRNA浓度的增加，在经过microRNA介导的链置换反应后，电极表面的双链DNA大幅减少，而Nt.BbvCI只能够特异性地识别双链DNA，并将其中标记有银纳米颗粒信号分子的单链DNA切断，从而使得电极表面的银纳米颗粒的减少控制在很小的范围内，得到更高的线性伏安峰。
图3为线性伏安峰电流值与microRNA浓度的关系，说明了在1fM～1pM的范围内，峰电流值与microRNA浓度的对数呈线性相关。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，包括以下步骤：
步骤1)将电极浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应6小时，随后将电极浸入含0.1M的巯基己醇的溶液中，在37℃下反应1小时；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一个巯基和一个氨基；
步骤2)将电极浸入含饱和银纳米颗粒的溶液中，在37℃下反应1小时，随后将电极浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应0.5小时；其中，所述第二DNA片段分子能够与所述第一DNA片段分子进行碱基互补配对；
步骤3)分别配制至少四种不同浓度的microRNA标准液；
步骤4)将电极浸入microRNA标准液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5单位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反应1小时；所述第二DNA片段分子能够与游离态的microRNA发生反应形成杂交体，所述第三DNA片段分子能够通过链置换反应将microRNA从该杂交体中再次解离出来，使microRNA回到游离态，起始新一轮的杂交与链置换反应；
步骤5)将电极浸入100μL浓度为0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反应1小时；
步骤6)取出电极，将其作为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为对电极、0.1M的氯化钾溶液为电解液，采用线性扫描伏安法进行检测，将得到的电信号与microRNA标准液的浓度关系绘制成标准曲线图；
步骤7)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入待测液中，按步骤4)～6)的方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。
2.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述线性扫描伏安法的扫速为100mV/s。
3.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述microRNA标准液的浓度不超过10nM。
4.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，在步骤1)开始前，对电极进行预处理，具体包括：将电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，所述水虎鱼溶液的配方为98％硫酸：30％双氧水＝3:1；使用5000目砂纸分别与粒径为1μm、0.3μm、0.05μm大小的氧化铝浆对电极进行打磨，随后将电极放入乙醇中超声5分钟，再放入纯水中超声5分钟，随后将电极放入50％硝酸中浸泡30分钟，最后在0.5M硫酸中进行清洗。
5.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述电极为金电极。
6.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述银纳米颗粒通过以下方法制得：配制含0.25mM硝酸银与0.25mM柠檬酸三钠的混合溶液，配制10mM的硼氢化钠溶液，将100mL混合溶液与3mL硼氢化钠溶液混合，并剧烈搅拌30分钟；静置过夜后，通过离心得到银纳米颗粒。
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