CN107208140B - 通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法 - Google Patents

通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107208140B
CN107208140B CN201580072272.5A CN201580072272A CN107208140B CN 107208140 B CN107208140 B CN 107208140B CN 201580072272 A CN201580072272 A CN 201580072272A CN 107208140 B CN107208140 B CN 107208140B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
target
polymerase
aptamer
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580072272.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107208140A (zh
Inventor
朴铉圭
朴基洙
李昶烈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Original Assignee
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST filed Critical Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Publication of CN107208140A publication Critical patent/CN107208140A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107208140B publication Critical patent/CN107208140B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature

Abstract

本发明涉及使用由靶材料调节的核酸聚合酶活性检测和量化生物材料的方法，且更具体地涉及用于检测或量化生物材料的方法，所述方法能够以高灵敏性检测和量化核酸、蛋白、小分子材料、生物活性材料(酶活性)等，所述检测和量化根据特异性核酸是否特异性结合的DNA聚合酶的活性变化实现，所述特异性核酸与所制备的DNA适体形成复合物以包含特异性识别所述特异性核酸的单链DNA。本发明可提供用于检查生物材料的方法，所述方法能够无标记且灵敏地检测和量化靶核酸、靶蛋白、靶小分子材料、靶酶活性等，所述检测和量化通过由靶材料诱导的DNA适体的结构变化调节聚合酶的活性来实现。

Description

通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化 生物材料的方法
技术领域
本发明涉及使用由靶分子控制的核酸聚合酶活性检测和量化生物分子的方法，且更具体地涉及用于检测或量化生物分子的方法，其可以高灵敏性检测和量化核酸、蛋白、小分子物质、生理活性物质(酶活性)等，所述检测或量化以由特异性核酸的特异性结合引起的DNA聚合酶活性的变化为基础，所述特异性核酸与所制备的DNA适体(aptamer)形成复合物适体以包含特异性识别所述特异性核酸的单链DNA。
背景技术
基于核酸的检测技术在疾病诊断、药物检测、环境监测和刑事调查中起重要的作用，且对于具有出色灵敏性和特异性并便于使用的新型检测技术存在持续的需求。已在现有技术中常规使用的基于核酸的检测技术基于为U形DNA探针的分子信标(molecularbeacon)，所述U形DNA探针用荧光团和淬灭剂标记。该技术包括确认荧光信号是否由分子信标的构象变化产生，所述分子信标的构象变化由靶核酸的存在导致(Tyagi et al.,Naturebiotechnology,14:303-308,1996；Masuko et al.,Nucleic Acids Research,26:5409-5416,1998)。由于该技术可迅速分析靶核酸而无需分离核酸，其被广泛使用，且已开发了多种类型的基于分子信标的核酸分析技术(Song et al.,Angewandte Chemie-International Edition,48:8670-8674,2009；Wu et al.,Biosensors&Bioelectronics,26:3870-3875,2011；Yeh et al.,Nano Letters,10:3870-3875,2011)。然而，上述基于分子信标的分析技术具有的不足在于，由于靶核酸和分子信标以1:1的比率反应以生成荧光信号，难以实现较高的灵敏性。
近年来，出于克服该问题并开发具有出色灵敏性的检测传感器的目的，已对使用酶作为工具用于信号放大做出了尝试。典型的实例包括其中酶以检测探针标记用于检测靶核酸的系统，且其中引入了抑制剂(Gianneschi et al.,Angewandte Chemie-International Edition,46:3955-3958,2007；Saghatelian et al.,Journal of theAmerican Chemical Society,125:344-345,2003；Pavlov et al.,Journal of theAmerican Chemical Society,127:6522-6523,2005；Niemeyer et al.,AngewandteChemie-International Edition,49:1200-1216,2010)。在该系统中，通过与检测探针的杂交，靶核酸的存在阻断抑制剂的抑制功能，且恢复的酶活性生成高荧光信号。然而，该技术具有的不足在于，其需要使用抑制剂标记酶的步骤，耗时长且需要很多技巧。此外，其不足还在于标记操作本身可能引起酶构象的变化从而降低酶的活性。此外，该技术具有的局限在于，其难以用作用于检测多种靶核酸的通用技术，这是由于其需要为每种靶核酸制备酶-抑制剂复合物。因此，需要开发无标记的基于酶的技术用于检测多种靶核酸。
因此，本发明的发明人付出大量的努力以克服现有技术中存在的上述问题并建立了高度灵敏的基于酶的检测和量化系统，其无需使用抑制剂标记且其可普遍用于检测和量化多种靶核酸。结果是，本发明的发明人发现了使用包含特异性识别靶核酸的单链DNA的DNA适体以选择性和精确的方式实现了下述：(1)以关闭(switch-off)模式检测和量化靶核酸；(2)以开启(switch-on)模式检测和量化靶核酸；(3)以开启模式检测和量化靶分子；(4)以开启模式检测和量化靶BER酶的活性；和(5)以开启模式检测和量化靶核酸酶，由此完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的主要目的是提供使用DNA适体检测和量化靶核酸的方法，所述DNA适体包含特异性识别靶核酸的单链DNA。
本发明的另一目的是提供使用适体检测和量化靶核酸的方法，所述适体包含与阻断剂核酸(blocker nucleic acid)互补的单链DNA，所述阻断剂核酸具有与靶核酸互补的序列。
本发明的另一目的是提供使用适体检测和量化靶分子的方法，所述适体包含与阻断剂DNA(blocker DNA)互补的单链DNA，所述阻断剂DNA特异性地识别靶分子且具有与靶分子结合的序列。
本发明的另一目的是提供使用适体检测和量化靶BER(碱基切除修复(BaseExcision Repair))酶活性的方法，所述适体包含与阻断剂核酸互补的单链DNA，所述阻断剂核酸具有特异性针对靶BER(碱基切除修复)酶的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供使用适体检测和量化靶核酸酶活性的方法，所述适体包含与阻断剂核酸互补的单链DNA，所述阻断剂核酸具有特异性针对靶核酸酶的核苷酸序列。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含适体和检测样品的混合物，并使所述核酸聚合酶与所述混合物反应以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合，所述适体含有特异性识别所述靶核酸的单链核酸，且所述检测样品推测可能(suppose)包含所述靶核酸，(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸(primer extension)反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。
本发明还提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能(presume)包含所述靶核酸的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。
本发明还提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化所述靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶分子的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性识别并与结合所述靶分子的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶分子。
本发明还提供使用由BER(碱基切除修复)酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶BER(碱基切除修复)酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶BER酶的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性针对靶BER酶的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶BER(碱基切除修复)酶的活性。
本发明还提供使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶核酸酶的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性针对所述靶核酸酶的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸酶活性。
附图简述
图1是显示靶DNA诱导的DNA聚合酶活性开关和使用TaqMan探针分析所述开关的原理的示意图。具体地，图1是显示基于DNA适体检测和量化靶核酸的原理的示意图，所述DNA适体特异性地与Taq DNA聚合酶结合以抑制酶的活性。
图2显示了测试靶DNA诱导的DNA聚合酶活性开关可行性的结果。具体地，图2显示了表明经设计以包含多种单链核苷酸序列的DNA适配体通过与互补的靶核酸结合抑制聚合酶活性的实验结果。(a)在引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。(b)引物延伸反应200分钟后荧光信号的变化。此处，F200和F0分别代表引物延伸反应200分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。NC：无聚合酶的样品，PC：包含聚合酶的样品，(1)：通过将作为阳性对照的原始DNA适体添加至PC获得的样品，(#,a)：通过仅将适体添加至PC而无靶核酸获得的样品，和(#,p)：通过将靶核酸和适体添加至PC获得的样品。在该实验中使用的聚合酶、DNA适体和靶核酸的终浓度分别为5.5nM、100nM和100nM。
图3显示通过应用由靶核酸(示于图2中)对聚合酶活性的控制用于检测和量化脲(解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)，一种引起性传播疾病的病原体)获得的实验结果。(a)引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。(b)引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。此处，F50和F0分别代表引物延伸反应50分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。(c)PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)图像，NC：无聚合酶的样品，PC：包含聚合酶的样品，(1)：通过仅将脲特异性适体添加至PC而无互补的脲靶核酸获得的样品，(2)：通过将互补的脲靶核酸和脲特异性适体添加至PC获得的样品，和(3)：通过将非互补的衣原体靶核酸和脲特异性适体添加至PC获得的样品。该实验中使用的聚合酶、DNA适体和靶核酸的终浓度分别为5.5nM、200nM和100nM。
图4显示测量本发明用于检测和量化脲靶DNA的系统的灵敏性的结果。具体地，图4显示测量基于通过实验确定的最佳条件添加不同浓度的脲DNA时发生的荧光信号的结果。(a)引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。不同浓度的脲靶DNA存在下将脲特异性适体添加至包含聚合酶的样品。(b)不同浓度的脲靶DNA存在下引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。F50和F0分别代表引物延伸反应50分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。(b)中的插图：显示在脲靶DNA的浓度(0-10nM)引物延伸反应50分钟后荧光强度的变化的线形图。该实验中使用的聚合酶和DNA适体的终浓度分别为5.5nM和200nM。
图5显示测量本发明用于检测和量化衣原体靶DNA的系统的灵敏性的结果。具体地，图5显示表明用于检测和量化靶DNA的新开发的系统可普遍用于检测和量化多种靶DNA的结果。(a)引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。不同浓度的衣原体靶DNA存在下，将衣原体特异性适体添加至包含聚合酶的样品。(b)不同浓度的衣原体靶DNA存在下引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。此处，F50和F0分别代表引物延伸反应50分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。(b)中的插图：显示在衣原体靶DNA的浓度(0-10nM)引物延伸反应50分钟后荧光强度的变化的线形图。该实验中使用的聚合酶和DNA适体的终浓度分别为5.5nM和200nM。
图6是显示靶DNA诱导的聚合酶活性开关和使用TaqMan探针分析所述开关的原理的示意图。具体地，图6是显示通过引入阻断剂DNA检测和量化靶DNA的原理的示意图，从而除了如上文所述实施的关闭模式(信号关闭模式)之外，实施了以开启模式(信号开启模式)操作的本发明。
图7显示了使用开启系统检测和量化脲靶DNA的结果。具体地，图7显示了在经设计以开启模式(信号开启模式)操作的靶DNA检测和量化系统中由靶DNA控制聚合酶活性的实验结果。(a)将不同浓度的脲特异性阻断剂DNA添加至包含聚合酶和DNA适体的样品。(b)将下述添加至包含DNA聚合酶的样品：游离的DNA适体(1)、或脲特异性阻断剂DNA存在下的DNA适体(2)、或具有互补的脲靶DNA的脲特异性阻断剂DNA存在下的DNA适体(3)、或具有非互补的衣原体靶DNA的脲特异性阻断剂DNA存在下的DNA适体(4)。(c)引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。将不同浓度的脲靶DNA添加至包含DNA聚合酶和DNA适体的样品，所述DNA适体与脲特异性阻断剂DNA结合。(d)不同浓度的脲靶DNA存在下引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。(d)中的插图：显示在脲靶DNA的浓度(0-20nM)引物延伸反应50分钟后荧光强度的变化的线形图。该实验中使用的聚合酶、DNA适体和脲特异性阻断剂DNA的终浓度分别为5.5nM、200nM和20nM。
图8是显示靶分子诱导的DNA聚合酶活性开关和使用TaqMan探针分析所述开关的原理的示意图。
图9是显示UDG靶标酶诱导的DNA聚合酶活性开关和使用TaqMan探针分析所述开关的原理的示意图。
图10显示了测试UDG靶标酶诱导的DNA聚合酶活性开关可行性的结果。具体地，图10显示了使用经设计以特异性响应UDG的DNA适体测试UDG对DNA聚合酶活性的影响的结果适体。(a)引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。(b)引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。此处，F50和F0分别代表引物延伸反应50分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。将DNA聚合酶添加至包含下述的样品：UDG适体(1)，或UDG阻断剂存在下的UDG适体(2)，或具有UDG的UDG阻断剂存在下的UDG适体(3)，或对照UDG阻断剂存在下的UDG适体(4)，或具有UDG的对照UDG阻断剂存在下的UDG适体(5)。在该实验中使用的聚合酶、UDG适体、UDG阻断剂和UDG的终浓度分别为5.5nM、200nM、10nM和0.5U/mL。
图11显示了测量本发明用于检测和量化UDG靶标酶的系统的灵敏性的结果。具体地，图10显示了测量基于通过上述实验确定的最佳条件添加不同浓度的UDG时发生的荧光信号的结果。(a)引物延伸反应过程中TaqMan探针荧光强度的变化。将不同浓度的UDG添加至包含UDG适体和UDG阻断剂的UDG检测探针样品。(b)不同浓度的UDG存在下引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。此处，F50和F0分别代表引物延伸反应50分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。(b)中的插图：显示在UDG的浓度(0-0.3U/mL)引物延伸反应50分钟后荧光强度的变化的线形图。该实验中使用的聚合酶、UDG适体和UDG阻断剂的终浓度分别为5.5nM、200nM、10nM和10nM。
图12显示了测试本发明用于检测和量化UDG靶标酶的系统的特异性的结果。(b)引物延伸反应50分钟后荧光信号的变化。此处，F50和F0分别代表引物延伸反应50分钟和0分钟后TaqMan探针的荧光强度。将DNA聚合酶添加至包含下述的样品：空白(1)、UDG(2)、hAAG(3)、hOGG1(4)、Fpg(5)、BamHI(6)、Exo I(7)和λ核酸外切酶(8)。该实验中使用的聚合酶、UDG适体、UDG阻断剂、UDG和另一种酶的终浓度分别为5.5nM、200nM、10nM、0.5U/mL和5U/mL。
用于实施本发明的最佳模式
在本发明中，建立了高度灵敏的基于酶的检测和量化系统，其无需使用抑制剂标记且可普遍用于检测和量化多种靶DNA。在本发明中，引入了实施DNA延伸反应的Taq DNA聚合酶和与Taq DNA聚合酶特异性结合以抑制DNA聚合酶活性的DNA适体(Dang et al.,Journal of Molecular Biology,264:268-278,1996；Lin et al.,Journal of MolecularBiology,271:100-111,1997；Yakimovich et al.,Biochemistry-Moscow,68:228-235,2003)。具体地，设计了用于检测和量化靶核酸的DNA适体以包含特异性识别靶核酸的单链DNA，且可以看到的是，仅当所述单链DNA通过与靶核酸结合稳定化时，其可与TaqDNA聚合酶结合以抑制DNA聚合酶活性。
此外，还开发了通过与阻断剂DNA结合抑制聚合酶活性的DNA适体系统。由于设计了阻断剂DNA以具有与靶核酸互补的序列，靶核酸的存在从DNA适体分离阻断剂DNA。结果是，DNA适体不再抑制聚合酶活性，且因此聚合酶的特征性活性恢复。
通过核酸酶和DNA适体之间的相互作用的这种聚合酶活性的变化可通过实时测量在基于TaqMan探针的引物延伸反应过程中发生的荧光信号进行分析。本发明具有超越常规基于核酸的检测技术(Hutter et al.,Trends in Pharmacological Sciences,34:497-507,2013)的优势在于，由于识别靶核酸的部分和信号检测部分彼此分离，可基于DNA适体的单链核苷酸序列的变化分析多种靶核酸，所述DNA适体是识别靶核酸的部分，同时保持信号检测部分而无变化。此外，本发明还具有通过使用适体序列以高灵敏性检测和量化除靶核酸之外的多种生物分子和化学物质的能力，所述适体序列作为阻断剂DNA特异性识别细胞、蛋白、小分子物质等。在本发明中使用的基于TaqMan探针的信号生成技术可容易地用显色和电化学技术等替换。
在本发明中，已发现仅当DNA适体(其特异性识别Taq DNA聚合酶以抑制聚合酶活性)被修饰从而其将通过与靶核酸结合形成稳定的结构时，其可抑制聚合酶活性。基于该发现，开发了可普遍用于检测和量化多种靶核酸的新方法。目前尚未报道通过靶核酸诱导尝试的聚合酶活性控制和基于其开发的检测和量化系统，且本发明的系统具有的超越常规基于核酸的检测技术的优势在于，其可仅基于在DNA适体的单链核苷酸序列的变化检测和量化多种靶核酸，且在于可以简单的方式实施检测和量化而无需使用抑制剂标记酶。此外，本发明不仅可基于靶标控制的聚合酶活性用于检测和量化靶核酸，还可检测和量化其他生物分子和化学物质。
如本文使用的术语"核酸"意为单链或双链DNA、RNA和及其任何化学修饰物，且这样的修饰包括但不限于：骨架(backbone)修饰、甲基化、异常的碱基配对组合、5-溴-尿嘧啶的取代等，条件仅是所述修饰不干扰所选核酸的扩增。
如本文使用的术语"适体"指可以高亲和力特异性识别其靶分子的小的单链寡核苷酸。本发明中的适体一般可具有约15至约200个核苷酸的长度，但不限于此。例如，适体的长度可低于约100个核苷酸，且优选低于约80个核苷酸。可在本发明中使用的适体的长度不受具体限制，但可以是约96个核苷酸，且可通过后SELEX过程(post-SELEX process)修饰以具有20-30个核苷酸的长度。如果核苷酸总数小，则化学合成和大量生产得以改进，且成本效益提高。此外，提供了对于在活体上应用的较高稳定性和较低毒性。
本发明的适体可通过说明书的公开内容和本领域本身已知的方法化学合成。适体通常可使用SELEX方法或其改进的版本制备[例如Ellington et al.,Nature,346:818-822,1990；Tuerk et al.,Science,249:505-510,1990]。SELEX方法指鉴别特异性针对每种分子的DNA序列的方法，其通过选择和扩增对于来自随机合成的DNA或RNA的集合的特定分子具有高特异性的DNA或RNA实现(J.W.Park et al.,Chemical Communications,48(15):2071-2073,2012)。在SELEX方法中，浓缩对于靶分子具有较强结合亲和力的适体并通过增加轮数或使用竞争物质选择。因此，通过调整SELEX的轮数和/或改变竞争性条件，在一些情况中可获得具有不同结合亲和力的适体、具体不同结合模式的适体，或具有相同结合亲和力或结合模式但具有不同核苷酸序列的适体。
包含在本发明适体中的每种相同或不同的核苷酸可以是在核糖(即嘧啶核苷酸的核糖)的2′位置包含羟基基团的核苷酸(即未经取代的核苷酸)或具有在核糖2’位置由任何原子或基团取代的羟基基团的核苷酸。由任何原子或基团取代的这种核苷酸的实例包括由氢原子、氟原子或-O-烷基(例如-O-Me基团)、-O-酰基(例如-O-CHO基团)或氨基(例如-NH2基团)取代的核苷酸。本发明的适体还可以是其中在核糖的2'位置至少一个(例如1、2、3或4个)核苷酸包含羟基或任何上述原子或基团的核苷酸，例如包含至少两个(例如2、3或4个)选自下组的基团：氢原子、氟原子、羟基和甲氧基。本发明的适体还可以是其中全部核苷酸在核糖的2’位置相同地包含羟基或任何上述原子或基团，例如，选自下组的相同的基团：氢原子、氟原子、羟基和-O-Me基。
本发明的适体可以是其中每个核苷酸的糖残基(例如核糖或脱氧核糖)已经修饰以增加适体对于靶分子或靶核酸的亲和力、适体的稳定性等的一种。作为在糖残基中可修饰的位点的实例，可提到在2′-位置、3′-位置和/或4′-位置具有的氧原子由另一原子等替换的一些糖残基。作为修饰的实例，可提到氟化作用、O-烷基化(例如O-甲基化、O-乙基化)、O-芳基化、S-烷基化(例如S-甲基化、S-乙基化)、S-芳基化和氨基化(例如-NH2)。糖残基中这样的改变可通过本身已知的方法实施(参加例如Sproat et al.,Nucle.Acid.Res.19:733-738,1991；Cotton et al.,Nucl.Acid.Res.19:2629-2635,1991；Hobbs et al.,Biochemistry,12:5138-5145,1973)。
本发明的适体还可具有改变(例如化学取代)的核酸碱基(例如嘌呤或嘧啶)以增加其对于靶分子或靶核酸的亲和力。这种改变的实例包括在5-位置的嘧啶改变、在6-和/或8-位置的嘌呤改变、具有外环胺的改变、用4-硫代尿苷取代和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。
此外，包含在本发明适体内的磷酸基团可经改变以赋予对核酸酶和水解的抗性。例如，P(O)O基团可用P(O)S(硫酯)、P(S)S(二硫代酯)、P(O)NR2(酰胺酯(amidate))、P(O)R、R(O)OR’、CO或CH2(甲缩醛)或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)替换，其中R或R’的每个单元独立地为H或取代或未取代的烷基(例如甲基、乙基)。连接基团为例如-O-、-N-或-S-，且核苷酸可与相邻的核苷酸经由连接基团结合。
本发明中的改变还可包括如在3'和5'帽化(capping)的改变。改变可进一步通过对末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰基、石胆酸油基、二十二烷基、月桂酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、其他脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光物质、抗癌剂、毒素、酶、放射性物质、生物素等(参见美国专利第5,660,985和5,756,703号)。
适体与靶分子以广泛的多种结合模式结合，诸如基于磷酸基团负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键及基于核酸碱基的氢键和堆叠相互作用。具体地，以与组成性核苷酸的数目相同数目存在的基于磷酸基团的负电荷的离子键强，且与存在于蛋白正电荷表面上的赖氨酸和精氨酸结合。由于该原因，未参与与靶分子的直接结合的核酸碱基可被取代。具体而言，由于茎(stem)结构区已形成碱基对并面向双螺旋结构的内侧，核酸碱基不大可能直接与靶分子结合。因此，即使当碱基对用另一碱基对替换时，适体的活性通常并不降低。在其中未形成碱基对的结构中，诸如环(loop)结构，条件是核酸碱基未参与与靶分子的直接结合，则碱基取代是可能的。
对于核糖2′-位置的修饰，在核糖2′-位置的官能团很少直接与分子相互作用，但在多种情况中，这并无相关性，且可由另一经修饰的分子取代。因此，适体经常保持其活性，除非参与与靶分子直接结合的官能团被取代或缺失。
在本发明的实例中，作为以关闭模式用于检测和量化靶DNA的方法，实施了实验以确认经设计以便包含多种单链核苷酸序列的DNA适体与互补的靶核酸结合以抑制聚合酶活性。如图2(a)和2(b)中所示，可以看到仅当与DNA适体的单链核苷酸序列互补的靶核酸存在下，DNA适体抑制聚合酶的活性，且因此出现低荧光信号。此外，可以看到靶核酸存在下DNA适体抑制聚合酶活性的程度与原始78聚体DNA适体抑制聚合酶的程度相似。
在本发明的另一实例中，在实施的实验中，将靶核酸诱导的聚合酶活性用于检测和量化脲(解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)，一种引起性传播疾病的病原体)。如图3(a)、3(b)和3(c)中所示，可以看到仅在作为靶核酸的脲DNA存在下，经设计以与脲DNA特异性结合的DNA适体抑制聚合酶的活性。然而，当添加不与DNA适体相互作用的阴性对照衣原体(沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))DNA时，可以看到DNA聚合酶活性未受抑制并出现固有的高聚合酶活性。
在本发明的另一实例中，实施了实验以测量基于优化的条件在不同浓度添加脲DNA时存在的荧光信号。结果是，可以看到，随脲DNA的浓度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此发生荧光信号的减少。此外，可以看到的是，在0-10nM的脲DNA浓度范围荧光信号线性减少且检测极限为0.91nM。
在本发明的另一实例中，实施的实验中将以关闭模式用于检测和量化靶DNA的方法普遍用于检测和量化多种靶核酸。因此，在该实验中，设计了包含与衣原体DNA特异性结合的单链DNA的DNA适体并与不同浓度的衣原体DNA温育。如图5中所见，随衣原体DNA的浓度增加，聚合酶活性受到抑制，且结果是，发生荧光信号的减少。可以看到的是，在0-10nM的衣原体DNA浓度范围荧光信号线性减少且检测极限为1.47nM。
在本发明中使用的适体如下(下划线：保守区(SEQ ID NO:21))：
原始的DNA适体:5'-TTCT CGGT TGGT CTCT GGCG GAGC AAGA CCAG ACAA TGTA CAGT ATTG GCCT GATC TTGT GTAT GATT CGCT TTTC CC-3'(SEQ ID NO:1)
T20-适体:5'-TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT CAAT GTAC AGTA TTG-3'(SEQ ID NO:2)
随机1-适体:5'-AGTC AGTC AGTC AGTC AGTC CAAT GTAC AGTA TTG-3'(SEQ IDNO:4)
随机2-适体:5'-ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG CAAT GTAC AGTA TTG-3'(SEQ IDNO:6)
T20-适体(反向):5'-CAAT GTAC AGTA TTGT TTTT TTTT TTTT TTTT TTT-3'(SEQID NO:8)
脲特异性适体1:5'-TAGG ACGG TCAC CAGT ATTT TTAA TCAA TGTA CAGT ATTG-3'(SEQ ID NO:9)
衣原体特异性适体:5'-TACA AGCT GCAA TCCC TTTT AAGA TCAA TGTA CAGT ATTG-3'(SEQ ID NO:12)
脲特异性适体2:5'-A AAT ACTG GTGA CCGT CCTA CAAT GTAC AGTA TTG-3'(SEQID NO:14)
UDG适体:5'-TTTT AA TTTT AA TTTT CAA TGT ACA GTA TTG-3'(SEQ ID NO:18)
因此，第一方面，本发明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含适体和检测样品的混合物，并使所述核酸聚合酶与所述混合物反应以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合，所述适体含有特异性识别所述靶核酸的单链核酸，且所述检测样品推测可能包含所述靶核酸，(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。
在本发明中，所述适体的单链具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列。此外，当其与所述靶核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO:21所示的保守区。此外，所述适体具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12。
在本发明中，所述靶核酸可选自下组：A20-靶标、随机1-靶标、随机2-靶标、互补的脲-靶标1、非互补的衣原体-靶标1和互补的衣原体-靶标2，且所述核酸聚合酶可以是TaqDNA聚合酶。
在本发明中，将步骤(a)的混合物在约90℃加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后向其添加所述核酸聚合酶并进行反应。更具体地，将步骤(a)的混合物在90℃加热5分钟，且随后以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至25℃，并在25℃温育30分钟，随后向其添加核酸聚合酶并反应20分钟以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合。
在本发明中，包含所述信号生成物质的混合物可进一步包含模板核酸和TaqMan探针。
在本发明中，将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在约90°加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。更具体地，将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在90°加热5分钟，且随后以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后进行使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合的反应达60分钟，且随后与步骤(a)的反应产物混合。
在本发明中，步骤(c)可包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。此外，所述引物延伸反应在20-30℃的温度实施，且所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质。
如图1所示，根据本发明使用靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化靶核酸的方法是使用如下特性检测和量化靶核酸的方法：当其与靶核酸结合时包含单链核酸的适体形成稳定的结构，且随后与核酸聚合酶结合以降低聚合酶的活性。
如本文使用的术语"样品"指包含或推测可能包含靶核酸或靶分子的且将对其进行分析的组合物。样品可以是收集自下述一种或多种的样品：包括但不限于液体、土壤、空气、食品、废物、动物肠道和动物组织。此处，液体的实例可以是血清、血液、尿液、水、泪液、汗液、唾液、血液、血清、血浆、痰液、淋巴液和脑脊液。水的实例包括河水、海水、湖水和雨水。废物的实例包括污水、废水等。动物包括人体。此外，动物和植物组织的实例包括粘膜、皮肤、皮质、毛发、鳞屑、眼睛、舌头、脸颊、蹄、喙、鼻、脚、手、嘴、乳头、耳朵、鼻等。
在本发明的另一实例中，在靶核酸检测和量化系统(其经设计以便操作以开启模式检测和量化靶DNA的方法)中，实施了用于靶核酸控制的聚合酶活性的实验(图7)。具体地，设计了特异性识别脲DNA的阻断剂DNA，并构建了适于所述阻断剂DNA的DNA适体以实施实验。可以看到的是，随阻断剂DNA的浓度增加，聚合酶活性受到抑制。使用实验中确定为最佳的20nM的阻断剂DNA浓度()，实施了脲DNA的检测和量化。如图7(b)中所示，可以看到的是，仅当靶核酸脲DNA存在时(3)，聚合酶被活化，并出现高荧光信号。然而，当阴性对照衣原体DNA存在时(4)，聚合酶活性持续受到抑制，并出现低荧光信号。测量了在通过实验所选的条件下添加不同浓度的脲DNA时出现的荧光信号。如图7(c)和7(d)中所见，随脲DNA的浓度增加，聚合酶活性增加，且因此出现高荧光信号。此外，可以看到的是，在0-20nM的脲DNA浓度范围中荧光信号线性增加且检测极限为2.67nM。
因此，第二方面，本发明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶核酸的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸。
在本发明中，所述适体的单链具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列，且当其与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO:21所示的保守区，且所述适体具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述靶核酸可以是互补的脲-靶标2或非互补的衣原体-靶标2，且所述核酸聚合酶可以是Taq DNA聚合酶。所述引物延伸反应可在20-30℃的温度实施。
在本发明中，步骤(a)的混合物在约90℃加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后向其添加所述核酸聚合酶并进行反应。更具体地，步骤(a)的混合物在90℃加热5分钟，且随后以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至25℃，并在25℃温育30分钟，随后向其添加核酸聚合酶并反应20分钟以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合。
在本发明中，包含所述信号生成物质的混合物可进一步包含模板核酸和TaqMan探针。
在本发明中，将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在约90°加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。更具体地，将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在90°加热5分钟，且随后以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后进行使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合的反应达60分钟，且随后与步骤(a)的反应产物混合。
在本发明中，所述信号生成物质可用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质，且步骤(c)可包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。
在本发明中，所述阻断剂核酸可以是阻断剂DNA或阻断剂RNA，且所述阻断剂核酸是具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的脲特异性阻断剂。
如图6中所示，根据本发明使用靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶核酸的方法是使用如下特性检测和量化靶核酸的方法：当其与阻断剂核酸结合时包含单链核酸的适体形成稳定的结构，且随后与核酸聚合酶结合以降低聚合酶的活性。
在本发明的另一实例中，在以开启模式检测和量化UDG的方法中，如可在图10(a)和10(b)中所见，使用经设计以对UDG特异性响应的DNA适体检测UDG对聚合酶活性的影响的结果是，仅当UDG靶标酶存在时，聚合酶活性增加，且因此出现高荧光信号(3)。然而，当实施其中将包含代替尿嘧啶核碱基的胸腺嘧啶的DNA引入与DNA适体的单链区互补的阻断剂DNA的实验时，可以看到的是，聚合酶活性由DNA适体抑制，而不论UGD存在或不存在(4和5)。这表明通过UDG切割尿嘧啶核碱基在聚合酶活性的恢复中起重要的作用且UDG酶活性可基于通过UDG对尿嘧啶核碱基的切割检测和量化。
在本发明的另一实例中，实施了测量当基于通过实验确定的最佳条件以不同浓度添加UDG时出现的荧光信号的实验(图11)。结果是，可以看到，随UDG的浓度增加，聚合酶活性增加，且因此出现高荧光信号。此外，可以看到的是，在0-0.3U/mL的UDG浓度范围内荧光信号线性增加且检测极限为0.024U/mL。
在本发明的另一实例中，实施了测量新开发的系统对于分析本发明中的靶标酶的特异性的实验(图12)。从图12中的结果可以看到的是，当hAAG(人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶)(3)、hOGG1(人8-氧基鸟嘌呤DNA糖基化酶1)(4)、Fpg(甲酰氨基嘧啶-DNA糖基化酶)(5)、BamHI(6)、Exo I(7)或λ核酸外切酶(8)存在时，受到DNA适体抑制的聚合酶活性未恢复，且出现了低荧光信号。然而，当存在靶酶UDG时，DNA适体转化为包含通过尿嘧啶核碱基切割的单链的DNA适体结构，且因此聚合酶被活化并出现高荧光信号。
在本发明中使用的"靶材料"可以是选自下组的任一种：核酸、糖、脂质、蛋白、肽、适体、抗原、抗体、半抗原、低分子量材料、大分子复合物、细胞、药剂、有机化合物和无机化合物，但不限于此。此处，术语“低分子量材料”意为包括非极性低分子量化合物诸如双酚A。
因此，第三方面，本发明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶分子的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性识别并结合靶分子的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶分子。
在本发明中，所述适体的单链可具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列，且当与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO:21所示的保守区。
在本发明中，所述阻断剂核酸可以是特异性识别并结合靶分子的DNA或RNA。所述靶分子可以是选自下组的任一种：核酸、糖、脂质、蛋白、肽、适体、抗原、抗体、半抗原、低分子量材料、大分子复合物、细胞、药剂、有机化合物和无机化合物。
在本发明中，所述核酸聚合酶可以是Taq DNA聚合酶，且所述引物延伸反应在20-30℃的温度实施。所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质，且步骤(c)可包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。包含所述信号生成物质的混合物进一步包含模板核酸和TaqMan探针。
如图8所示，根据本发明使用靶分子控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶分子的方法是使用如下特性检测和量化靶核酸的方法：当其与阻断剂核酸结合时包含单链核酸的适体形成稳定的结构，且随后与核酸聚合酶结合以降低聚合酶的活性。
第四方面，本发明针对使用由BER(碱基切除修复)酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶BER(碱基切除修复)酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶BER酶的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性针对靶BER酶的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶BER(碱基切除修复)酶的活性。
在本发明中，所述适体的单链具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列，且当其与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述适体在其5’末端或3’末端可具有SEQ ID NO:21所示的保守区。所述适体可具有SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述阻断剂核酸可以是用作靶BER酶的底物的DNA。所述阻断剂核酸可以是具有SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列的UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)阻断剂，将其用作靶BER酶的底物，且所述靶BER酶可以是UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)。
在本发明中，所述核酸聚合酶可以是Taq DNA聚合酶，且所述引物延伸反应可在20-30℃的温度实施。
在本发明中，步骤(a)的混合物在约90℃加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约37℃，随后向其添加推测可能包含所述靶BER(碱基切除修复)酶的检测样品，并将获得的混合物缓慢冷却至约25℃，随后向其添加靶核酸聚合酶并进行反应。更具体地，将步骤(a)的混合物在90℃加热5分钟，且随后以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至37℃，并在37℃温育20分钟，随后向其添加推测可能包含所述靶BER(碱基切除修复)酶的检测样品且随后将获得的混合物以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至25℃，并在25℃温育5分钟，随后向其添加核酸聚合酶并在25℃反应20分钟以由此使核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合。
在本发明中，包含所述信号生成物质的混合物可进一步包含模板核酸和TaqMan探针。
在本发明中，将步骤(b)的包含所述信号生成物质的混合物在约90°加热约5分钟，且随后缓慢冷却至约25℃，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。更具体地，可将包含步骤(b)的信号生成物质的混合物在90℃加热5分钟，且随后以0.1℃/秒的速率缓慢冷却至25℃，随后在25℃进行使引物和TaqMan探针与模板结合的反应达60分钟且随后与步骤(a)的反应产物混合。
在本发明中，所述信号生成物质可用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质，且步骤(c)可包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此分析所述靶BER(碱基切除修复)酶的活性。
如图9中所示，根据本发明使用靶BER(碱基切除修复)酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶BER(碱基切除修复)酶的方法是使用如下特性检测和量化靶核酸的方法：当其与阻断剂核酸结合时含有单链核酸的适体形成稳定的结构，且随后与核酸聚合酶结合以降低靶BER(碱基切除修复)酶的活性。
第五方面，本发明涉及使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶核酸酶的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性针对所述靶核酸酶的核苷酸序列，所述适体包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；(b)将包含引物和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸酶的活性。
在本发明中，所述适体的单链可具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列，且当其与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO:21所示的保守区。
在本发明中，所述阻断剂核酸是用作靶核酸酶底物的DNA或RNA。在本发明中，所述核酸聚合酶可以是Taq DNA聚合酶，且所述引物延伸反应在20-30℃的温度实施。
在本发明中，所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质，且步骤(c)可包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此分析所述靶核酸酶的活性。包含所述信号生成物质的混合物可进一步包含模板核酸和TaqMan探针。
如图9中所示，根据本发明使用靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶核酸酶的方法是使用如下特性检测和量化靶核酸的方法：当其与阻断剂核酸结合时包含单链核酸的适体形成稳定的结构，且随后与核酸聚合酶结合以降低靶核酸酶的活性。
图1是显示靶核酸诱导的核酸聚合酶活性开关和使用TaqMan探针分析所述聚合酶活性的原理的示意图。具体地，图1是显示基于DNA适体检测和量化靶核酸的原理的示意图，所述DNA适体特异性地与Taq DNA聚合酶结合以抑制酶的活性。如果待检测和量化的靶核酸不存在，则经设计以包含单链DNA区的DNA适体将不会识别聚合酶，且因此所述聚合酶将具有固有的高活性。
然而，如果靶核酸存在，则其将与DNA适体的单链DNA区特异性结合，且由所述结合稳定化的DNA适体将与聚合酶结合以抑制所述聚合酶的活性(1，靶标识别)。如上文所述的由靶核酸控制的聚合酶活性可通过基于TaqMan探针的引物延伸反应进行分析。
如果靶核酸不存在，则TaqMan探针的切割将通过聚合酶的高活性诱导，且因此将出现高荧光信号。然而，如果靶核酸存在，则聚合酶的活性将由DNA适体抑制，且因此从TaqMan探针产生的荧光信号将减少。如上文所述，靶核酸可以容易地通过观察DNA适体的结构稳定化(由靶核酸的结合引起)和聚合酶活性的抑制和生成的荧光信号的变化(由结构稳定化引起)检测和量化。
此外，本发明具有的优势在于其可以成本有效和容易的方式分析多种靶核酸，上述方式通过仅改变DNA适体的单链核苷酸序列(其为识别靶核苷酸的部分)同时保持信号检测部分不变来实现，这是由于识别靶核酸的部分和信号检测部分彼此分离。
图6是显示通过引入阻断剂DNA检测和量化靶核酸的原理的示意图，从而除了如上文所述实施的关闭模式(信号关闭模式)之外，实施了以开启模式(信号开启模式)操作的本发明。如图6所示，如果待检测和量化的靶核酸不存在，则由阻断剂DNA稳定化的DNA适体将抑制聚合酶活性，且因此将出现低荧光信号。然而，如果靶核酸不存在，则阻断剂DNA将从DNA适体分离从而DNA适体将不再抑制聚合酶活性。结果是，聚合酶活性将增加，且将出现高荧光信号。
图8是显示根据本发明检测和量化靶分子的原理的示意图。如果使用可特异性识别细胞、蛋白、小分子物质等的适体核苷酸序列设计本发明中的阻断剂DNA，则靶分子的存在将从DNA适体分离阻断剂DNA，且聚合酶可通过其酶活性产生高荧光信号。结果是，不仅靶核酸，靶细胞、靶蛋白、靶小分子物质等也可通过控制本发明系统中阻断剂DNA的核苷酸序列进行分析。
图9是显示本发明可用于分析靶标酶活性的示意图。多种靶标酶中，将UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)选作实例，设计与包含在DNA适体中的单链DNA结合的互补阻断剂DNA以包含尿嘧啶核碱基。
因此，仅当待检测和量化的靶标酶(UDG)存在时，将出现尿嘧啶核碱基的切割，且包含(缺乏)尿嘧啶核碱基的阻断剂DNA将从DNA适体的单链区分离。获得的不稳定的DNA适体将不再抑制聚合酶，且因此聚合酶活性将增加。通过基于TaqMan探针的引物延伸反应观察增加的聚合酶活性。
如上文所述尝试的靶标酶诱导的聚合酶活性控制和在其基础上的检测和量化系统，通过仅变化DNA适体的单链区同时保持读取基于TaqMan探针的信号而无变化的过程，可有利地应用至用于分析多种靶标酶的系统。
实施例
在下文中，将参照实施例对本发明进行进一步详述。对本领域的技术人员显而易见的是，这些实施例仅出于阐述目的而不应理解为限制本发明的范围。
实施例1:以关闭模式检测和量化靶DNA的方法
反应混合物作为部分A和部分B分别制备。部分A(总体积20μL)，其由下述组成：1XTaq反应缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.3,50mM KCl,4mM MgCl2)、500μM dNTP、400nM DNA适体和不同浓度的互补的靶DNA，将部分A在90℃加热5分钟，缓慢冷却至25℃(0.1℃/秒)并在25℃温育30分钟。随后将Taq DNA聚合酶(11nM)添加至各溶液并温育20分钟。部分B(总体积20μL)，其由下述组成：1X Taq反应缓冲液、600nM模板、600nM引物和500nM TaqMan探针，将部分B在90℃加热5分钟，缓慢冷却至25℃(0.1℃/秒)并在25℃温育60分钟。将部分A和部分B彼此混合，并在C1000TM热循环仪(Bio-Rad,CA,USA)上测量荧光信号。以2分钟的时间间隔在25℃监测引物延伸反应过程中从TaqMan探针产生的荧光信号。根据实施例1的方法实施了下述实验实施例1-4。
实验实施例1
图2显示的实验结果表明经设计以包含多种单链核苷酸序列的DNA适体通过与互补的靶核酸结合抑制酶活性。下表1显示了在实验中使用的DNA核苷酸序列(下划线：保守区)。在图2(a)和2(b)中可以看到，仅当与DNA适体的单链核苷酸序列互补的靶核酸存在时，DNA适体抑制聚合酶活性，且因此出现低荧光信号(2-5)。此外，可以看到的是，靶核酸存在下DNA适体抑制聚合酶活性的程度与原始的78聚体DNA适体抑制聚合酶活性的程度相似。
表1
Figure BDA0001340193350000211
实验实施例2
图3显示通过应用图2中所示的靶核酸对聚合酶活性的控制用于检测和量化脲(解脲脲原体，一种引起性传播疾病的病原体)获得的实验结果。下表2显示了在实验中使用的DNA核苷酸序列(下划线：保守区)。如图3(a)、3(b)和3(c)中所见，仅当作为靶核酸的脲DNA存在时，经设计以与脲DNA特异性结合的DNA适体抑制了聚合酶活性(2)。然而，可以看到的是，当添加不与DNA适体相互作用的阴性对照衣原体(沙眼衣原体)时，DNA聚合酶活性未受到抑制，且出现了固有的高活性(3)。
表2
Figure BDA0001340193350000221
实验实施例3
图4显示了测量基于由实验确定的最佳条件添加不同浓度的脲DNA时出现的荧光信号的结果。可以看到的是，随脲DNA浓度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此发生荧光信号的减少。此外，可以看到的是，在0-10nM的脲DNA浓度范围荧光信号线性减少且检测极限为0.91nM。上表2显示了在实验中使用的DNA序列。
实验实施例4
图5显示的结果表明以关闭模式检测和量化靶DNA的方法可普遍用于检测和量化多种靶核酸。在该实验中，设计了包含与衣原体DNA特异性结合的单链DNA的DNA适体并允许其与不同浓度的衣原体DNA反应。下表3显示在该实验中使用的DNA序列(下划线：保守区)。如图5中所见，随衣原体DNA的浓度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此发生荧光信号的减少。此外，可以看到的是，在0-10nM的衣原体DNA浓度范围中荧光信号线性减少且检测极限为1.47nM。
表3
Figure BDA0001340193350000231
实施例2:以开启模式检测和量化靶DNA的方法
反应混合物分别作为部分A和部分B制备。部分A(总体积20μL)，其由下述组成：1XTaq反应缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.3,50mM KCl,4mM MgCl2)、500μM dNTP、400nM DNA适体、40nM阻断剂DNA和不同浓度的互补的靶DNA，将部分A在90℃加热5分钟，缓慢冷却至25℃(0.1℃/秒)并在25℃温育30分钟。随后将Taq DNA聚合酶(11nM)添加至各溶液并温育20分钟。部分B(总体积20μL)，其由下述组成：1X Taq反应缓冲液、600nM模板、600nM引物和500nMTaqMan探针，将部分B在90℃加热5分钟，缓慢冷却至25℃(0.1℃/秒)并在25℃温育60分钟。将部分A和部分B彼此混合，并在C1000TM热循环仪(Bio-Rad,CA,USA)上测量荧光信号。以2分钟的时间间隔在20-30℃(优选25℃)的聚合反应温度监测引物延伸反应过程中从TaqMan探针产生的荧光信号。根据实施例2的方法实施了下述实验实施例5。
实验实施例5
图7显示了使用开启系统检测和量化脲靶DNA的结果。具体地，图7显示了在经设计以便以开启模式(信号开启模式)操作的靶DNA检测和量化系统中通过靶DNA控制聚合酶活性的实验结果。在该实验中，设计了特异性识别脲DNA的阻断剂DNA，并构建了适于阻断剂DNA的DNA适体以实施实验。下表4显示了在该实验中使用的DNA序列(下划线：保守区)。图7(a)显示了优化引入的阻断剂DNA的浓度的结果。可以看到的是，随阻断剂DNA的浓度增加，聚合酶活性降低。使用实验中确定为最佳的20nM的阻断剂DNA浓度，实施了脲DNA的检测和量化。如在图7(b)中所见，仅当作为靶核酸的脲DNA存在时(3)，可以看到的是，聚合酶被活化，且出现高荧光信号。然而，当作为阴性对照的衣原体DNA存在时(4)，可以看到的是，聚合酶活性持续受到抑制，且出现低荧光信号。测量了在通过实验所选的条件下当添加不同浓度的脲DNA时出现的荧光信号。如图7(c)和7(d)中所见，随脲DNA的浓度增加，聚合酶活性增加，且因此出现高荧光信号。此外，可以看到的是，在0-20nM的脲DNA浓度范围中荧光信号线性增加且检测极限为2.67nM。
表4
Figure BDA0001340193350000241
实施例3:以开启模式检测和量化UDG的方法
反应混合物分别作为部分A和部分B制备。部分A(总体积20μL)，其由下述组成：1XTaq反应缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.3,50mM KCl,4mM MgCl2)、500μM dNTP、400nM UDG适体和40nM UDG阻断剂，将部分A在90℃加热5分钟，缓慢冷却至37℃(0.1℃/秒)并在37℃温育20分钟。随后，将不同浓度的UDG或其他酶(包括hAAG、hOGG1、Fpg、BamHI、ExoI和λ核酸外切酶)添加至各溶液并在37℃温育30分钟。将如上文所述温育的溶液缓慢冷却至25℃(0.1℃/秒)并在25℃温育5分钟。随后将Taq DNA聚合酶(11nM)添加至各溶液并温育20分钟。部分B(总体积20μL)，其由下述组成：1X Taq反应缓冲液、600nM模板、600nM引物和500nMTaqMan探针，将部分B在90℃加热5分钟，缓慢冷却至25℃(0.1℃/秒)并在25℃温育60分钟。将部分A和部分B彼此混合，并在C1000TM热循环仪上测量荧光信号。以2分钟的时间间隔在20-30℃(优选25℃)的聚合反应温度监测引物延伸反应过程中从TaqMan探针产生的荧光信号。根据实施例3的方法实施了下述实验实施例6-8。
实验实施例6
图10显示了使用经设计以对UDG特异性响应的DNA适体测试UDG对聚合酶活性的影响的结果。下表5显示了在该实验中使用的DNA序列。如图10(a)和10(b)中所见，仅当UDG靶标酶存在时，聚合酶活性增加，且因此出现高荧光信号(3)。然而，当实施其中将包含代替尿嘧啶核碱基的胸腺嘧啶的DNA引入与DNA适体的单链区互补的阻断剂DNA的实验时，可以看到的是，聚合酶活性由DNA适体抑制，而不论UDG的存在或不存在(4和5)。这表明通过UDG切割尿嘧啶核碱基在聚合酶活性的恢复中起重要的作用且UDG酶活性可基于通过UDG对尿嘧啶核碱基的切割检测和量化。
表5
链名称 DNA序列(5′→3′) SEQ ID NO
UDG适体 TTTT AA TTTT AA TTTT <u>CAA TGT ACA GTA TT</u>G SEQ ID NO：18
UDG阻断剂 AAAA UU AAAA UU AAAA SEQ ID NO：19
对照UDG阻断剂 AAAA TT AAAA TT AAAA SEQ ID NO：2O
实验实施例7
图11显示测量基于通过如图10中所示的实验确定的最佳条件添加不同浓度的UDG时出现的荧光信号的结果。上表5显示了在该实验中使用的DNA序列(下划线：保守区)。可以看到的是，随UDG的浓度增加，聚合酶活性增加，且因此出现高荧光信号。此外，可以看到的是，在0-0.3U/mL的UDG浓度范围中荧光信号线性增加且检测极限为0.024U/mL。
实验实施例8
图12显示了测试用于分析靶标酶的新开发的系统的特异性的结果。上表5显示了在该实验中使用的DNA序列(下划线：保守区)。如图12中的结果所见，当hAAG(人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶)(3),hOGG1(人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1)(4)、Fpg(甲酰氨基嘧啶-DNA糖基化酶)(5)、BamHI(6)、Exo I(7)或λ核酸外切酶(8)存在时，由DNA适体抑制的聚合酶活性未恢复，且出现低荧光信号。然而，当靶标酶UDG存在时，DNA适体转化为包含由尿嘧啶核碱基切割的单链的DNA适体结构，且因此聚合酶被活化且出现高荧光信号。
工业实用性
如上所述，本发明可提供用于诊断生物分子的方法，其可以无标记和灵敏的方式检测和量化靶核酸、靶蛋白、靶小分子物质、靶酶活性等，所述检测和量化由通过靶分子诱导的DNA适体的构象变化来控制聚合酶的活性实现。
尽管已参照具体特征对本发明进行了详细说明，但对本领域技术人员显而易见的是，本说明书仅针对优选的实施方案且并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同内容限定。
序列表
<110> 韩国科学技术院
<120> 通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法
<130> PF-B1867-CN
<140> PCT/KR2015/011817
<141> 2015-11-04
<150> 10-2014-0152468
<151> 2014-11-04
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 原始的DNA适体
<400> 1
ttctcggttg gtctctggcg gagcaagacc agacaatgta cagtattggc ctgatcttgt 60
gtatgattcg cttttccc 78
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T20-适体
<400> 2
tttttttttt tttttttttt caatgtacag tattg 35
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A20-靶标
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 随机1-适体
<400> 4
agtcagtcag tcagtcagtc caatgtacag tattg 35
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 随机1-靶标
<400> 5
gactgactga ctgactgact 20
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 随机2-适体
<400> 6
actgactgac tgactgactg caatgtacag tattg 35
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 随机2-靶标
<400> 7
cagtcagtca gtcagtcagt 20
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T20-适体 (反向)
<400> 8
caatgtacag tattgttttt tttttttttt ttttt 35
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脲特异性适体 1
<400> 9
taggacggtc accagtattt ttaatcaatg tacagtattg 40
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补的脲-靶标 1
<400> 10
attaaaaata ctggtgaccg tccta 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非互补的衣原体-靶标 1
<400> 11
atcttaaaag ggattgcagc ttgta 25
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衣原体特异性适体
<400> 12
tacaagctgc aatccctttt aagatcaatg tacagtattg 40
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补的衣原体-靶标
<400> 13
atcttaaaag ggattgcagc ttgta 25
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脲特异性适体2
<400> 14
aaatactggt gaccgtccta caatgtacag tattg 35
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脲特异性阻断剂
<400> 15
taggacggtc accagtattt ttaatgctga ttacttttgc 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补的脲-靶标
<400> 16
gcaaaagtaa tcagcattaa aaatactggt gaccgtccta 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非互补的衣原体-靶标
<400> 17
aaaagggatt gcagcttgta gtcctgcttg agagaacgtg 40
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UDG适体
<400> 18
ttttaatttt aattttcaat gtacagtatt g 31
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UDG阻断剂
<400> 19
aaaauuaaaa uuaaaa 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对照UDG阻断剂
<400> 20
aaaattaaaa ttaaaa 16
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适体的保守区
<400> 21
caatgtacag tattg 15

Claims (43)

1.一种使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以关闭模式检测或量化所述靶核酸的方法，其包括：
(a)添加核酸聚合酶至包含适体和检测样品的混合物，并使所述核酸聚合酶与所述混合物反应以由此使核酸聚合酶与适体-靶核酸复合物结合，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO: 21所示的保守区并且包含特异性识别所述靶核酸的单链核酸，且所述检测样品推测可能包含所述靶核酸，
(b)将包含引物、模板核酸和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和
(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸，
其中当与所述靶核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述适体的单链具有与所述靶核酸互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述适体具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9和SEQ IDNO: 12。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸选自下组：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 13。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶是Taq DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤(a)的混合物在90°C加热5分钟，且随后缓慢冷却至25°C，随后向其添加所述核酸聚合酶并进行反应。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成物质包含TaqMan探针。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其中将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在90°加热5分钟，且随后缓慢冷却至25°C，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物延伸反应在20-30°C的温度实施。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物和包含电化学官能团的物质。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号生成物质用选自以下的物质标记：发光物质。
13.一种使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶分子的方法，其包括：
(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶分子的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸具有特异性识别并结合所述靶分子的核苷酸序列，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO: 21所示的保守区并且包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；
(b)将包含引物、模板核酸和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和
(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶分子，
其中当与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述适体的单链具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述适体具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶核酸为SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸聚合酶是Taq DNA聚合酶。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述引物延伸反应在20-30°C的温度实施。
19.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(a)的混合物在90°C加热5分钟，且随后缓慢冷却至25°C，随后向其添加所述核酸聚合酶并进行反应。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述信号生成物质包含TaqMan探针。
21.根据权利要求13或20所述的方法，其中将步骤(b)中使用的包含所述信号生成物质的混合物在90°加热5分钟，且随后缓慢冷却至25°C，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与模板核酸结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物、发光物质和包含电化学官能团的物质。
23.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(c)包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此确定所述靶核酸的存在或不存在。
24.根据权利要求13所述的方法，其中所述阻断剂核酸是特异性识别并结合所述靶分子的DNA或RNA。
25.根据权利要求13所述的方法，其中所述阻断剂核酸是具有SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的脲特异性阻断剂。
26.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶分子是选自下组的任一种：核酸、糖、脂质、肽、适体、抗原、抗体、半抗原、低分子量材料、大分子复合物、细胞、药剂和无机化合物。
27.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶分子是选自有机物质。
28.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶分子是选自蛋白。
29.一种使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以开启模式检测或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：
(a)添加核酸聚合酶和推测可能包含所述靶核酸酶的检测样品至包含阻断剂核酸和适体的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述检测样品与所述混合物反应以由此使所述核酸聚合酶与适体-阻断剂核酸复合物结合，所述阻断剂核酸用作所述靶核酸酶的底物，所述适体在其5’末端或3’末端具有SEQ ID NO: 21所示的保守区并且包含与所述阻断剂核酸互补的单链核酸；
(b)将包含引物、模板核酸和信号生成物质的混合物与步骤(a)的反应产物混合，随后进行引物延伸反应；和
(c)分析步骤(b)的引物延伸反应以由此检测或量化所述靶核酸酶的活性，
其中当与所述阻断剂核酸结合时所述适体形成稳定的结构，且随后与所述核酸聚合酶结合以降低所述聚合酶的活性。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述适体的单链具有与所述阻断剂核酸互补的核苷酸序列。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述阻断剂核酸是DNA或RNA。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸聚合酶是Taq DNA聚合酶。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述引物延伸反应在20-30°C的温度实施。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述信号生成物质用选自下组的物质标记：放射性同位素、荧光物质、染料、纳米颗粒、酶、酶底物和包含电化学官能团的物质。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述信号生成物质用选自以下的物质标记：发光物质。
36.根据权利要求29所述的方法，其中步骤(c)包括检测或量化源自步骤(b)的引物延伸反应的信号以由此分析所述靶核酸酶的活性。
37.根据权利要求29所述的方法，其中所述信号生成物质包含TaqMan探针。
38.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶核酸酶是碱基切除修复酶。
39.根据权利要求29所述的方法，其中所述适体的核苷酸序列为SEQ ID NO: 18。
40.根据权利要求29所述的方法，其中所述阻断剂核酸是核苷酸序列为SEQ ID NO: 19的尿嘧啶DNA糖基化酶阻断剂，将其用作碱基切除修复酶的底物。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述碱基切除修复酶是尿嘧啶DNA糖基化酶。
42.根据权利要求38所述的方法，其中步骤(a)的混合物在90°C加热5分钟，且随后缓慢冷却至37°C，随后向其添加推测可能包含所述碱基切除修复酶的检测样品，并将获得的混合物缓慢冷却至25°C，随后向其添加靶核酸聚合酶并进行反应。
43.根据权利要求38所述的方法，其中将步骤(b)的包含所述信号生成物质的混合物在90°C加热5分钟，且随后缓慢冷却至25°C，随后使其进行反应，所述反应使所述引物和TaqMan探针与所述模板结合，且随后与步骤(a)的反应产物混合。
CN201580072272.5A 2014-11-04 2015-11-04 通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法 Active CN107208140B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0152468 2014-11-04
KR1020140152468A KR101719285B1 (ko) 2014-11-04 2014-11-04 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법
PCT/KR2015/011817 WO2016072758A1 (ko) 2014-11-04 2015-11-04 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107208140A CN107208140A (zh) 2017-09-26
CN107208140B true CN107208140B (zh) 2021-11-19

Family

ID=55909406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580072272.5A Active CN107208140B (zh) 2014-11-04 2015-11-04 通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10041111B2 (zh)
KR (1) KR101719285B1 (zh)
CN (1) CN107208140B (zh)
WO (1) WO2016072758A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190119737A1 (en) * 2016-05-17 2019-04-25 The Regents Of The University Of California Enhanced fluorescence readout and reduced inhibition for nucleic acid amplification tests
US11299739B2 (en) * 2016-06-07 2022-04-12 Cepheid Thermostable polymerase inhibitor compositions and methods
KR102108855B1 (ko) * 2017-10-30 2020-05-12 한국표준과학연구원 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도
KR20210049782A (ko) * 2018-07-03 2021-05-06 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출
KR20230080415A (ko) * 2020-09-25 2023-06-07 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 조정 가능한 기능적 안정성을 갖는 핵산 나노구조물
EP4288560A1 (en) * 2021-02-02 2023-12-13 National University of Singapore Catalytic amplification by transition-state molecular switches for direct and sensitive detection of sars-cov-2
WO2024005538A1 (ko) * 2022-06-29 2024-01-04 주식회사 제노헬릭스 블로커 핵산 처리를 포함하는 표적 rna 검출 방법
CN114990126B (zh) * 2022-08-03 2022-11-18 珠海宝锐生物科技有限公司 特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
EP1476557B1 (en) * 2002-01-31 2016-01-20 Saint Louis University A rapid and sensitive assay for the detection and quantification of coregulators of nucleic acid binding factors
KR101041106B1 (ko) * 2003-11-25 2011-06-13 한면기 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법
JP5101288B2 (ja) * 2004-10-05 2012-12-19 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー アプタマー調節される核酸及びその利用
JP5684568B2 (ja) * 2007-07-17 2015-03-11 ソマロジック・インコーポレーテッド 改善されたオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を持つアプタマーを生成するための方法
KR20090067334A (ko) 2007-12-21 2009-06-25 주식회사 씨젠 핵산 중합효소의 뉴클레아제 활성을 이용한 타깃핵산분자의 검출방법
CN101368209A (zh) * 2008-09-12 2009-02-18 青岛科技大学 一种基于核酸适体和pcr扩增来检测目标分子的方法
EP2370598B1 (en) * 2008-12-11 2017-02-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Classification of nucleic acid templates
AU2012295913A1 (en) * 2011-08-12 2014-03-13 Tagcyx Biotechnologies Production method for nucleic acid aptamer
KR101400995B1 (ko) * 2012-08-30 2014-05-29 한국과학기술원 표적물질의 결합에 의한 압타머 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법
CN105247071B (zh) * 2013-04-01 2018-11-23 基因特力株式会社 使用等位基因特异的反应性引物的核酸扩增方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10041111B2 (en) 2018-08-07
CN107208140A (zh) 2017-09-26
KR20160052297A (ko) 2016-05-12
WO2016072758A1 (ko) 2016-05-12
US20170335381A1 (en) 2017-11-23
KR101719285B1 (ko) 2017-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107208140B (zh) 通过使用由靶材料调节的核酸聚合酶的活性用于检测和量化生物材料的方法
Liu et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification
EP1972693B1 (en) Method and kit for detecting a target protein using a DNA aptamer
US9175340B2 (en) Reactivity-dependent and interaction-dependent PCR
Lu et al. Highly selective and sensitive electrochemical biosensor for ATP based on the dual strategy integrating the cofactor-dependent enzymatic ligation reaction with self-cleaving DNAzyme-amplified electrochemical detection
CN110144384B (zh) 一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用
US10577665B2 (en) Aptamers for clostridium difficile detection
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
CN103698375A (zh) 一种检测miRNA的方法
US20200340042A1 (en) In vitro selection for nucleic acid aptamers
Xue et al. Ultrasensitive fluorescence detection of nucleic acids using exonuclease III-induced cascade two-stage isothermal amplification-mediated zinc (II)-protoporphyrin IX/G-quadruplex supramolecular fluorescent nanotags
CN101835905B (zh) 靶rna的检测、定量方法和试剂盒
CN112752850A (zh) 用于蛋白质检测的数字化扩增
Wang et al. Construction of a self-directed replication system for label-free and real-time sensing of repair glycosylases with zero background
Wu et al. Highly selective and sensitive detection of glutamate by an electrochemical aptasensor
Kashefi-Kheyrabadi et al. Ultrasensitive and amplification-free detection of SARS-CoV-2 RNA using an electrochemical biosensor powered by CRISPR/Cas13a
Liu et al. Label-free and highly sensitive APE1 detection based on rolling circle amplification combined with G-quadruplex
WO2013154138A1 (ja) 分子ビーコン型プローブを用いた標的核酸の検出方法
US11231420B2 (en) Selection and optimization of aptamers to recognize ebola markers
CN114381498A (zh) 一种基于协同原位组装G-四链体DNAzyme纳米线的化学发光传感器及其应用
Zeng et al. Sensitive quantitative detection of bacterial DNA based on lysozyme signal probe and Exo III-aided cycling amplification reaction
Hong et al. MicroRNA detection using light-up aptamer amplification based on nuclease protection transcription
EP3339447B1 (en) Method for analyzing template nucleic acid, method for analyzing target substance, analysis kit for template nucleic acid or target substance, and analyzer for template nucleic acid or target substance
US20220098649A1 (en) Method for detecting polynucleotide using risc
CN117965694A (zh) 一种三维dna步行器用轨道核酸组、电化学生物传感器及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant