CN117965694A - 一种三维dna步行器用轨道核酸组、电化学生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三维DNA步行器用轨道核酸组、电化学生物传感器及其应用，属于电化学生物传感检测技术领域。本发明的轨道核酸组包括第一轨道核酸和第二轨道核酸；所述第一轨道核酸包括核糖核苷酸序列，核糖核苷酸序列的下游连接有脱氧核糖核苷酸序列，所述第一轨道核酸中的部分序列形成发卡结构，同时含有与待检测miRNA碱基互补配对的序列；所述第二轨道核酸包括脱氧核糖核苷酸序列，所述脱氧核糖核苷酸序列上游与所述第一轨道核酸核糖核苷酸序列碱基互补配对，所述第二轨道核酸中的部分序列形成发卡结构，所述脱氧核糖核苷酸序列的下游连接有信号物。利用轨道核酸组制备的生物传感器，实现了一次加入DSN驱动两次步行的信号放大策略。
Description
技术领域
本发明涉及一种三维DNA步行器用轨道核酸组、电化学生物传感器及其应用，属于电化学生物传感检测技术领域。
背景技术
微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)是一类在动物、植物和一些病毒中发现的非常重要的小分子、内源性非编码RNA，通常由18～25个核苷酸组成，在RNA沉默和基因调控中扮演着重要角色。随着对其研究的不断深入，人们发现miRNA的异常表达与人类疾病密切相关，逐渐成为疾病诊断和治疗中的重要生物标志物，可以用来提供重要的病理状态信息。
基于miRNA在生物过程中发挥的重要作用，逐渐开发出包括：实时荧光定量PCR技术、RNA印记分析、RNA芯片分析等分析技术，但是上述方法通常受限于检测的灵敏度和操作的复杂性，因此需要更加快速和精准的检测手段来满足科研和临床的需求。近年来，生物传感器常被用于miRNA检测的研究中，目前，探索高效的生物传感策略是追求高灵敏度miRNA生物传感平台的迫切需要。
随着纳米技术和生物传感技术的快速发展，基于DNAwalker(DNA步行器)的miRNA检测方法成为研究热点。DNA步行器作为典型的动态DNA纳米器件，能够沿着特定的编程DNA轨道自主移动，并帮助信号转导和放大。通常，DNAwalker由三个基本组件组成，即步行器、轨道核酸和驱动力。步行器通常是一种特殊设计的DNA链，它可以直接固定在轨道的基底上，或与其他材料组装成多足步行器。DNA轨道核酸可以与walker链杂交并作为立足点。DNA步行器的运动可以由某些形式的能量输入驱动，例如酶促反应、链置换反应和脱氧核酶催化的水解反应。行走过程可以由目标引发的反应触发，产生放大的信号，构建生物传感装置。然而，现有的DNA步行器设计在步行过程中容易出现脱轨或解离的问题，降低了检测的准确性和稳定性。
2015年，Ellington课题组首次提出了三维DNA步行器的概念，与一维或二维DNA步行器相比，三维DNA步行器克服了装载量低、货物运输效果差等问题，主要因其具备更宽广的三维行走轨迹，实现了高效的核酸部件装载释放和酶切反应。三维DNA步行器作为动态DNA纳米技术的一部分，为DNA纳米器件的发展提供了突破性思路。但是，目前三维DNA步行器在步行中主要采用驱动一次步行反应的信号放大策略，对检测灵敏度的提高有限。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种三维DNA步行器用轨道核酸组，以解决现有技术中三维DNA步行器在步行中主要采用驱动一次步行反应的信号放大策略，导致对目标检测灵敏度有限的问题。
本发明的第二个目的在于提供一种基于“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器，以解决现有技术中的基于三维DNA步行器的电化学生物传感器中，三维DNA步行器在步行中主要采用驱动一次步行反应的信号放大策略，导致对目标检测灵敏度有限的问题。
本发明的第三个目的在于电化学生物传感器在miRNA检测中的应用，以解决现有技术中miRNA检测受限于检测的灵敏度和操作复杂性的问题。
为了实现上述目的，本发明中一种三维DNA步行器用轨道核酸组的技术方案是：
一种三维DNA步行器用轨道核酸组，所述轨道核酸组包括第一轨道核酸和第二轨道核酸；
所述第一轨道核酸包括核糖核苷酸序列，核糖核苷酸序列的下游连接有脱氧核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列末尾N1个碱基与所述脱氧核糖核苷酸序列末尾N1个碱基互补配对以形成发卡结构，所述核糖核苷酸序列末尾n个碱基和所述脱氧核糖核苷酸序列前部的碱基与待检测的miRNA的碱基互补配对，所述7≤N1≤9，所述n为6或7；
所述第二轨道核酸包括脱氧核糖核苷酸序列，所述脱氧核糖核苷酸序列上游与所述第一轨道核酸核糖核苷酸序列碱基互补配对，所述脱氧核糖核苷酸序列中N2个碱基与末尾N2个碱基碱基互补配对以形成发卡结构，所述脱氧核糖核苷酸序列的下游连接有信号物，所述7≤N2≤9。
上述技术方案的有益效果在于：本发明的三维DNA步行器用轨道核酸组为开拓性发明。本发明前期研究发现，目前三维DNA步行器在步行中为驱动一次步行反应的信号放大策略，信号放大的效果有限。因此，本发明在开发了一种三维DNA步行器用轨道核酸组，轨道核酸组包括第一轨道核酸和第二轨道核酸，第一轨道核酸中引入“防滑钉”结构，所述“防滑钉”结构为与待检测miRNA(步行链)结合的一小段核糖核酸序列，双链特异性核酸酶能特异性地切割miRNA与第一轨道核酸3’端脱氧核糖核苷酸形成的RNA-DNA结构，但是不能切割miRNA与第一轨道核酸5’端核糖核苷酸形成的RNA-RNA结构，之后被释放的miRNA维护与另一第一轨道核酸杂交并触发新的酶切过程，利用DSN对核酸双链反复酶切反应的驱动下，实现了miRNA在第一轨道核酸上的自主步行运动。第二轨道核酸的部分脱氧核糖核苷酸与DSN酶切后第一轨道核酸剩余的5’端核糖核苷酸碱基互补配对，因此，经历了一次步行运动的第一轨道核酸核糖核苷酸&纳米金颗粒成为了第二次步行运动的多脚walker，DSN可以再次驱动多脚walker在第二轨道核酸上自主运动，并释放出尾部的信号物标记。本发明在一次轨道核酸中创造性地引物“防滑钉”结构，使得miRNA在第一次步行过程中能够稳定地保持与基底DNA的结合，提高了步行器的稳定性和特异性，有效减少了步行链的脱轨或解离，而且第一次步行生成的第一轨道核酸核糖核苷酸&纳米金颗粒又成为了第二次步行运动的多脚walker，在稳定的均相溶液中实现了miRNA的信号转化为多足DNA步行器的信号，并且一次加入DSN实现了两次驱动DNA步行器实现信号的放大。
具体地，本发明的三维DNA步行器用轨道核酸组在实际应用中搭配双链特异性核酸酶(DSN)。DSN是一种高效识别并酶切DNA双链或DNA/RNA杂交双链的核酸酶，对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用。
作为进一步地改进，若干条所述第一轨道核酸固定在金纳米颗粒上，经步行反应后形成多脚步行器。
作为进一步地改进，所述核糖核苷酸序列的长度不小于15bp。
上述技术方案的有益效果在于：所述核糖核苷酸序列的长度不小于15bp，能有效保证第一次步行形成的多脚walker与第二轨道核酸杂交形成的DNA/RNA杂交双链被DSN切割，以驱动第二次步行运动。
作为进一步地改进，所述第一轨道核酸中核糖核苷酸序列和所述第二轨道核酸中脱氧核糖核苷酸序列上游连接有阻隔序列。
作为进一步地改进，当待检测的miRNA为人源miRNA-141时，所述第一轨道核酸的序列为5’-SH-TTTTTTrCrGrArGrUrGrUrCrArGrUrCrCrArUrCrUTTACCAGACAGTGTTACAGATGGAC-3’，所述第二轨道核酸的序列为5’-SH-TTTTAGATGGACTGACACTCGCTATCAGACAGTGTTACGAGTGTCA-Fc-3’，其中Fc为信号物。
具体地，当待检测的miRNA为人源miRNA-141时，所述第一轨道核酸序列包括4～6个间隔序列，如SEQ ID NO.1所示的核糖核酸序列(RNA序列)和如SEQ ID NO.2所示的脱氧核糖核酸序列(DNA序列)；所述第二轨道核酸序列包括4～6个间隔序列，如SEQ ID NO.3所示的脱氧核糖核酸序列(DNA序列)。
为了实现上述目的，本发明中一种基于“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器的技术方案是：
一种基于“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器，包括金纳米颗粒、电极基底和所述的三维DNA步行器用轨道核酸组，所述金纳米颗粒上固定有所述的第一轨道核酸，所述电极基底上固定有所述的第二轨道核酸，所述第一轨道核酸中的核糖核苷酸序列末尾n个碱基构成“防滑钉”结构。
上述技术方案的有益效果在于：本发明基于“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器为开拓性发明。本发明在开发了“防滑钉”DNA步行器的同时，实现了一次加入DSN驱动两次步行反应的信号放大策略，而且通过实验证明，“防滑钉”结构能够有效的提高DNA步行器在电化学传感中信号放大的效果。
为了实现上述目的，本发明一种电化学生物传感器在miRNA检测中的应用的技术方案是：
一种电化学生物传感器在miRNA检测中的应用。
上述技术方案的有益效果在于：本发明电化学生物传感器在miRNA检测中的应用为开拓性发明。本发明从DNA步行器中的轨道核酸出发，在AuNPs上构建了“防滑钉”三维DNA步行器，实现了一次加入DSN驱动两次步行反应的信号放大策略，并利用所述DNA步行器的放大策略来提高电化学生物传感器的工作性能，提高了生物传感器的工作性能，能有效实现快速、超灵敏检测miRNA。
作为进一步地改进，(1)将待检测miRNA、双链特异性核酸酶和电化学生物传感器中第一轨道核酸进行孵育，获得第一步步行反应液；(2)将步骤(1)获得的第一步步行反应液与电化学生物传感器中第二轨道核酸进行孵育。
附图说明
图1为本发明电化学生物传感器的工作原理的流程图；
图2为本发明实施例1中不同浓度人源miRNA-141的电流响应；
图3为本发明实施例1中不同浓度人源miRNA-141的电流响应标准曲线图；
图4为本发明实施例2中“防滑钉”结构对传感器DPV信号相应的影响；
图5为本发明实施例3中电化学生物传感器为工作电极检测不同数量人乳腺癌细胞裂解液中miRNA-141表达量与标准方法(qRT-PCR)的趋势对照图；
图6为本发明实施例4中电化学生物传感器检测特异性对照图(图中1、2、3代表3个生物学平行重复)。
具体实施方式
以人源miRNA141为例，本发明的基于“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器的工作原理如图1所示，具体为：当单检测样品中目标miRNA-141存在时，通过目标miRNA-141与H1的杂交互补配对打开了H1的发卡结构，DSN可以识别miRNA-141与H1杂交的双链核酸，并且可以酶切掉杂交区域中H1脱氧核糖核苷酸的区域(与miRNA杂交的蓝色区域，RNA-DNA结合区域)，而miRNA-141和H1杂交区域的红色区域(“防滑钉”结构，RNA-RNA结合区域)则可以避免被DSN酶切。之后被释放的miRNA-141尾部与另一个H1杂交并触发新的酶切过程，通过DSN对核酸双链反复的酶切反应的驱动下，实现了walker核酸(miRNA-141)在H1轨道上的的自主运动，并释放出了H1&AuNPs上H1的RNA尾部(红色区域的“防滑钉”结构)，此时，经历了一次步行运动的H1&AuNPs成为了第二次步行运动的多脚walker。之后，H1上的RNA尾部(红色区域的“防滑钉”结构)可以与金电极表面上的H2-Fc发生双链杂交打开H2-Fc的发卡结构，由于此杂交结构达到了15bp再触发了DSN的酶切反应。与第一次步行运动同样的原理，DSN可以再次驱动多脚walker(H1&AuNPs)在H2-Fc轨道上自主运动，并释放出H2-Fc尾部的Fc标记。因此就会产生与目标物miRNA所对应的下降的二茂铁电化学信号。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明中一种三维DNA步行器用轨道核酸组、电化学生物传感器的具体实施例
实施例1
本实施例的三维DNA步行器用轨道核酸组包括包括第一轨道核酸和第二轨道核酸；所述第一轨道核酸包括核糖核苷酸序列，核糖核苷酸序列的下游连接有脱氧核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列末尾8个碱基与所述脱氧核糖核苷酸序列末尾8个碱基互补配对，并与在末端之间的脱氧核糖核苷酸序列形成发卡结构，所述核糖核苷酸序列末尾7个碱基和所述脱氧核糖核苷酸序列前部的15个碱基与待检测的miRNA碱基互补配对；所述第二轨道核酸包括脱氧核糖核苷酸序列，所述脱氧核糖核苷酸序列上游与所述第一轨道核酸核糖核苷酸序列碱基互补配对，所述脱氧核糖核苷酸序列中8个碱基与末尾8个碱基碱基互补配对，并与在末端之间的脱氧核糖核苷酸序列形成发卡结构，所述脱氧核糖核苷酸序列的下游连接有信号物。其中，第一轨道核酸(H1)的具体序列为：5’-SH-TTTTTT rCrGrArGrUrGrUrCrArGrUrCrCrArUrCrUTTACCAGACAGTGTTACAGATGGAC-3’，第二轨道核酸(H2)的具体序列为5’-SH-TTTT AGATGGACTGACACTCGCTATCAGACAGTGTTACGAGTGTCA-Fc-3’，加下划线部分为本实施例所设计的防滑钉结构，Fc为信号物二茂铁。同时基于三维DNA步行器用轨道核酸组构建电化学生物传感器，具体的制备方法及信号放大的可行性检测如下：
(1)首先用新鲜的食人鱼溶液(98％ H2SO4/30％ H2O2，体积比为3:1)清洗金电极30min，之后用超纯水清洗；然后将金电极用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉依次在麂皮上抛光处理至镜面，并且依次在乙醇和超纯水中交替进行超声清洗1min，以去除残留的氧化铝粉。接下来将金电极在0.5M H2SO4溶液中进行电化学清洗，直到出现显著、稳定且重复出现的循环伏安峰后，用超纯水超声清洗干净，氮气吹干备用。
(2)将5μL H2(0.5μM)溶液滴涂在步骤(1)处理好的金电极表面并在室温下孵育8h后，在清洗缓冲液中认真缓慢的把电极清洗干净，氮气吹干备用。
(3)将5μL 1mM MCH滴涂在步骤(2)获得的传感电极表面，并在室温下孵育30min后，在清洗缓冲液中认真缓慢的把电极清洗干净，氮气吹干备用。
(4)将不同浓度的检测目标物miRNA-141(浓度分别为：0fM、0.1fM、1fM、10fM、50fM、100fM、200fM)和DSN(0.01U/μL)加入“防滑钉”结构三维DNA步行器(H1&AuNPs)溶液中，在37℃条件下反应2h充分进行第一步的步行反应。其中，“防滑钉”结构三维DNA步行器(H1&AuNPs)的制备方法为：将H1与AuNPs以200的摩尔比在振荡器中混合12h(100rpm)后，将0.1M PBS(0.1M Na2HPO4、0.1M KH2PO4、1M NaCl，pH 7.4)分五次缓慢的添加到上述混合物中，使最终浓度为含0.1M NaCl的10mM PB的混合溶液。之后继续在37℃下震荡孵育40h。最后，将H1&AuNP复合物离心(12000rpm，15min，4℃)，在超纯水中反复洗涤三次，然后分散在10mM PBS(10mM Na2HPO4、10mM KH2PO4、0.1M NaCl，pH 7.4)中，保存在4℃条件下以备使用。
(5)将步骤(4)完成第一步步行反应的混合液滴涂在步骤(3)处理好的传感电极表面，并在37℃下孵育70min后，在清洗缓冲液中认真缓慢的把电极清洗干净，氮气吹干备测。
(6)步骤(5)所得电极在电化学检测液中进行差分脉冲伏安法扫描。
检测结果如图2和图3所示。由图2中可以看出，在0.1fM-200fM的检测范围内，随着目标物(miRNA141)浓度的增大，电化学信号减小，电流响应值减小；由图3可以看出，在上述目标物浓度的范围内，电流响应呈良好的线性关系。DPV的信号强度与miRNA浓度在0.1fM到200fM范围内呈现良好的线性关系，线性方程为：Ip＝0.99961-0.30861logC，相关系数(R)为0.99516，该传感器的检测限为0.068fM。
本实施例中使用的核酸序列如表1所示。
表1
其中，H1中黑色框部分为“防滑钉”结构，加下划线部分碱基互补配对，并与在两条下划线之间的脱氧核糖核苷酸序列形成发卡结构；H2中黑色框部分与H1中核糖核苷酸碱基互补配对，加下划线部分碱基互补配对，并与在两条下划线之间的脱氧核糖核苷酸序列形成发卡结构，Fc为信号物二茂铁。
上述操作步骤中使用的溶液组成及制备过程如下：
轨道核酸固定液(即上述步骤(2)中的H2(0.5μM)溶液)的制备：将预处理得到轨道核酸10μM溶液进行退火处理反应：退火过程为将溶液加热至85℃保持10min，然后温度以1℃/min的速度缓慢降低至室温。之后再将轨道核酸溶液在TNaK缓冲液中以10mM TCEP浓度在暗处预处理1.5h。
MCH溶液的制备：取适量MCH加入无水乙醇至100mM，之后用DECP水稀释成1mM的MCH封闭剂，冰箱4℃保存待用。
步行反应缓冲液(两次步行反应的缓冲液均用的这个缓冲)：DSN Master Buffer：50mM Tris-HCl，pH 8.0；5mM MgCl2；1mM DTT，冰箱4℃保存待用。
电化学检测液：0.1M NaH2PO4；0.1M K2HPO4；0.1M KCl；0.1M NaClO4；pH 7.4，冰箱4℃保存待用。
清洗缓冲液：pH 7.4，0.01M的Tris-HCl缓冲液。
TNaK缓冲液：20mM Tris，140mM NaCl，5mM KCl，pH 7.5。
上述操作步骤中测量采用CHI 650A电化学工作站(中国上海辰化仪器公司)进行。采用铂丝电极和饱和甘汞参比电极电极分别作为辅助电极和参比电极，裸的或修饰的金电极作为工作电极构建三电极系统进行实验。
实施例2
本实施例对三维DNA步行器中“防滑钉”结构的设计是否能够辅助放大电化学传感器信号也进行了验证，同时合成了含有“防滑钉”结构和不含有“防滑钉”结构的两种第一轨道核酸，采用实施例1中的方法构建了两种电化学生物传感器，并对其信号放大效果进行比较。检测结果如图4所示，由图中可以看出，当miRNA-141和DSN同时存在的条件下，含有“防滑钉”结构的DNA步行器的电化学生物传感器(红色)比不含“防滑钉”结构的DNA步行器的电化学生物传感器(灰色)出现了更弱的二茂铁电流信号，这充分证明“防滑钉”结构的设计可以起到有效引起传感器信号放大的作用。
本发明中一种电化学生物传感器在miRNA检测中的应用的具体实施例
实施例3
本实施例使用实施例1中制备的含有“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器应用于细胞裂解液中miRNA-141灵敏检测，具体实施操作如下：
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行检测，上述实施例1所备电化学生物传感器为工作电极，对电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极，在电化学检测液中进行测试，分别对102、103、104个乳腺癌细胞裂解液进行检测。
(2)用差分脉冲伏安法对miRNA-141进行测量，脉冲振幅为50mV，样品宽度为16.7ms，脉冲宽度为25ms，电压范围为-0.05V至0.4V。
检测结果如图5所示，随着乳腺癌细胞数量的增加(102-104)，电化学信号响应显著减少，显示出与标准方法qRT-PCR方法的良好一致性。
本实施例中qRT-PCR方法检测miRNA-141为本领域常规的实验操作。
实施例4
本实施例对实施例1中制备的含有“防滑钉”结构的电化学生物传感器的检测特异性进行验证，具体实施方式如下：
选取了三种非靶标miRNA和人源miRNA-141，其中非靶标miRNA分别为人源microRNA-21(UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，SEQ ID NO.5所示)、与目标物miRNA-141单碱基错配miRNA(UAACACUGUCAGGUAAAGAUGG，SEQ ID NO.6所示)和双碱基错配miRNA(UAACAGUGUCUGGUAUAGAUGG，SEQ ID NO.7所示)，验证所构建的生物传感器的特异性。实验过程如实施例1所述(差分脉冲伏安法扫描，脉冲振幅为50mV，样品宽度为16.7ms，脉冲宽度为25ms，电压范围为-0.05V至0.4V)，其中非靶标miRNA的浓度为500fM，人源miRNA-141的浓度为50fM，每组进行3个生物学平行重复。
结果如图6所示，分别用miRNA-21(500fM)、单碱基错配的miRNA(500fM)和双碱基错配的miRNA(500fM)来代替目标物miRNA-141(50fM)，所得的实验结果和预期的一样，传感器未能检测到这些干扰组分，DPV信号未能发现明显的下降。结果说明所构建的生物传感器对miRNA-141具有很好的选择性。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种三维DNA步行器用轨道核酸组，其特征在于：所述轨道核酸组包括第一轨道核酸和第二轨道核酸；
所述第一轨道核酸包括核糖核苷酸序列，核糖核苷酸序列的下游连接有脱氧核糖核苷酸序列，所述核糖核苷酸序列末尾N1个碱基与所述脱氧核糖核苷酸序列末尾N1个碱基互补配对以形成发卡结构，所述核糖核苷酸序列末尾n个碱基和所述脱氧核糖核苷酸序列前部的碱基与待检测miRNA的碱基互补配对，所述7≤N1≤9，所述n为6或7；
所述第二轨道核酸包括脱氧核糖核苷酸序列，所述脱氧核糖核苷酸序列上游与所述第一轨道核酸核糖核苷酸序列碱基互补配对，所述脱氧核糖核苷酸序列中N2个碱基与末尾N2个碱基碱基互补配对以形成发卡结构，所述脱氧核糖核苷酸序列的下游连接有信号物，所述7≤N2≤9。
2.根据权利要求1所述的三维DNA步行器用轨道核酸组，其特征在于：若干条所述第一轨道核酸固定在金纳米颗粒上，经步行反应后形成多脚步行器。
3.根据权利要求1所述的三维DNA步行器用轨道核酸组，其特征在于：所述核糖核苷酸序列的长度不小于15bp。
4.根据权利要求1所述的三维DNA步行器用轨道核酸组，其特征在于：所述第一轨道核酸中核糖核苷酸序列和所述第二轨道核酸中脱氧核糖核苷酸序列上游连接有阻隔序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的三维DNA步行器用轨道核酸组，其特征在于：当待检测的miRNA为人源miRNA-141时，所述第一轨道核酸的序列为5’-SH-TTTTTTrCrGrArGrUrGrUrCrArGrUrCrCrArUrCrUTTACCAGACAGTGTTACAGATGG AC-3’，所述第二轨道核酸的序列为5’-SH-TTTTAGATGGACTGACACTCGCTATCAGACAGTGTTACGAGTGTCA-Fc-3’，其中Fc为信号物。
6.一种基于“防滑钉”结构三维DNA步行器的电化学生物传感器，其特征在于：包括金纳米颗粒、电极基底和权利要求1～5任一项所述的三维DNA步行器用轨道核酸组，所述金纳米颗粒上固定有所述的第一轨道核酸，所述电极基底上固定有所述的第二轨道核酸，所述第一轨道核酸中的核糖核苷酸序列末尾n个碱基构成“防滑钉”结构。
7.一种如权利要求6所述的电化学生物传感器在miRNA检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的电化学生物传感器在miRNA检测中的应用，其特征在于：
(1)将待检测miRNA、双链特异性核酸酶和电化学生物传感器中第一轨道核酸进行孵育，获得第一步步行反应液；
(2)将步骤(1)获得的第一步步行反应液与电化学生物传感器中第二轨道核酸进行孵育。
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