WO2016072758A1 - 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법 - Google Patents

표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법 Download PDF

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박기수
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and quantifying a biological material using nucleic acid polymerase activity controlled by a target substance, and more particularly, a DNA aptamer prepared to include a single-stranded DNA that specifically recognizes a specific nucleic acid.
  • a target substance and more particularly, a DNA aptamer prepared to include a single-stranded DNA that specifically recognizes a specific nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for detecting or quantifying a biological material.
  • Nucleic acid-based detection technology plays an important role in disease diagnosis, drug detection, environmental monitoring and criminal investigation, and there is a continuous need for new detection technology with excellent sensitivity and specificity and easy to use.
  • Conventionally used nucleic acid-based detection technology is based on molecular beacon, a U-shaped DNA probe labeled with fluorescent and quencher material. This technique is accomplished by identifying the presence or absence of fluorescence signal generation due to the structural change of the molecular beacon due to the presence of the target nucleic acid (Tyagi et al., Nature biotechnology , 14: 303-308, 1996; Masuko et al., Nucleic Acids Research , 26: 5409-5416, 1998).
  • One representative example is a system for introducing enzymes labeled with detection probes and inhibitors that detect target nucleic acids (Gianneschi et al., Angewandte Chemie -International Edition , 46: 3955-3958, 2007 Saghatelian et al., Journal of the American Chemical Society, 125: 344-345, 2003; Pavlov et al., Journal of the American Chemical Society , 127: 6522-6523, 2005; Niemeyer et al., Angewandte Chemie- International Edition , 49: 1200-1216, 2010).
  • this technique has the disadvantage of requiring a process for labeling an inhibitor with an enzyme, which requires a long time and requires a skilled technique.
  • the labeling process itself can reduce the enzyme activity by causing a change in the enzyme structure.
  • this technique has a limitation in that it is difficult to be used as a general-purpose technique for the detection of various target nucleic acids because the production of enzyme-inhibitor complex for each target nucleic acid is required.
  • a label-free enzyme-based universal system for the detection of various target nucleic acids there is a need for the development of a label-free enzyme-based universal system for the detection of various target nucleic acids.
  • the present inventors have overcome the problems of the prior art, and as a result of research efforts to develop an enzyme-based detection and quantification system having excellent sensitivity that does not require labeling of inhibitors and can be universally applied to the detection and quantification of various target nucleic acids.
  • the main object of the present invention is the detection and quantification of target nucleic acid using an aptamer capable of detecting and quantifying a target nucleic acid using a DNA aptamer including single-stranded DNA that specifically recognizes a target nucleic acid. To provide a way.
  • Another object of the present invention is complementary to a blocker nucleic acid capable of detecting and quantifying a target nucleic acid utilizing a blocker nucleic acid having a sequence complementary to the target nucleic acid.
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying a target nucleic acid using an aptamer including single-stranded DNA.
  • Another object of the present invention is complementary to a blocker nucleic acid capable of detecting and quantifying a target substance utilizing a blocker nucleic acid (blocker DNA) having a sequence that specifically recognizes and binds to the target substance.
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying a target substance using an aptamer including single-stranded DNA.
  • Another object of the present invention is complementary to a blocker nucleic acid capable of detecting and quantifying the activity of a BER enzyme utilizing a blocker nucleic acid having a base sequence specific for a target BER (Base Excision Repair) enzyme.
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying a target base decision repair (BER) enzyme using an aptamer including single-stranded DNA.
  • Another object of the present invention is complementary to a blocker nucleic acid capable of detecting and quantifying the activity of a target nucleic acid enzyme utilizing a blocker nucleic acid having a nucleotide sequence specific for the target nucleic acid enzyme.
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying a target nucleic acid enzyme using an aptamer including single-stranded DNA.
  • the present invention provides a nucleic acid polymerase in a mixture containing (a) an aptamer comprising a single-stranded nucleic acid that specifically recognizes a target nucleic acid and a sample to be detected that contains the target nucleic acid.
  • step (b) Adding and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-target nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) a switch-off mode using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid, comprising the step of detecting or quantifying the target nucleic acid by analyzing the primer extension reaction of step (b). ) Provides a method for detecting or quantifying a target nucleic acid.
  • the present invention also contemplates (a) containing a target nucleic acid in a mixture containing an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a base sequence complementary to the target nucleic acid.
  • Adding a nucleic acid polymerase with a sample to be detected and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex ; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) a switch-on mode using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid, comprising the step of detecting or quantifying the target nucleic acid by analyzing the primer extension reaction of step (b). ) Provides a method for detecting or quantifying a target nucleic acid.
  • the present invention also provides a target material for a mixture containing (a) an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a base sequence that specifically recognizes and binds the target material.
  • Adding a nucleic acid polymerase and a sample to be detected which are assumed to contain the same, and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) a switch-on mode using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target material, comprising the step of detecting or quantifying the target material by analyzing the primer extension reaction of step (b). ) Detecting or quantifying a target substance.
  • the present invention also relates to (a) containing a target BER enzyme in a mixture containing an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a nucleotide sequence specific for the target BER enzyme.
  • nucleic acid polymerase and a sample to be detected Adding a nucleic acid polymerase and a sample to be detected, and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signaling material with the reaction product of step (a) and subjecting the primer extension to a primer extension; And (C) detecting or quantifying the activity of the target base excision repair enzyme by analyzing the primer extension reaction of step (b).
  • Nucleic acid polymerization controlled by the target base excision repair (BER) enzyme Provided is a method for detecting or quantifying a switch-on mode target base excision repair (BER) enzyme using activity of an enzyme.
  • the present invention also includes a target nucleic acid enzyme in a mixture containing (a) an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a nucleotide sequence specific for the target nucleic acid enzyme.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the principle of analysis using a polymerase activity switch and TaqMan probe by the target nucleic acid.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the principle of DNA aptamer-based target nucleic acid detection and quantification that specifically binds to Taq DNA ⁇ polymerase to inhibit enzymatic activity.
  • Figure 2 shows the experimental results of the feasibility of the polymerase activity switch by the target nucleic acid.
  • DNA aptamers designed to contain various single-stranded sequences inhibit the activity of the polymerase through binding to complementary target nucleic acids.
  • NC polymerase free sample
  • PC polymerase free sample
  • (1) positive control original DNA aptamer added to PC
  • (#, a) without target nucleic acid
  • pressure Sample added to PC only (#, p): sample in which target nucleic acid and aptamer were added to PC.
  • Final concentrations of polymerase, DNA aptamer and target nucleic acid used in this experiment were 5.5 nM, 100 nM, and 100 nM, respectively.
  • Figure 3 shows the results of applying the polymerase activity control phenomenon by the target nucleic acid identified in Figure 2 in the detection and quantification of Urea ( Ureaplasma urealyticum ), one of the pathogens causing sexually transmitted disease.
  • Urea Ureaplasma urealyticum
  • FIG. 3 shows the results of applying the polymerase activity control phenomenon by the target nucleic acid identified in Figure 2 in the detection and quantification of Urea ( Ureaplasma urealyticum ), one of the pathogens causing sexually transmitted disease.
  • NC samples without polymerase
  • PC samples with polymerase
  • Final concentrations of polymerase, DNA aptamer and target nucleic acid used in this experiment were 5.5 nM, 200 nM and 100 nM, respectively.
  • Figure 4 shows the results of the sensitivity measurement experiments of the present system for the detection and quantification of Urea target nucleic acid. That is, the results of measuring the fluorescence signal generated when adding different concentrations of Urea DNA based on the optimized conditions through the experiment.
  • (a) Change in fluorescence intensity of TaqMan probes during the primer extension reaction. In the presence of varying concentrations of Urea target nucleic acid, aurea specific for the Urea was added to the sample with the polymerase.
  • Figure 5 shows the results of the sensitivity measurement experiments of the present system for the detection and quantification of Chlamydia target nucleic acid.
  • the newly developed target nucleic acid detection and quantification system can be applied universally for the detection and quantification of various target nucleic acids.
  • (a) Change in fluorescence intensity of TaqMan probes during the primer extension reaction. In the presence of varying concentrations of Chlamydia target nucleic acids, Chlamydia specific aptamers were added to the polymerase-containing samples.
  • F 50 and F 0 are the fluorescence intensities of the TaqMan probes after 50 minutes and 0 minutes, respectively.
  • Figure 6 is a schematic diagram showing the principle of analysis using a polymerase activity switch (Switch) and TaqMan probe by the target nucleic acid.
  • Blocker DNA (blocker DNA) to implement the invention to operate in the switch-on mode (signal-off mode, signal-off mode) in addition to the switch-off mode (signal-off mode) implemented above
  • Figure 7 shows the results of detection and quantification of Urea target nucleic acid using a switching-on system.
  • it is an experimental result of the activity of the polymerase activity by the target nucleic acid in the target nucleic acid detection and quantification system designed to operate in the switch-on mode (signal-on mode).
  • Blocker DNA specific for various concentrations of Urea was added to the sample with polymerase and DNA aptamer.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the principle of analyzing the polymerase activity switch and TaqMan probe by the target material.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the principle of analyzing the polymerase activity switch and TaqMan probe by the UDG target enzyme.
  • FIG. 10 shows the feasibility test results of the polymerase activity switch by the UDG target enzyme. That is, the results of experiments on the effect of UDG on the activity of the polymerase using a DNA aptamer designed to specifically react to UDG.
  • F 50 and F 0 are the fluorescence intensity of TaqMan probe after 50 minutes and 0 minutes after primer extension reaction, respectively.
  • Figure 11 shows the results of the sensitivity measurement experiments of the present system for the detection and quantification of UDG target enzymes. That is, the results of measuring the fluorescence signal generated when adding different concentrations of UDG based on the optimized conditions through the experiment.
  • F 50 and F 0 are the fluorescence intensity of TaqMan probe after 50 minutes and 0 minutes after primer extension reaction, respectively.
  • Figure 12 shows the results of specificity experiments of the present system for the detection and quantification of UDG target enzymes.
  • F 50 and F 0 is the fluorescence intensity of the TaqMan probe after 0 minutes 50 minutes each primer extension reaction.
  • Polymerase added to samples with Blank (1), UDG (2), hAAG (3), hOGG1 (4), Fpg (5), BamHI (6), Exo I (7), and Lambda exonuclease (8) It became.
  • Final concentrations of polymerase, UDG aptamer, UDG blocker, UDG and other enzymes used in this experiment are 5.5 nM, 200 nM, 10 nM, 0.5 U / mL, and 5 U / mL, respectively.
  • the present invention has developed an enzyme-based detection and quantification system with excellent sensitivity that does not require labeling of inhibitors and can be universally applied for the detection and quantification of various target nucleic acids.
  • Taq DNA polymerase a nucleic acid polymerase that performs DNA extension reaction
  • a DNA aptamer that specifically binds to and inhibits activity
  • the DNA aptamer is designed to include single-stranded DNA that specifically recognizes the target nucleic acid for detection and quantification of the target nucleic acid, and only when the portion is stabilized through binding to the target nucleic acid. It was confirmed that the polymerase activity can be inhibited by binding with Taq DNA polymerase.
  • a DNA aptamer system has been developed that inhibits polymerase activity through binding to blocker DNA.
  • the blocker DNA is designed to have a sequence complementary to the target nucleic acid, the presence of the target nucleic acid separates the blocker DNA from the DNA aptamer. As a result, the DNA aptamer no longer inhibits the activity of the polymerase, and the polymerase restores its own activity.
  • the change of polymerase activity through the interaction of the target nucleic acid and DNA aptamer could be analyzed by real-time fluorescence signal generated through primer extension reaction based on TaqMan probe. .
  • the present invention separately detects a target nucleic acid and detects a signal generated accordingly. Because they are separated, the signal-sensing portion remains the same, and a variety of target nucleic acids can be analyzed by changing only the single-stranded sequence of the DNA aptamer, which is a component of the portion that recognizes the target nucleic acid. It has the advantage of being.
  • aptamer sequence that specifically recognizes cells, proteins, small molecules, etc. as blocker DNA, it has the potential to detect and quantify various biological materials and chemicals in addition to target nucleic acids with high sensitivity.
  • TaqMan probe-based signal generation technology used in the present invention can be easily replaced by color and electrochemical techniques.
  • the activity of the polymerase can be inhibited only when the DNA aptamer, which specifically recognizes Taq DNA polymerase and inhibits the activity, is modified to form a stabilized structure by binding to a target nucleic acid.
  • the present system is based on DNA aptamer. It is possible to detect and quantify various target nucleic acids by only changing the single-stranded sequence, and has the advantage that it can be performed simply without labeling the inhibitor to the enzyme.
  • the target material which is the principle underlying the present invention, it has the potential to be applied to the detection and quantification of not only the target nucleic acid but also other biomaterials and chemicals.
  • nucleic acid refers to a single- or double-stranded DNA, RNA and chemical modifications thereof, which modifications do not interfere with the amplification of the selected nucleic acid, but is not limited thereto, but is a backbone Modification, methylation, biphasic combination, substitution of 5-bromo-uracil, and the like.
  • aptamer refers to a small single-stranded oligonucleic acid that can specifically recognize a target material with high affinity.
  • the length of the aptamer of the present invention is not particularly limited, and may usually be about 15 to about 200 nucleotides, but for example, about 100 nucleotides or less, preferably about 80 nucleotides or less, and in one embodiment of the present invention
  • the length of the aptamer is not particularly limited, but may be developed to about 96 nucleotides, and may be modified and used to a more efficient 20-30 nucleotide size through a post-SELEX process. If the total number of nucleotides is small, chemical synthesis and mass production are easier, and the cost advantage is also large. In addition, it is thought that the chemical formula is easy, the stability in vivo is high, and the toxicity is low.
  • the aptamer of the present invention can be chemically synthesized by the method disclosed in the present specification and a method known per se in the art.
  • Aptamers are commonly SELEX methods, methods for improving them [see, eg, Ellington et al., Nature , 346: 818-822, 1990; Tuerk et al., Science , 249: 505-510, 1990.
  • the SELEX process refers to a method of identifying DNA sequences specific to each molecule by selecting and amplifying DNA or RNA having a high binding capacity to a specific molecule in a collection of randomly synthesized DNA or RNA (JW Park et al. al., Chemical Communications , 48 (15): 2071-2073, 2012).
  • the aptamer having a stronger binding force to the target substance is concentrated and selected.
  • an aptamer having a different binding force, an aptamer having a different binding form, or an aptamer having the same binding force or binding form but different base sequence can be obtained. There is.
  • each of the nucleotides included in the aptamer of the present invention is the same or different, and each is a nucleotide containing a hydroxyl group at the 2 ′ portion of the ribose (eg, the ribose of the pyrimidine nucleotide) (ie, an unsubstituted nucleotide), or In the 2 ′ portion of the ribose, the hydroxyl group may be a nucleotide substituted with any atom or group.
  • a hydrogen atom, a fluorine atom or an -O-alkyl group e.g.
  • the nucleotide substituted by group is mentioned.
  • the aptamers of the invention also have at least one (eg 1,2, 3 or 4) nucleotides, at the 2 'site of ribose, a hydroxyl group, or any of the atoms or groups described above, such as hydrogen atoms, fluorine It may be a nucleotide comprising at least two (eg 2, 3 or 4) groups selected from the group consisting of atoms, hydroxyl groups and -O-Me groups.
  • the aptamers of the present invention also include all nucleotides from the group consisting of a hydroxyl group, or any of the atoms or groups described above, such as a hydrogen atom, a fluorine atom, a hydroxyl group, and a -0-Me group, at the 2 'site of ribose. It may be a nucleotide containing the same group selected.
  • the aptamer of the present invention may be one in which sugar residues (eg ribose or deoxyribose) of each nucleotide are modified in order to enhance binding, stability, etc. to the target substance or target nucleic acid.
  • sugar residues eg ribose or deoxyribose
  • the moiety modified in the sugar residue include those in which the oxygen atoms at the 2 ', 3' and / or 4 'sites of the sugar residue are replaced with other atoms.
  • modification for example, fluorinated, O-alkylated (eg O-methylated, O-ethylated), O-allylated, S-alkylated (eg S-methylated, S-ethylated), S-allyl And amination (for example, -NH2).
  • Such a sugar residue can be modified by a method known per se (for example, Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 19: 733-738, 1991; Cotton et al., Nucl . Acid. Res. 19: 2629-2635, 1991; Hobbs et al., Biochemistry, 12: 5138-5145, 1973).
  • the aptamer of the present invention may also be a modified (e.g., chemically substituted) nucleic acid base (e.g., purine, pyrimidine) in order to enhance the binding to a target substance or target nucleic acid.
  • modifications include, for example, 5-site pyrimidine modifications, 6- and / or 8-site purine modifications, modifications in extrafoam amines, substitution with 4-thiouridines, 5-bromo or 5-iodine-urisyl Substitution is mentioned.
  • the phosphate group contained in the aptamer of this invention may be modified so that it may become resistant to nuclease and hydrolysis.
  • P (0) 0 group is P (0) S (thioate), P (S) S (dithioate), P (O) NR2 (amidate), P (O) R, R (O) OR Or may be substituted with ', CO or CH 2 (formacetal) or 3'-amine (-NH-CH 2 -CH 2- ), wherein each R or R' is independently H or substituted, Or unsubstituted alkyl (eg methyl, ethyl).
  • a linking group -O-, -N-, or -S- is illustrated, and can couple
  • Modifications in the present invention may also include 3 'and 5' modifications, such as capping. Modifications also include polyethylene glycol, amino acids, peptides, inverted dT, nucleic acids, nucleosides, Myristoyl, Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, other lipids, steroids, cholesterol, caffeine, vitamins, It can be done by adding a dye, a fluorescent substance, an anticancer agent, a toxin, an enzyme, a radioactive substance, a biotin and the like to the terminal (see US Pat. No. 5,660,985, US Pat. No. 5,756,703).
  • the aptamer is bound to the target substance by various binding modes such as ionic bonds using a negative charge of phosphate groups, hydrophobic and hydrogen bonds using ribose, hydrogen bonds or stacking bonds using nucleic acid bases, and the like.
  • the ionic bond using the negative charge of the phosphate group present by the number of nucleotides strongly binds to the positive charge of lysine or arginine on the surface of the protein.
  • the nucleic acid base which is not related to direct binding with a target substance can be substituted.
  • the portion of the stem structure is already made of base pairs and is directed toward the inside of the double helix structure, the nucleic acid base is difficult to bind directly with the target substance.
  • the base pair can be substituted when the nucleic acid base is not involved in the direct bond with the target molecule.
  • the modification of the 2 'site of ribose rarely the functional group of the 2' site of ribose interacts directly with the target molecule, but in most cases, it is irrelevant and can be replaced with another modified molecule. As described above, the aptamer often maintains its activity unless the functional group involved in the direct bond with the target molecule is substituted or deleted.
  • a DNA aptamer designed to include a variety of single-stranded sequences in a switch-off type target DNA detection and quantification method through binding to a complementary target nucleic acid An experiment was performed to find out that the activity of the polymerase was inhibited. As shown in (a) and (b) of FIG. 2, the DNA aptamer inhibits the enzymatic activity of the polymerase only when the target nucleic acid is complementary to the single-stranded sequence of the DNA aptamer. As a result, it was confirmed that a low fluorescence signal was shown. In addition, the degree of DNA aptamer inhibition of polymerase in the presence of the target nucleic acid was similar to the degree of inhibition of the polymerase activity of the first 78-mer DNA aptamer.
  • an experiment was performed in which the regulation of polymerase activity by a target nucleic acid was applied to the detection and quantification of Urea ( Ureaplasma urealyticum ), one of pathogens causing sexually transmitted disease.
  • Urea Ureaplasma urealyticum
  • polymerization is performed only when the target nucleic acid Urea DNA is present. It was confirmed that it inhibits the activity of the enzyme.
  • Chlamydia Chlamydia trachomatis
  • DNA polymerase activity is not inhibited and its inherent high activity is shown. there was.
  • the experiment was performed to measure the fluorescence signal generated when adding different concentrations of Urea DNA based on the optimized conditions. As a result, it was confirmed that as the concentration of Urea DNA was increased, the polymerase activity was inhibited, and as a result, a reduced fluorescence signal was generated. It was confirmed that the fluorescence signal was linearly reduced in the concentration of urea DNA in the range of 0-10 nM, and the detection limit was 0.91 nM.
  • Aptamers used in the present invention are as follows (underlined: conserved region (SEQ ID NO: 21)).
  • T20-aptamer 5'-TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT TTTTTT CAAT GTAC AGTA TTG-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Random1-aptamer 5'-AGTC AGTC AGTC AGTC CAAT GTAC AGTA TTG-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Random2-aptamer 5'-ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG CAAT GTAC AGTA TTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • T20-aptamer (Reverse): 5'-CAAT GTAC AGTA TTGT TTTT TTTT TTTT TTT-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Urea-specific aptamer 1 5'-TAGG ACGG TCAC CAGT ATTT TTAA T CAA TGTA CAGT ATTG -3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Chlamydia-specific aptamer 5'-TACA AGCT GCAA TCCC TTTT AAGA T CAA TGTA CAGT ATTG -3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Urea-specific aptamer2 5'-A AAT ACTG GTGA CCGT CCTA CAAT GTAC AGTA TTG -3 '(SEQ ID NO: 14)
  • UDG aptamer 5'-TTTT AA TTTT AA TTTT CAA TGT ACA GTA TTG -3 '(SEQ ID NO: 18)
  • the present invention provides, in a first aspect, a nucleic acid polymerase in a mixture containing (a) an aptamer comprising a single stranded nucleic acid that specifically recognizes a target nucleic acid and a sample to be detected that contains the target nucleic acid.
  • step (b) Adding and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-target nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) a switch-off mode using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid, comprising the step of detecting or quantifying the target nucleic acid by analyzing the primer extension reaction of step (b). ) A method for detecting or quantifying a target nucleic acid.
  • the single strand of the aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid, the aptamer forms a stable structure when combined with the target nucleic acid, and then combined with the nucleic acid polymerase enzyme It may be characterized in that the activity of reducing, the aptamer may be characterized by having a conserved region (conserved region) represented by SEQ ID NO: 21 at the 5 'end or 3' end, the aptamer is SEQ ID NO: It may be characterized by having a nucleotide sequence selected from the group consisting of 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 12.
  • the target nucleic acid is A20-target (A20-target), random1-target (Random1-target), random2-target (Random2-target), complementary urea-target 1 (Complementary Urea-target 1 ), Non-complementary Chlamydia-target 1 and Complementary Chlamydia-target2, characterized in that the nucleic acid polymerase is selected from the group consisting of Taq DNA polymerase.
  • the mixture of step (a) is heated for about 5 minutes at about 90 °C and then slowly cooled to about 25 °C, it can be characterized in that the addition of the nucleic acid polymerase, the reaction. More specifically, the mixture of step (a) is heated at 90 ° C. for 5 minutes, slowly cooled to 0.1 ° C./s to reach 25 ° C., treated at 25 ° C. for 30 minutes, and then nucleic acid polymerase is added. The reaction for binding the nucleic acid polymerase and the aptamer-target nucleic acid complex may be performed for 20 minutes.
  • the mixture containing the signaling material may be characterized in that it further comprises a template nucleic acid (template) and TaqMan probe.
  • template template nucleic acid
  • the mixture containing the signaling material of step (b) is heated at about 90 °C for about 5 minutes and then slowly cooled to about 25 °C, and then coupled to the template nucleic acid (template) primer and TaqMan probe
  • the mixture with the reaction product of step (a) More specifically, the mixture containing the signaling material of step (b) is heated for 5 minutes at 90 °C and slowly cooled to 0.1 °C / s to reach 25 °C, at 25 °C to template nucleic acid (template)
  • the reaction combining the primer and the TaqMan probe may be performed for 60 minutes, and then mixed with the reaction product of step (a).
  • step (c) may be characterized by analyzing the presence or absence of the target nucleic acid by detecting or quantifying a signal derived from the primer extension reaction of step (b), the temperature of the primer extension reaction It may be characterized in that the 20 to 30 °C, the signaling material is a substance containing radioisotopes, fluorescent materials, dyes, nanoparticles, enzymes, enzyme substrates, luminescent materials and electrochemical functional groups (electrochemical functional group) It may be characterized by being labeled with a material selected from the group consisting of.
  • the switch-off mode target nucleic acid detection or quantification method using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid of the present invention targets an aptamer comprising a single stranded nucleic acid After forming a stable structure when combined with the nucleic acid, the method of detecting and quantifying the target nucleic acid using a feature that binds to the nucleic acid polymerase to reduce the activity of the enzyme.
  • the "sample” is a composition containing or suspected of containing a target nucleic acid or a target substance and is analyzed.
  • the sample is collected from any one or more of liquid, soil, air, food, waste, flora and fauna and animal tissue. It may be characterized by being detected from a sample, but is not limited thereto.
  • the liquid may be characterized in that the water, blood, urine, tears, sweat, saliva, blood, serum, plasma, sputum, lymph and cerebrospinal fluid, and the water is precipitation ( ⁇ ), sea water ( ⁇ ), lake ( Water, rainwater, and the like; waste includes sewage, wastewater, and the like, and the flora and fauna includes a human body.
  • flora and fauna tissues such as mucous membranes, skin, skin, hair, scales, eyes, tongue, cheeks, hoof, beak, snout, foot, hands, mouth, nipples, ears, nose and the like.
  • FIG. 7 that is, a blocker DNA (blocker DNA) that specifically recognizes Urea DNA was designed, and a suitable DNA aptamer was constructed and experimented. As the blocker DNA concentration increased, it was confirmed that the polymerase activity was inhibited. Urea DNA detection and quantification were performed using the optimized blocker DNA concentration of 20 nM. As shown in Figure 7 (b), only when the target nucleic acid Urea DNA (3), it was confirmed that the polymerase is activated and generates a high fluorescence signal.
  • blocker DNA blocker DNA
  • Chlamydia DNA is present as a negative control (negative control) (4), it was confirmed that the polymerase activity is continuously inhibited and low fluorescence signal is generated. Fluorescence signals generated when different concentrations of Urea DNA were added under selected conditions were measured. As shown in (c) and (d) of FIG. 7, as the concentration of Urea DNA was increased, the polymerase activity was increased, and as a result, a high fluorescence signal was generated. It was confirmed that the fluorescence signal was linearly increased in the concentration of urea DNA in the range of 0-20nM, and the detection limit was 2.67nM.
  • the present invention provides a target nucleic acid in a second aspect, comprising: (a) an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a mixture containing the blocker nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid; Adding a nucleic acid polymerase and a sample to be detected, which are assumed to contain the same, and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) a switch-on mode using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid, comprising the step of detecting or quantifying the target nucleic acid by analyzing the primer extension reaction of step (b). ) A method for detecting or quantifying a target nucleic acid
  • the single strand of the aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence complementary to the blocker nucleic acid, the aptamer forms a stable structure when combined with a blocker nucleic acid (nucleic acid polymerase) It can be characterized in that it is coupled to reduce the activity of the enzyme, the aptamer may be characterized by having a conserved region (conserved region) represented by SEQ ID NO: 21 at the 5 'end or 3' end, The aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the target nucleic acid may be Complementary Urea-target 2 or Non-complementary Chlamydia-target 2 (Non-complementary Chlamydia-target 2), the nucleic acid
  • the polymerase may be characterized as Taq DNA polymerase, and the temperature of the primer extension may be characterized in that 20 ⁇ 30 °C.
  • the mixture of step (a) is heated for about 5 minutes at about 90 °C and then slowly cooled to about 25 °C, it can be characterized in that the addition of the nucleic acid polymerase, the reaction. More specifically, the mixture of step (a) is heated at 90 ° C. for 5 minutes, slowly cooled to 0.1 ° C./s to reach 25 ° C., treated at 25 ° C. for 30 minutes, and then nucleic acid polymerase is added. In addition, the reaction for binding the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex may be performed for 20 minutes.
  • the mixture containing the signaling substance may be characterized in that it further comprises a template nucleic acid (template) and TaqMan probe.
  • template template nucleic acid
  • the mixture containing the signaling material of step (b) is heated at about 90 °C for about 5 minutes and then slowly cooled to about 25 °C, and then coupled to the template nucleic acid (template) primer and TaqMan probe
  • the mixture with the reaction product of step (a) More specifically, the mixture containing the signaling material of step (b) is heated at 90 ° C. for 5 minutes and slowly cooled at a rate of 0.1 ° C./s to reach 25 ° C., at 25 ° C. with a primer on template nucleic acid (template). And a reaction for binding the TaqMan probe for 60 minutes, and then mixing with the reaction product of step (a).
  • the signaling material is labeled with a material selected from the group consisting of radioisotopes, fluorescent materials, dyes, nanoparticles, enzymes, enzyme substrates, luminescent materials and electrochemical functional groups It may be characterized in that, the step (c) may be characterized by analyzing the presence of the target nucleic acid by detecting or quantifying the signal derived from the primer extension reaction of step (b).
  • the blocker nucleic acid may be a blocker DNA (blocker DNA) or a blocker RNA (blocker RNA), the blocker nucleic acid is a urea-specific blocker having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 ( Urea-specific blocker).
  • the switch-on mode target nucleic acid detection or quantification method using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid of the present invention is an aptamer blocker containing a single stranded nucleic acid A stable structure upon binding to a nucleic acid, followed by detection and quantification of a target nucleic acid using a feature that binds to a nucleic acid polymerase to reduce the activity of the enzyme.
  • the experiment was performed to measure the fluorescence signal generated when adding different concentrations of UDG based on the optimized conditions through the experiment (Fig. 11). As a result, it was confirmed that as the concentration of UDG increased, the polymerase activity increased, resulting in a high fluorescence signal. It was confirmed that the fluorescence signal was linearly increased in the concentration range of 0-0.3U / mL, and the detection limit was 0.024U / mL.
  • FIG. 12 an experiment was performed to measure the specificity of the target enzyme assay system developed in the present invention.
  • hAAG human alkyladenine DNA glycosylase
  • hOGG1 human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1
  • Fpg formamidopyrimidine-DNA glycosylase (5)
  • BamHI BamHI
  • the cleavage reaction of the uracil nucleobase converts into a DNA aptamer structure containing a single strand, through which the polymerase is activated. As a result, a high fluorescence signal is obtained.
  • target substance means a nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, aptamer, antigen, antibody, hapten, small molecule, macromolecular complex, cell, It may be characterized in that it is selected from the group consisting of pharmaceutical agents, organic compounds and inorganic compounds, but is not limited thereto.
  • the low molecular weight substance includes nonpolar low molecular weight chemicals such as bisphenol A and the like.
  • the present invention in a third aspect, comprises (a) an aptamer comprising a single-stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a base sequence that specifically recognizes and binds the target substance.
  • Adding a nucleic acid polymerase and a sample to be detected which are supposed to contain a target substance, to react with the mixture to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) a switch-on mode using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target material, comprising the step of detecting or quantifying the target material by analyzing the primer extension reaction of step (b). ) A method of detecting or quantifying a target substance.
  • the single strand of the aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence complementary to the blocker nucleic acid, the aptamer forms a stable structure when combined with a blocker nucleic acid (nucleic acid polymerase) It can be characterized in that it is coupled to reduce the activity of the enzyme, the aptamer may be characterized by having a conserved region (conserved region) represented by SEQ ID NO: 21 at the 5 'end or 3' end.
  • the blocker nucleic acid may be a DNA or RNA that specifically recognizes and binds to a target material
  • the target material may be a nucleic acid, a carbohydrate, a lipid, a protein, It may be characterized in that it is selected from the group consisting of peptides, antigens, antibodies, enzymes, hapten, low molecular materials, macromolecular complexes, cells, pharmaceutical agents, organic compounds and inorganic compounds.
  • the nucleic acid polymerase may be characterized in that the Taq DNA polymerase, the temperature of the primer extension reaction may be characterized in that the 20 ⁇ 30 °C, the signaling material is a radioisotope,
  • the fluorescent material, dye, nanoparticles, enzymes, enzyme substrates, luminescent material and the material containing an electrochemical functional group (electrochemical functional group) may be characterized in that it is labeled with a material selected from the group consisting of, the step (c) (b) analyzing the presence or absence of a target substance by detecting or quantifying a signal derived from the primer extension reaction, wherein the mixture containing the signaling substance is a template nucleic acid (template) and TaqMan probe It may be characterized in that it further comprises.
  • the method for detecting or quantifying a switch-on mode target material using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target material of the present invention is an aptamer blocker containing a single stranded nucleic acid After forming a stable structure when combined with the nucleic acid, the method of detecting and quantifying a target substance using a feature that binds to the nucleic acid polymerase to reduce the activity of the enzyme.
  • a target BER enzyme is present in a mixture containing an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a nucleotide sequence specific for the target BER enzyme.
  • Adding a nucleic acid polymerase and a sample to be detected which are presumed to contain, and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signaling material with the reaction product of step (a) and subjecting the primer extension to a primer extension; And (C) detecting or quantifying the activity of the target base excision repair enzyme by analyzing the primer extension reaction of step (b).
  • Nucleic acid polymerization controlled by the target base excision repair (BER) enzyme The present invention relates to a method for detecting or quantifying a switch-on mode target base excision repair (BER) enzyme using activity of an enzyme.
  • the single strand of the aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence complementary to the blocker nucleic acid, the aptamer forms a stable structure when combined with a blocker nucleic acid (nucleic acid polymerase) It can be characterized in that it is coupled to reduce the activity of the enzyme, the aptamer may be characterized by having a conserved region (conserved region) represented by SEQ ID NO: 21 at the 5 'end or 3' end, The aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the blocker nucleic acid may be characterized in that the DNA used as a substrate of the BER enzyme, the blocker nucleic acid is a UDG blocker having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 used as a substrate of the BER enzyme (UDG (uracil DNA glycosylase) blocker), and the target BER enzyme may be characterized as UDG (uracil DNA glycosylase).
  • UDG uracil DNA glycosylase
  • the nucleic acid polymerase may be characterized as Taq DNA polymerase, and the temperature of the primer extension reaction may be characterized in that the 20 ⁇ 30 °C.
  • the mixture of step (a) is heated at about 90 ° C. for about 5 minutes and then slowly cooled to about 37 ° C., and then a sample to be detected containing BER (Base Excision Repair) enzyme is added. And slowly cooled to about 25 ° C., and then adding and reacting the target nucleic acid polymerase. More specifically, the mixture of step (a) is heated at 90 ° C. for 5 minutes, then slowly cooled to 0.1 ° C./s to reach 37 ° C., treated at 37 ° C. for 20 minutes, and then subjected to target base excision repair. ) A sample to be detected containing an enzyme is added, treated at 37 ° C.
  • BER Base Excision Repair
  • the enzyme may be added to perform a reaction for binding the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex at 25 ° C. for 20 minutes.
  • the mixture containing the signaling material may be characterized in that it further comprises a template nucleic acid (template) and TaqMan probe.
  • template template nucleic acid
  • the mixture containing the signaling material of step (b) is heated at about 90 °C for about 5 minutes and then slowly cooled to about 25 °C, and then coupled to the template nucleic acid (template) primer and TaqMan probe
  • the mixture with the reaction product of step (a) More specifically, the mixture containing the signaling material of step (b) is heated for 5 minutes at 90 °C and slowly cooled at a rate of 0.1 °C / s to reach 25 °C, at a template nucleic acid (template) at 25 °C
  • the reaction combining the primer and the TaqMan probe may be performed for 60 minutes, and then mixed with the reaction product of step (a).
  • the signaling material is labeled with a material selected from the group consisting of radioisotopes, fluorescent materials, dyes, nanoparticles, enzymes, enzyme substrates, luminescent materials and electrochemical functional groups
  • the step (c) may be characterized by analyzing the activity of a target BER (Base Excision Repair) enzyme by detecting or quantifying a signal derived from the primer extension reaction of step (b). .
  • BER Base Excision Repair
  • the quantitative method is characterized in that the aptamer comprising a single stranded nucleic acid forms a stable structure when combined with a blocker nucleic acid, and then detects a target BER (Base Excision Repair) enzyme by using a characteristic of binding to a nucleic acid polymerase to reduce the activity of the enzyme. It is a method of quantification.
  • the present invention provides a target nucleic acid in a mixture containing (a) an aptamer comprising a single stranded nucleic acid complementary to the blocker nucleic acid and a blocker nucleic acid having a nucleotide sequence specific for the target nucleic acid enzyme.
  • Adding a nucleic acid polymerase and a sample to be detected that contain an enzyme, and reacting to bind the nucleic acid polymerase and the aptamer-blocker nucleic acid complex; (b) mixing a mixture containing a primer and a signal generating material in the reaction product of step (a) and subjecting the primer to a primer extension; And (C) analyzing the primer extension reaction of step (b) to detect or quantify the activity of the target nucleic acid enzyme, the switch-on type using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid enzyme ( switch-on mode) relates to a method for detecting or quantifying the activity of a target nucleic acid enzyme.
  • the single strand of the aptamer may be characterized by having a nucleotide sequence complementary to the blocker nucleic acid, the aptamer forms a stable structure when combined with a blocker nucleic acid (nucleic acid polymerase) It can be characterized in that it is coupled to reduce the activity of the enzyme, the aptamer may be characterized by having a conserved region (conserved region) represented by SEQ ID NO: 21 at the 5 'end or 3' end.
  • the blocker nucleic acid may be characterized in that the DNA or RNA used as a substrate of the target nucleic acid enzyme, the nucleic acid polymerase may be characterized in that the Taq DNA polymerase, the primer extension reaction
  • the temperature may be characterized by 20 to 30 °C.
  • the signaling material is labeled with a material selected from the group consisting of radioisotopes, fluorescent materials, dyes, nanoparticles, enzymes, enzyme substrates, luminescent materials and electrochemical functional groups
  • the step (c) is characterized in that the activity of the target nucleic acid enzyme by analyzing or detecting the signal derived from the primer extension reaction of step (b), the signal generating material
  • the mixture containing may further be characterized as further comprising a template nucleic acid and a TaqMan probe.
  • the method for detecting or quantifying the activity of the switch-on mode target nucleic acid enzyme using the activity of the nucleic acid polymerase regulated by the target nucleic acid enzyme of the present invention comprises a single stranded nucleic acid
  • the aptamer forms a stable structure when combined with the blocker nucleic acid, and then binds to the nucleic acid polymerase to reduce the activity of the enzyme, thereby detecting and quantifying the activity of the target nucleic acid enzyme.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the principle of analysis using a nucleic acid polymerase activity switch (Switch) and TaqMan probe by the target nucleic acid. More specifically, it is a schematic diagram showing the principle of DNA nucleic acid detection and quantification based on DNA aptamer that specifically binds to Taq DNA® polymerase to inhibit enzymatic activity. In the absence of the target nucleic acid to be detected and quantified, DNA aptamers designed to contain single-stranded DNA portions do not recognize the polymerase, thus resulting in inherently high activity of the polymerase.
  • Switch nucleic acid polymerase activity switch
  • the DNA aptamer specifically binds to the single-stranded DNA portion of the DNA aptamer, thereby stabilizing the DNA aptamer. Inhibition (1, Target recognition).
  • polymerase activity regulated by target nucleic acids can be analyzed through primer extension reactions based on TaqMan probes.
  • the target nucleic acid In the absence of the target nucleic acid, the high activity of the polymerase leads to cleavage of the TaqMan probe, resulting in a high fluorescence signal. On the other hand, when the target nucleic acid is present, the fluorescence signal generated from the TaqMan probe is reduced because the enzyme activity is inhibited by the DNA aptamer. As described above, the target nucleic acid can be easily detected and quantified by observing the difference between the stabilization of the DNA aptamer structure through the binding of the target nucleic acid and the inhibition of the polymerase activity and the generation of the fluorescence signal.
  • a DNA pressure that is a component of a portion for detecting a target nucleic acid while maintaining the same portion for detecting a signal is maintained.
  • FIG. 6 illustrates a blocker DNA (in order to implement the invention operating in a switch-on mode (signal-on mode) in addition to the switch-off mode (signal-off mode) implemented above.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the principle of detection and quantification of target nucleic acid through the introduction of blocker DNA).
  • DNA aptamer stabilized by blocker DNA inhibits the activity of the polymerase, thereby lowering The fluorescent signal is displayed.
  • the target nucleic acid separates the blocker DNA from the DNA aptamer so that the DNA aptamer no longer inhibits the activity of the polymerase. As a result, the polymerase activity is elevated and high fluorescence signal is generated.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing the principle of detection and quantification of a target substance to which the present invention is applied.
  • the blocker DNA is designed as an aptamer sequence capable of specifically recognizing cells, proteins, and small molecule substances
  • the presence of the target substance causes the blocker DNA to be a DNA aptamer.
  • the polymerase can generate high fluorescence signal through intrinsic enzyme activity.
  • the base sequence of the blocker DNA (blocker DNA) in the present system it is possible to analyze not only the target nucleic acid but also target cells, target proteins, target small molecule substances, and the like.
  • UDG uracil DNA glycosylase
  • Part A total volume of 20 ⁇ L was 1X Taq reaction buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3 , 50mM KCl, 4mM MgCl 2), 500 ⁇ M dNTPs, 400nM DNA pressure teomeo (DNA aptamer), and a complementary target DNA with different concentrations of It was composed of (complementary target DNA), heated at 90 ° C. for 5 minutes, cooled slowly to 25 ° C. (0.1 ° C./s), and treated at 25 ° C. for 30 minutes (incubation). Taq DNA polymerase (11 nM) was then added to each solution and treated for 20 minutes.
  • 1X Taq reaction buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3 , 50mM KCl, 4mM MgCl 2), 500 ⁇ M dNTPs, 400nM DNA pressure teomeo (DNA aptamer), and a complementary target DNA with different concentrations of It was composed of (complementary target DNA), heated at 90 ° C
  • Part B (total volume 20 ⁇ L) is the 1X Taq reaction buffer, 600 nM template nucleic acid, 600 nM primer, and 500 nM TaqMan probe is heated at 90 °C for 5 minutes, then slowly cooled to 25 °C (0.1 °C / s) ), Was treated at 25 ° C. for 60 minutes.
  • Part A and Part B were mixed and fluorescence was measured with a C1000 TM thermal cycler (Bio-Rad, CA, USA). Fluorescent signals derived from TaqMan probes during the primer extension reaction were monitored at 2-30 minutes at the polymerization temperature of 20-30 ° C. (preferably at 25 ° C.).
  • Experimental Examples 1 to 4 were performed by the method of Example 1.
  • FIG. 2 shows the results of experiments in which DNA aptamers designed to include various single-stranded sequences inhibit the activity of the polymerase through binding to complementary target nucleic acids.
  • Table 1 shows the DNA sequences used in this experiment (underlined: conserved regions).
  • the DNA apter inhibits the enzymatic activity of the polymerase and thus a low fluorescence signal. It could be confirmed that (2-5).
  • the degree of inhibition of the polymerase by the DNA aptamer in the presence of the target nucleic acid was confirmed to be similar to the degree of inhibition of the polymerase activity by the first 78-mer DNA aptamer.
  • Figure 3 shows the results of applying the polymerase activity control phenomenon by the target nucleic acid identified in Figure 2 in the detection and quantification of Urea ( Ureaplasma urealyticum ), one of the pathogens causing sexually transmitted disease.
  • Table 2 shows the DNA sequences used in this experiment (underlined: conserved regions).
  • the activity of the polymerase is only present when the target nucleic acid Urea DNA is present. It can be confirmed that it inhibits (2).
  • Chlamydia Chlamydia trachomatis
  • Figure 4 shows the results of measuring the fluorescence signal generated when adding different concentrations of Urea DNA based on the optimized conditions through experiments. As the concentration of urea DNA increased, the polymerase activity was inhibited, resulting in a decreased fluorescence signal. It was confirmed that the fluorescence signal was linearly reduced in the concentration of urea DNA in the range of 0-10 nM, and the detection limit was 0.91 nM. Table 2 shows the DNA sequences used in this experiment.
  • Part A total volume 20 ⁇ L
  • Part B total volume 20 ⁇ L
  • Taq reaction buffer 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl 2
  • 500 ⁇ M dNTPs 500 ⁇ M DNA aptamer
  • 40 nM blocker DNA and Complementary target DNA Complementary target DNA
  • Taq DNA polymerase 11 nM was then added to each solution and treated for 20 minutes.
  • Part B (total volume 20 ⁇ L) is the 1X Taq reaction buffer, 600 nM template nucleic acid, 600 nM primer, and 500 nM TaqMan probe is heated at 90 °C for 5 minutes, then slowly cooled to 25 °C (0.1 °C / s) ), Was treated at 25 ° C. for 60 minutes.
  • Part A and Part B were mixed and fluorescence was measured with a C1000 TM thermal cycler (Bio-Rad, CA, USA). Fluorescent signals derived from TaqMan probes during the primer extension reaction were monitored at 2-30 minutes at the polymerization temperature of 20-30 ° C. (preferably at 25 ° C.).
  • Experimental Example 5 was carried out by the method of Example 2.
  • Figure 7 shows the experimental results of the activity control of the polymerase by the target nucleic acid in the target nucleic acid detection and quantification system designed to operate in the switch-on mode (signal-on mode, signal-on mode).
  • a blocker DNA (blocker DNA) that specifically recognizes Urea DNA
  • Table 4 shows the DNA sequences used in this experiment (underlined: conserved regions).
  • Figure 7 (a) is the result of optimizing the concentration of the introduced blocker DNA (blocker DNA). As the blocker DNA concentration increased, it was confirmed that the polymerase activity was inhibited. Urea DNA detection and quantification were performed using the optimized blocker DNA concentration of 20 nM.
  • Part A (2 ⁇ L total volume) consists of 1 ⁇ Taq reaction buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl 2 ), 500 ⁇ M dNTPs, 400 nM UDG aptamer, and 20 nM UDG blocker. After heating at 90 ° C. for 5 minutes, the mixture was slowly cooled to 37 ° C. (0, 1 ° C./s), and then treated at 37 ° C. for 20 minutes (incubation).
  • Part B (total volume 20 ⁇ L) is the 1X Taq reaction buffer, 600 nM template nucleic acid, 600 nM primer, and 500 nM TaqMan probe is heated at 90 °C for 5 minutes, then slowly cooled to 25 °C (0.1 °C / s) ), Was treated at 25 ° C. for 60 minutes.
  • Part A and Part B were mixed and fluorescence was measured with a C1000 TM thermal cycler (Bio-Rad, CA, USA). Fluorescent signals derived from TaqMan probes during the primer extension reaction were monitored at 2-30 minutes at the polymerization temperature of 20-30 ° C. (preferably at 25 ° C.).
  • Experimental Examples 6 to 8 were performed by the method of Example 3.
  • Figure 10 shows the results of experiments on the effect of UDG on the activity of the polymerase using a DNA aptamer designed to specifically react to UDG.
  • Table 5 shows the DNA sequences used in this experiment.
  • the activity of the polymerase is increased, thereby generating a high fluorescence signal (3).
  • the experiment was performed by introducing DNA containing thymine instead of uracil nucleobase into blocker DNA complementary to a single strand of DNA aptamer, presence or absence of UDG Irrespective of whether the activity of the polymerase was inhibited by the DNA aptamer (DNA aptamer) (4 and 5).
  • DNA aptamer DNA aptamer
  • FIG. 11 is a result of measuring fluorescence signals generated when UDGs having different concentrations are added based on optimized conditions through experiments.
  • Table 5 shows the DNA sequences used in this experiment (underlined: conserved regions).
  • concentration of UDG increased, the activity of the polymerase increased, and as a result, high fluorescence signal was confirmed. It was confirmed that the fluorescence signal was linearly increased in the concentration range of 0-0.3U / mL, and the detection limit was 0.024U / mL.
  • the cleavage reaction of the uracil nucleobase converts into a single stranded DNA aptamer structure, thereby activating the polymerase and consequently high fluorescence. Signal.
  • a target nucleic acid, a target protein, a target small molecule, a target enzyme activity, etc. are labeled-free by regulating the activity of a polymerase through a DNA aptamer structure change by the target substance.

Abstract

본 발명은 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특정 핵산을 특이적 인식하는 단일가닥 DNA를 포함하도록 제조된 DNA 압터머(aptamer)와 복합체를 이루는 특정 핵산의 특이적인 결합 여부에 따른 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 활성 변화를 통해, 핵산, 단백질, 소분자 물질, 생리활성 물질(효소 활성) 등을 고감도로 검출 및 정량할 수 있는 생체물질의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 표적 물질에 의한 DNA 압터머(DNA aptamer) 구조 변화를 통해 중합효소의 활성을 조절함으로써, 표적 핵산, 표적 단백질, 표적 소분자 물질, 표적 효소 활성 등을 표지 없이(label-free) 민감하게 검출 및 정량할 수 있는 생체물질의 진단 방법을 제공할 수 있다.

Description

표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법
본 발명은 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 특정 핵산을 특이적 인식하는 단일가닥 DNA를 포함하도록 제조된 DNA 압터머(aptamer)와 복합체를 이루는 특정 핵산의 특이적인 결합 여부에 따른 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 활성 변화를 통해, 핵산, 단백질, 소분자 물질, 생리활성 물질(효소 활성) 등을 고감도로 검출 및 정량할 수 있는 생체물질의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
핵산 기반의 검출 기술은 질병 진단, 약물 검출, 환경 감시 및 범죄 수사에서 중요한 역할을 담당하고 있으며, 민감도 및 특이도가 우수하고 사용이 편리한 새로운 검출 기술이 계속적으로 요구되고 있는 상황이다. 기존에 대표적으로 사용되는 핵산 기반 검출 기술은 형광 및 소광제 물질이 표지된 U자형의 DNA 프로브인 분자비콘(molecular beacon)에 기반을 두고 있다. 이 기술은 표적 핵산의 존재에 의한 분자비콘의 구조 변화에 따른 형광신호 생성의 유무를 확인함으로써 이루어진다 (Tyagi et al., Nature biotechnology, 14:303-308, 1996; Masuko et al., Nucleic Acids Research, 26:5409-5416, 1998). 이 기술은, 핵산의 분리과정 없이 표적 핵산을 신속하게 분석할 수 있기 때문에, 널리 이용되고 있으며, 다양한 형태의 분자비콘 기반 핵산 분석 기술이 개발되고 있는 상황이다(Song et al., Angewandte Chemie-International Edition, 48:8670-8674, 2009; Wu et al., Biosensors & Bioelectronics, 26:3870-3875, 2011; Yeh et al., Nano Letters, 10:3870-3875, 2011). 하지만, 상기 언급한 분자비콘 기반의 분석 기술은 표적 핵산과 분자비콘이 1:1로 반응하여 형광신호를 발생시키므로, 높은 민감도를 구현하기 힘들다는 단점을 가지고 있다.
최근 이러한 문제점을 극복하고 민감도가 우수한 검출 센서를 개발하려는 목적으로, 효소를 신호 증폭을 위한 도구로 응용하는 시도들이 이루어지고 있다. 한 가지 대표적인 예로, 표적 핵산을 검출하는 탐지 프로브(detection probe)와 저해제(inhibitors)가 표지된 효소를 도입하는 시스템이 있다(Gianneschi et al., Angewandte Chemie -International Edition, 46: 3955-3958, 2007; Saghatelian et al., Journal of the American Chemical Society, 125: 344-345, 2003; Pavlov et al., Journal of the American Chemical Society, 127: 6522-6523, 2005; Niemeyer et al., Angewandte Chemie -International Edition, 49: 1200-1216, 2010). 이 시스템에서 표적 핵산의 존재는 탐지용 프로브(detection probe)와의 혼성화를 통해서 저해제의 저해 기능을 차단하게 되고, 이를 통해 복구된 효소 활성은 높은 형광신호를 발생하게 된다. 하지만, 이 기술은 효소에 저해제를 표지하는 과정이 필요하며 시간이 오래 걸리고 숙련된 기술을 필요로 한다는 단점을 가지고 있다. 또한, 표지 과정 자체가 효소 구조의 변화를 야기하여 효소 활성을 감소시킬 수 있다는 단점을 가지고 있다. 이 외에도, 이 기술은 각각의 표적 핵산에 대한 효소-저해제 복합체의 제작이 필요하기 때문에 다양한 표적 핵산의 검출을 위한 범용 기술로 활용되기 힘들다는 한계점을 가지고 있다. 따라서, 다양한 표적 핵산의 검출을 위한 표지가 필요 없는(label-free) 효소 기반 범용 시스템의 개발이 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점을 극복하고, 저해제의 표지가 필요 없고 다양한 표적 핵산의 검출 및 정량에 보편적으로 적용될 수 있는 민감도가 우수한 효소 기반 검출 및 정량 시스템을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 단일가닥 DNA가 포함된 DNA 압터머(DNA aptamer)를 사용할 경우 선택적이면서도 정교하게: (1) 스위치-오프 형 표적 핵산의 검출 및 정량, (2) 스위치-온 형 표적 핵산의 검출 및 정량, (3) 스위치-온 형 표적 물질의 검출 및 정량, (4) 스위치-온 형 표적 BER 효소 활성의 검출 및 정량, 및 (5) 스위치-온 형 표적 핵산 효소의 검출 및 정량이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은, 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 단일가닥 DNA를 포함하는 DNA 압터머(DNA aptamer)를 활용한 표적 핵산을 검출 및 정량할 수 있는 압터머를 이용한 표적 핵산의 검출 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 표적 핵산과 상보적인 서열을 가지는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)을 활용한 표적 핵산을 검출 및 정량할 수 있는 블로커 핵산에 상보적인 단일가닥 DNA를 포함하는 압터머를 이용한 표적 핵산의 검출 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 표적 물질을 특이적으로 인식하고, 이에 결합하는 서열을 가지는 블로커 핵산(blocker DNA)을 활용한 표적 물질을 검출 및 정량할 수 있는 블로커 핵산에 상보적인 단일가닥 DNA를 포함하는 압터머를 이용한 표적 물질의 검출 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 표적 BER(Base Excision Repair) 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)을 활용한 BER 효소의 활성을 검출 및 정량할 수 있는 블로커 핵산에 상보적인 단일가닥 DNA를 포함하는 압터머를 이용한 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 검출 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 표적 핵산 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)을 활용한 표적 핵산 효소의 활성을 검출 및 정량할 수 있는 블로커 핵산에 상보적인 단일가닥 DNA를 포함하는 압터머를 이용한 표적 핵산 효소의 검출 및 정량 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 상기 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료를 함유하는 혼합물에 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-표적 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 물질을 특이적으로 인식하고 결합하는 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응물을 분석하여 표적 물질을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 BER 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 BER 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응을(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응물을 분석하여 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 BER(Base Excision Repair) 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 상기 표적 핵산 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 핵산 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산 효소의 활성을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 핵산 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법을 제공한다.
도 1은 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 스위치와 TaqMan 프로브를 이용하여 이를 분석하는 원리를 보여주는 개략도이다. 즉, Taq DNA　중합효소에 특이적으로 결합하여 효소 활성을 저해시키는 DNA 압터머(DNA aptamer) 기반의 표적 핵산 검출 및 정량의 원리를 보여주는 개략도이다.
도 2는 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 스위치의 실현가능성 실험결과를 나타낸 것이다. 즉, 다양한 단일가닥 염기서열을 포함하도록 디자인된 DNA 압터머가 상보적인 표적 핵산과의 결합을 통해서 중합효소의 활성을 저해한다는 사실을 규명하는 실험 결과이다. (a) 프리이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. (b) 프리이머 신장 반응 200분 후의 형광신호의 변화. 여기서, F200과 F0은 각각 프리이머 신장 반응 200분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. NC: 중합효소가 없는 샘플, PC: 중합효소가 있는 샘플, (1): 양성 대조군인 오리지널 DNA 압터머(Original DNA aptamer)가 PC에 첨가된 샘플, (#, a): 표적 핵산 없이, 압터마만 PC 에 첨가된 샘플, (#, p): 표적 핵산과 압터머가 PC에 첨가된 샘플. 본 실험에서 사용된 중합효소, DNA 압터머 및 표적 핵산의 최종 농도는 각각 5.5nM, 100nM, 및 100nM이다.
도 3은, 도 2에서 확인된 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 조절 현상을 성병(sexually transmitted disease)을 일으키는 병원균 중의 하나인 Urea(Ureaplasma urealyticum)의 검출 및 정량에 적용한 실험 결과를 나타낸 것이다. (a) 프리이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. (b) 프리이머 신장 반응 50분 후의 형광신호의 변화. 여기서, F50과 F0은 각각 프리이머 신장 반응 50분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. (c) PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis) 이미지. NC: 중합효소가 없는 샘플, PC: 중합효소가 있는 샘플, (1): 상보적인 Urea 표적 핵산 없이, Urea에 특이적인 압터마만 PC에 첨가된 샘플, (2): 상보적인 Urea 표적 핵산과 Urea에 특이적인 압터마가 PC에 첨가된 샘플, (3): 비상보적인 Chlamydia 표적 핵산과 Urea에 특이적인 압터마가 PC에 첨가된 샘플. 본 실험에서 사용된 중합효소, DNA 압터머 및 표적 핵산의 최종 농도는 각각 5.5nM, 200nM 및 100nM이다.
도 4는 Urea 표적 핵산의 검출 및 정량에 대한 본 시스템의 민감도 측정 실험 결과를 나타낸 것이다. 즉, 상기 실험을 통해 최적화된 조건을 바탕으로 서로 다른 농도의 Urea DNA를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정한 결과이다. (a) 프리이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. 다양한 농도의 Urea 표적 핵산의 존재하에서, Urea에 특이적인 압터마가 중합효소가 있는 샘플에 첨가되었다. (b) 다양한 농도의 Urea 표적 핵산의 존재하에서, 프리이머 신장 반응 50분 후의 형광 신호의 변화. 여기서, F50과 F0은 각각 프리이머 신장 반응 50분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. (b)의 삽화: Urea 표적 핵산 농도에 대해, 프리이머 신장 반응 50분 후의 형광신호의 변화를 나타낸 선형그래프 (0-10nM). 본 실험에서 사용된 중합효소와 DNA 압터머의 최종 농도는 각각 5.5nM와 200nM이다.
도 5는 Chlamydia 표적 핵산의 검출 및 정량에 대한 본 시스템의 민감도 측정 실험 결과를 나타낸 것이다. 즉, 새롭게 개발된 표적 핵산 검출 및 정량 시스템이 다양한 표적 핵산의 검출 및 정량을 위해 범용적으로 적용될 수 있음을 확인한 결과이다. (a) 프리이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. 다양한 농도의 Chlamydia 표적 핵산의 존재하에서, Chlamydia에 특이적인 aptamer가 중합효소가 있는 샘플에 첨가되었다. (b) 다양한 농도의 Chlamydia 표적 핵산의 존재하에서, 프리이머 신장 반응 50분 후의 형광신호의 변화. 여기서, F50과 F0은 각각 프리이머 신장 반응 50분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. (b)의 삽화: Chlamydia 표적 핵산 농도에 대해, 프리이머 신장 반응 50분 후의 형광신호의 변화를 나타낸 선형그래프(0-10nM). 본 실험에서 사용된 중합효소와 DNA 압터머의 최종 농도는 각각 5.5nM 와 200nM이다.
도 6은 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 스위치(switch) 와 TaqMan 프로브를 이용하여 이를 분석하는 원리를 보여주는 개략도이다. 상기에서 구현된 스위치-오프 형(switch-off mode, signal-off mode) 외에도 스위치-온 형(switch-on mode, signal-on mode)에서 작동하는 발명을 구현하기 위해, 블로커 DNA(blocker DNA)의 도입을 통한 표적 핵산 검출 및 정량의 원리를 나타내는 개략도이다.
도 7은 스위치-온(switching-on) 시스템을 이용한 Urea 표적 핵산의 검출 및 정량 실험 결과를 나타낸 것이다. 즉, 스위치-온 형(switch-on mode, signal-on mode)에서 작동하도록 디자인된 표적 핵산 검출 및 정량 시스템에서 표적 핵산에 의한 중합효소의 활성 조절 현상에 대한 실험 결과이다. (a) 다양한 농도의 Urea에 특이적인 블로커 DNA(blocker DNA)가 중합효소와 DNA 압터머를 갖는 샘플에 첨가되었다. (b) Free DNA 압터머(DNA aptamer) (1), DNA 압터머와 Urea에 특이적인 블로커 DNA(blocker DNA) (2), DNA 압터머, Urea에 특이적인 블로커 DNA(blocker DNA), 그리고 상보적인 Urea 표적 핵산 (3), DNA 압터머, Urea에 특이적인 블로커 DNA(blocker DNA), 그리고 비상보적인 chlamydia 표적 핵산 (4) 이 중합효소를 갖는 샘플에 첨가되었다. (c) 프라이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. 다양한 농도의 Urea 표적 핵산이 중합효소와 Urea에 특이적인 블로커 DNA(blocker DNA)에 결합된 DNA 압터머를 갖는 샘플에 첨가되었다. (d) 다양한 농도의 Urea 표적 핵산의 존재하에서, 프라이머 신장(primer extension) 반응 50분 후의 형광신호의 변화. (d)의 삽화: Urea 표적 핵산 농도에 대해, 프라이머 신장(primer extension) 반응 50분 후의 형광세기의 변화를 나타낸 선형그래프(0-20nM). 본 실험에서 사용된 중합효소, DNA 압터머 및 Urea에 특이적인 blocker DNA의 최종 농도는 각각 5.5nM, 200nM 및 20nM 이다.
도 8은 표적 물질에 의한 중합효소 활성 스위치와 TaqMan 프로브를 이용하여 이를 분석하는 원리를 보여주는 개략도이다.
도 9는 UDG 표적 효소에 의한 중합효소 활성 스위치와 TaqMan 프로브를 이용하여 이를 분석하는 원리를 보여주는 개략도이다.
도 10은 UDG 표적 효소에 의한 중합효소 활성 스위치의 실현 가능성 실험 결과를 나타낸 것이다. 즉, UDG에 특이적으로 반응하도록 디자인된 DNA 압터머(DNA aptamer)를 이용하여 UDG가 중합효소의 활성에 미치는 영향을 실험한 결과이다. (a) 프라이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. (b) 프라이머 신장 반응 50분 후의 형광세기의 변화. 여기서, F50과 F0은 각각 프라이머 신장 반응 50분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. UDG aptamer (1), UDG aptamer와 UDG 블로커(UDG blocker) (2), UDG aptamer, UDG 블로커(UDG blocker), 그리고 UDG (3), UDG aptamer와 컨트롤 UDG 블로커(control UDG blocker) (4), 그리고 UDG aptamer, 컨트롤 UDG 블로커(control UDG blocker), 그리고 UDG (5)을 갖는 샘플에 중합효소가 첨가되었다. 본 실험에서 사용된 중합효소, UDG aptamer, UDG 블로커(UDG blocker) 및 UDG의 최종농도는 각각 5.5nM, 200nM, 10nM 및 0.5U/mL이다.
도 11은 UDG 표적 효소의 검출 및 정량에 대한 본 시스템의 민감도 측정 실험 결과를 나타낸 것이다. 즉, 상기 실험을 통해 최적화된 조건을 바탕으로 서로 다른 농도의 UDG를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정한 결과이다. (a) 프라이머 신장(primer extension) 반응이 일어나는 동안 TaqMan 프로브의 형광세기 변화. UDG aptamer와 UDG 블로커(UDG blocker)로 구성된 UDG 검출 프로브 샘플에 다양한 농도의 UDG가 첨가되었다. (b) 다양한 농도의 UDG 존재하에서, 프라이머 신장(primer extension) 반응 50분 후의 형광세기의 변화. 여기서, F50과 F0은 각각 프라이머 신장 반응 50분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. (b)의 삽화: UDG 농도에 대해, 프라이머 신장 반응 50분 후의 형광신호의 변화를 나타낸 선형그래프(0-0.3U/mL). 본 실험에서 사용된 중합효소, UDG aptamer 및 UDG 블로커(UDG blocker)의 최종 농도는 각각 5.5nM, 200nM 및 10nM이다.
도 12는 UDG 표적 효소 검출 및 정량에 대한 본 시스템의 특이도 실험 결과를 나타낸 것이다. (a) 프라이머 신장(primer extension) 반응 50분 후의 형광세기의 변화. 여기서, F50과 F0은 각각 프라이머 신장 반응 50분 후와 0분 후 TaqMan 프로브의 형광세기. Blank (1), UDG (2), hAAG (3), hOGG1 (4), Fpg (5), BamHI (6), Exo I (7), 그리고 Lambda exonuclease (8)를 갖는 샘플에 중합효소가 첨가되었다. 본 실험에서 사용된 중합효소, UDG aptamer, UDG 블로커(UDG blocker), UDG 및 다른 효소의 최종농도는 각각 5.5nM, 200nM, 10nM, 0.5U/mL, 및 5U/mL이다.
발명의 상세한바 설명 및 람직한 구현예
본 발명에서는 저해제의 표지가 필요 없고 다양한 표적 핵산의 검출 및 정량에 보편적으로 적용될 수 있는 민감도가 우수한 효소 기반 검출 및 정량 시스템을 개발하였다. 본 발명에서는 DNA 신장(DNA extension) 반응을 수행하는 핵산 중합효소인 Taq DNA 중합효소 및 이에 특이적으로 결합하여 활성을 저해시키는 DNA 압터머(DNA aptamer)를 도입하였다(Dang et al., Journal of Molecular Biology, 264:268-278, 1996; Lin et al., Journal of Molecular Biology, 271:100-111, 1997; Yakimovich et al., Biochemistry-Moscow, 68:228-235, 2003). 구체적으로, 표적 핵산의 검출 및 정량을 위해 DNA 압터머(DNA aptamer)에 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 단일가닥 DNA를 포함하도록 디자인하였으며, 이 부분이 표적 핵산과의 결합을 통해 안정화될 경우에만 Taq DNA 중합효소와의 결합을 통해 중합효소 활성을 저해시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 블로커 DNA(blocker DNA)와의 결합을 통해서 중합효소 활성을 저해하는 DNA 압터머 시스템(DNA aptamer system)도 개발하였다. 여기서, 블로커 DNA(blocker DNA)는 표적 핵산과 상보적인 서열을 가지도록 설계되었기 때문에, 표적 핵산의 존재는 블로커 DNA(blocker DNA)를 DNA 압터머(DNA aptamer)로부터 분리시킨다. 결과적으로 DNA 압터머(DNA aptamer)는 더 이상 중합효소의 활성을 저해하지 못하게 되어 중합효소는 고유의 활성을 복구하게 된다.
이러한 표적 핵산과 DNA 압터머(DNA aptamer)의 상호작용을 통한 중합효소 활성 변화는 TaqMan 프로브에 기반을 두고 있는 프라이머 신장(primer extension) 반응을 통해 발생하는 형광신호를 실시간으로 확인함으로써 분석할 수 있었다. 본 발명은 기존의 핵산 기반 검출 기술과 비교하여(Hutter et al., Trends in Pharmacological Sciences, 34:497-507, 2013), 표적 핵산을 인식하는 부분과 이에 따라 발생하는 신호를 감지하는 부분이 따로 분리되어 있기 때문에, 신호를 감지하는 부분은 동일하게 유지하면서, 표적 핵산을 인식하는 부분의 구성요소인 DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 염기서열만의 변화를 통해 다양한 표적 핵산을 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 세포, 단백질, 소분자 물질 등을 특이적으로 인식하는 aptamer 서열을 블로커 DNA(blocker DNA)로 사용함으로써, 표적 핵산 외에도 다양한 생체물질 및 화학물질을 고감도로 검출 및 정량할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 본 발명에서 사용한 TaqMan 프로브 기반의 신호 발생 기술은 발색 및 전기화학기술 등으로 손쉽게 대체될 수 있다.
본 발명에서는 Taq DNA 중합효소를 특이적으로 인식하여 활성을 저해시키는 DNA 압터머(DNA aptamer)를 변형하여 표적 핵산과의 결합을 통해 안정화된 구조를 이룰 경우에만 중합효소의 활성을 저해시킬 수 있다는 사실을 규명하였으며, 이를 기반으로 다양한 표적 핵산의 검출 및 정량에 범용적으로 적용될 수 있는 새로운 방법을 개발해낼 수 있었다.
상기 시도된 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 조절 및 이를 기반으로 한 검출 및 정량 시스템의 개발은 보고된 바 없으며, 기존의 효소 기반의 핵산 검출 시스템과 비교하여 본 시스템은 DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 염기서열만의 변화를 통해 다양한 표적 핵산을 검출 및 정량할 수 있으며, 효소에 저해제를 표지하지 않고 간단하게 수행될 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 이 발명의 바탕이 되는 원리인 표적 물질에 의한 중합효소 활성 조절을 기반으로 표적 핵산 뿐만 아니라, 다른 생체물질 및 화학물질의 검출 및 정량에도 적용될 가능성을 가지고 있다.
본 발명에서 "핵산" 이란, 단일가닥이나 이중가닥의 DNA, RNA와 그 화학적 수식체를 의미하는데, 이러한 수식은 선별된 핵산의 증폭을 간섭하지 않는것으로, 이로서제한되는 것은 아니나, 백본(backbone) 수식, 메틸화, 이상 염기상 조합, 5-브로모-우라실의 치환 등을 포함한다.
본 발명에서 "압터머"란, 높은 친화성으로 타깃물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 본 발명의 압터머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 압터머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 96 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, post-SELEX 과정을 통해 보다 효율적인 20-30 뉴클레오티드 크기로 변형(modification)되어 사용될 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체 내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다.
본 발명의 압터머는, 본 명세서 중의 개시 및 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다. 압터머는, 통상적으로 SELEX법, 그 개량법[예컨대 Ellington et al., Nature, 346:818-822, 1990; Tuerk et al., Science, 249:505-510, 1990]을 이용함으로써 제작할 수 있다. 상기 SELEX법의 과정은 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 각각의 분자에 특이적인 DNA 서열을 알아내는 방법을 말한다(J.W. Park et al., Chemical Communications, 48(15):2071-2073, 2012). SELEX법으로는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 압터머가 농축되고, 선별된다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나, 및/또는 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 압터머, 결합 형태가 상이한 압터머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 압터머를 얻을 수 있는 경우가 있다.
본 발명의 압터머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예,-O-CHO기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 압터머는 또한 적어도 1종(예, 1,2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 압터머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 압터머는, 표적 물질 또는 표적 핵산에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예,리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화,O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예,-NH2)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 19:733-738, 1991; Cotton et al., Nucl . Acid. Res. 19:2629-2635, 1991; Hobbs et al., Biochemistry, 12:5138-5145, 1973 참조).
본 발명의 압터머는 또한, 표적 물질 또는 표적 핵산에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다.
또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성을 갖도록, 본 발명의 압터머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR',CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다. 변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, Myristoyl,Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, 그 외 지질, 스테로이드,콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다(미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호 참조).
압터머는, 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합, 리보오스를 이용한 소수결합 및 수소결합, 핵산염기를 이용한 수소결합이나 스태킹(stacking)결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합은 강하게, 단백질의 표면에 존재하는 리신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관련되어 있지 않은 핵산염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 핵산 염기는, 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 압터머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프 구조 등 염기쌍을 만들지 않은 구조에서도,핵산 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다.
리보오스의 2'부위의 수식에 관해서는, 드물게 리보오스의 2'부위의 관능기가 표적 분자와 직접적으로 상호작용하고 있는 경우가 있지만, 대부분의 경우 무관계이고, 다른 수식 분자로 치환 가능하다. 이와 같이 압터머는, 표적 분자와의 직접적인 결합에 관련되어 있는 관능기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 유지하고 있는 경우가 많다.
본 발명의 일 실시예에서는 스위치-오프(switch-off)형 표적 DNA 검출 및 정량 방법으로 다양한 단일가닥 염기서열을 포함하도록 디자인된 DNA 압터머(DNA aptamer)가 상보적인 표적 핵산과의 결합을 통해서 중합효소의 활성을 저해한다는 사실을 규명하는 실험을 수행하였다. 도 2의 (a)와 (b)에 나타난 바와 같이, DNA　aptamer의 단일가닥 염기서열에 상보적인 표적 핵산이 존재하는 경우에만, DNA 압터머(DNA aptamer)가 중합효소의 효소 활성을 저해하고 이에 따라 낮은 형광신호를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 표적 핵산의 존재하에서 DNA 압터머(DNA aptamer)가 중합효소를 저해하는 정도는 최초의 78-mer DNA 압터머(DNA aptamer)가 중합효소 활성을 저해시키는 정도와 유사함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 조절 현상을 성병(sexually transmitted disease)을 일으키는 병원균 중의 하나인 Urea(Ureaplasma urealyticum)의 검출 및 정량에 적용한 실험을 수행하였다. 도 3의 (a), (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, Urea DNA에 특이적으로 결합하도록 디자인된 DNA 압터머(DNA aptamer)의 경우, 표적 핵산인 Urea DNA가 존재하는 경우에만 중합효소의 활성을 저해시킨다는 사실을 확인할 수 있었다. 반면, 음성 대조군(negative control)으로 DNA 압터머(DNA aptamer)와 상호작용하지 않는 Chlamydia(Chlamydia trachomatis) DNA를 첨가한 경우, DNA 중합효소의 활성은 저해되지 않고 고유의 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 최적화된 조건을 바탕으로 서로 다른 농도의 Urea DNA를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, Urea DNA의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 저해되고, 결과적으로 감소된 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. Urea DNA의 농도가 0-10nM 구간에서 형광신호가 선형적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 검출한계는 0.91nM임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 스위치-오프(switch-off)형 표적 DNA 검출 및 정량 방법이 다양한 표적 핵산의 검출 및 정량을 위해 범용적으로 적용한 실험을 수행하였다. 따라서, 본 실험에서는 Chlamydia DNA에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA를 포함하는 DNA 압터머(DNA aptamer)를 디자인하였으며, 이를 서로 다른 농도의 Chlamydia DNA와 반응시켜보았다. 도 5에서, Chlamydia DNA의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 저해되고, 결과적으로 감소된 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. Chlamydia DNA의 농도가 0-10nM 구간에서 형광신호가 선형적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 검출 한계는 1.47nM임을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 사용된 압터머는 하기와 같다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region: 서열번호 21)).
오리지널 DNA 압터머(Original DNA aptamer): 5'-TTCT CGGT TGGT CTCT GGCG GAGC AAGA CCAG ACAA TGTA CAGT ATTG GCCT GATC TTGT GTAT GATT CGCT TTTC CC-3'(서열번호 1)
T20-압터머(T20-aptamer): 5'-TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT CAAT GTAC AGTA TTG-3'(서열번호 2)
랜덤1-압터머(Random1-aptamer): 5'-AGTC AGTC AGTC AGTC AGTC CAAT GTAC AGTA TTG-3'(서열번호 4)
랜덤2-압터머(Random2-aptamer): 5'-ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG CAAT GTAC AGTA TTG-3'(서열번호 6)
T20-압터머(리버스)(T20-aptamer(Reverse)): 5'-CAAT GTAC AGTA TTGT TTTT TTTT TTTT TTTT TTT-3'(서열번호 8)
유레아-특이적 압터머1(Urea-specific aptamer 1): 5'-TAGG ACGG TCAC CAGT ATTT TTAA TCAA TGTA CAGT ATTG-3'(서열번호 9)
Chlamydia-특이적 압터머(Chlamydia-specific aptamer): 5'-TACA AGCT GCAA TCCC TTTT AAGA TCAA TGTA CAGT ATTG-3'(서열번호 12)
유레아-특이적 압터머2(Urea-specific aptamer2): 5'-A AAT ACTG GTGA CCGT CCTA CAAT GTAC AGTA TTG-3'(서열번호 14)
UDG 압터머(UDG aptamer): 5'-TTTT AA TTTT AA TTTT CAA TGT ACA GTA TTG-3'(서열번호 18)
따라서, 본 발명은 제1 관점에서, (a) 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 상기 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료를 함유하는 혼합물에 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-표적 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 표적 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 표적 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 압터머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 12로 구성된 군에서 선택되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산은 A20-target(A20-타깃), 랜덤1-타깃(Random1-target), 랜덤2-타깃(Random2-target), 상보적 유레아-타깃 1(Complementary Urea-target 1), 비-상보적 Chlamydia-타깃 1(Non-complementary Chlamydia-target 1) 및 상보적 Chlamydia-타깃2(Complementary Chlamydia-target2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 (a) 단계의 혼합물을 90℃에서 5분간 가열한 후 25℃에 이르도록 0.1℃/s 비율로 천천히 식히고, 25℃에서 30분간 처리한 다음, 핵산 중합효소를 첨가하여, 핵산 중합효소와 압터머-표적 핵산 복합체를 결합시키는 반응을 20분간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 90℃에서 5분간 가열한 후 25℃에 이르도록 0.1℃/s 비율로 천천히 식히고, 25℃에서 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 60분간 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 핵산의 존재 여부를 분석하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 할 수 있다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법은 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머가 표적 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 특징을 이용하여 표적 핵산의 검출 및 정량을 하는 방법이다.
본 발명에서 "시료"란, 표적 핵산 또는 표적 물질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물로, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 객담, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 스위치-온(switch-on)형 표적 DNA 검출 및 정량 방법으로 작동하도록 디자인된 표적 핵산 검출 및 정량 시스템에서 표적 핵산에 의한 중합효소의 활성 조절 현상에 대한 실험을 수행하였다(도 7). 즉, Urea DNA를 특이적으로 인식하는 블로커 DNA(blocker DNA)를 디자인하였으며, 이에 적합한 DNA 압터머(DNA aptamer)를 구성하고 실험을 진행하였다. 블로커 DNA(blocker DNA) 농도가 증가함에 따라 중합효소 활성이 저해됨을 확인할 수 있었으며, 여기서 최적화된 20nM의 블로커 DNA(blocker DNA) 농도를 이용하여 Urea DNA 검출 및 정량을 진행하였다. 도 7의 (b)에 나타난 바와 같이, 표적 핵산인 Urea DNA가 존재하는 경우에만 (3), 중합효소가 활성화되고 높은 형광신호를 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 음성 대조군(negative control)인 Chlamydia DNA가 존재하는 경우 (4), 중합효소 활성은 계속 저해되고 낮은 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. 상기 실험을 통해서 선정된 조건에서 서로 다른 농도의 Urea DNA를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정하였다. 도 7 (c)와 (d)에 나타난 바와 같이, Urea DNA의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 상승하고, 결과적으로 높은 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. Urea DNA의 농도가 0-20nM 구간에서 형광신호가 선형적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 검출 한계는 2.67nM임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 제2 관점에서, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 압터머는 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산은 상보적 유레아-타깃 2(Complementary Urea-target 2) 또는 비-상보적 Chlamydia-타깃 2(Non-complementary Chlamydia-target 2)인 것을 특징으로 할 수 있으며,상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 할수 있으며, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 (a) 단계의 혼합물을 90℃에서 5분간 가열한 후 25℃에 이르도록 0.1℃/s 비율로 천천히 식히고, 25℃에서 30분간 처리한 다음, 핵산 중합효소를 첨가하여, 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 반응을 20분간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 구체적으로는 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 90℃에서 5분간 가열한 후 25℃에 이르도록 0.1℃/s 비율로 천천히 식히고, 25℃에서 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 60분간 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 핵산의 존재 여부를 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 블로커 핵산은 블로커 DNA(blocker DNA) 또는 블로커 RNA(blocker RNA)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 블로커 핵산은 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 가지는 유레아-특이적 블로커(Urea-specific blocker)인 것을 특징으로 할 수 있다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법은 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머가 블로커 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 특징을 이용하여 표적 핵산의 검출 및 정량을 하는 방법이다
본 발명의 또 다른 실시예에서는 스위치-온(switch-on)형 UDG 검출 및 정량방법으로 UDG에 특이적으로 반응하도록 디자인된 DNA 압터머(DNA aptamer)를 이용하여 UDG가 중합효소의 활성에 미치는 영향을 실험해본 결과, 도 10의 (a)와 (b)에 나타난 바와 같이, UDG 표적 효소가 존재하는 경우에만, 중합효소의 활성이 상승하게 되고 이에 따라 높은 형광신호를 발생함을 확인할 수 있었다 (3). 반면, DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 부분에 상보적인 블로커 DNA(blocker DNA)에 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase) 대신 티민(thymine)을 포함하는 DNA를 도입하여 실험을 수행한 경우, UDG의 존재 유무에 상관없이 중합효소의 활성이 DNA 압터머(DNA aptamer)에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다(4 및 5). 이를 통해, UDG에 의한 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase) 절단반응이 중합효소의 활성 복구에 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었으며, 이를 기반으로 UDG 효소 활성의 검출 및 정량이 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 실험을 통해 최적화된 조건을 바탕으로 서로 다른 농도의 UDG를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정하는 실험을 수행하였다(도 11). 그 결과, UDG의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 상승하고, 결과적으로 높은 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. UDG의 농도가 0-0.3U/mL 구간에서 형광신호가 선형적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 검출 한계는 0.024U/mL임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에서 개발된 표적 효소 분석 시스템의 특이도를 측정하는 실험을 수행하였다(도 12). 도 12의 결과에 나타난 바와 같이, hAAG(human alkyladenine DNA glycosylase) (3), hOGG1(human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1) (4), Fpg(formamidopyrimidine-DNA glycosylase) (5), BamHI (6), Exo I (7), 및 Lambda exonuclease (8) 이 존재하는 경우, DNA 압터머(DNA aptamer)에 의해 저해된 중합효소 활성은 회복되지 않고, 낮은 형광신호를 띄게 된다. 반면, 표적 효소인 UDG가 존재하는 경우, 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase)의 절단반응을 통해 단일가닥을 포함하는 DNA 압터머(DNA aptamer) 구조로 전환하게 되고, 이를 통해 중합효소는 활성화되고 결과적으로 높은 형광신호를 띄게 된다.
본 발명에서 "표적 물질"이란, 핵산, 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 단백질, 펩타이드, 압터머, 항원, 항체, 합텐(hapten), 저분자 물질, 거대 분자복합체 (macromolecular complex), 세포, 약학제제(pharmaceutical agent), 유기화합물 및 무기화합물 등으로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 저분자 물질이란 비스페놀 A 등과 같은 무극성의 저분자 화학물질 등을 포함한다.
따라서, 본 발명은 제3 관점에서, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 물질을 특이적으로 인식하고 결합하는 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응물을 분석하여 표적 물질을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 블로커 핵산은 표적 물질을 특이적으로 인식하고, 이에 결합하는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표적 물질은 핵산, 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 단백질, 펩타이드, 항원, 항체, 효소, 합텐(hapten), 저분자 물질, 거대분자 복합체(macromolecular complex), 세포, 약학제제(pharmaceutical agent), 유기화합물 및 무기화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기 화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 물질의 존재 여부를 분석하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법은 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머가 블로커 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 특징을 이용하여 표적 물질의 검출 및 정량을 하는 방법이다.
본 발명은 제4 관점에서, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 BER 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 BER 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응을(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응물을 분석하여 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 BER(Base Excision Repair) 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 압터머는 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 블로커 핵산은 BER 효소의 기질로서 사용되는 DNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 블로커 핵산은 BER 효소의 기질로서 사용되는 서열번호 19로 표시되는 염기서열을 가지는 UDG 블로커(UDG(uracil DNA glycosylase) blocker)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표적 BER 효소는 UDG(uracil DNA glycosylase)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 37℃로 서서히 냉각시킨 다음, BER(Base Excision Repair) 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료를 첨가하고, 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 표적 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 (a) 단계의 혼합물을 90℃에서 5분간 가열한 후 37℃에 이르도록 0.1℃/s 비율로 천천히 식히고, 37℃에서 20분간 처리한 다음, 표적 BER(Base Excision Repair) 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료를 첨가하고 37℃에서 30분간 처리한 다음, 25℃에 이르도록 0,1℃/s 비율로 천천히 식히고, 25℃에서 5분간 처리한 다음, 핵산 중합효소를 첨가하여, 25℃에서 20분간 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 반응을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 90℃에서 5분간 가열한 후 25℃에 이르도록 0.1℃/s 비율로 천천히 식히고, 25℃에서 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 60분간 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성을 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 표적 BER(Base Excision Repair) 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 검출 또는 정량 방법은 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머가 블로커 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 특징을 이용하여 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 검출 및 정량을 하는 방법이다.
본 발명은 제5 관점에서, (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 상기 표적 핵산 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 핵산 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및 (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산 효소의 활성을 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는, 표적 핵산 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 블로커 핵산은 표적 핵산 효소의 기질로서 사용되는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 핵산 효소의 활성을 분석하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 잇다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 표적 핵산 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법은 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머가 블로커 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징을 이용하여 표적 핵산 효소의 활성 검출 및 정량을 하는 방법이다.
도 1은 표적 핵산에 의한 핵산중합효소 활성 스위치(switch)와 TaqMan 프로브를 이용하여 이를 분석하는 원리를 보여주는 개략도이다. 더욱 구체적으로는, Taq DNA　중합효소에 특이적으로 결합하여 효소 활성을 저해시키는 DNA 압터머(DNA aptamer) 기반의 표적 핵산 검출 및 정량의 원리를 보여주는 개략도이다. 검출 및 정량하고자 하는 표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 단일가닥 DNA 부분을 포함하도록 디자인된 DNA 압터머(DNA aptamer)는 중합효소를 인식하지 못하고, 이에 따라 중합효소는 고유의 높은 활성을 띄게 된다.
반면, 표적 핵산이 존재하는 경우, DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 DNA 부분에 특이적으로 결합하게 되고 이를 통해 안정화된 DNA 압터머(DNA aptamer)는 중합효소와의 결합을 통해 효소 활성을 저해시키게 된다(1, Target recognition). 이렇게, 표적 핵산에 의해 조절된 중합효소 활성은 TaqMan 프로브에 기반을 두고 있는 프라이머 신장(primer extension) 반응을 통해서 분석할 수 있다.
표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 중합효소의 높은 활성을 통해 TaqMan 프로브의 절단반응을 유도하게 되고, 이에 따라 높은 형광신호를 띄게 된다. 반면, 표적 핵산이 존재하는 경우, DNA 압터머(DNA aptamer)에 의해서 효소 활성이 저해되기 때문에 TaqMan 프로브로부터 발생하는 형광신호는 감소하게 된다. 이와 같이 표적 핵산의 결합을 통한 DNA 압터머(DNA aptamer) 구조의 안정화 및 이를 통해 야기되는 중합효소 활성의 저해 및 형광신호 발생의 차이를 관찰함으로써 표적 핵산을 손쉽게 검출 및 정량할 수 있다.
또한, 본 발명은 표적 핵산을 인식하는 부분과 그에 따라 발생하는 신호를 감지하는 부분이 분리되어 있기 때문에, 신호를 감지하는 부분은 동일하게 유지하면서, 표적 핵산을 인식하는 부분의 구성요소인 DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 염기서열만을 변화시킴으로써 다양한 표적 핵산을 값싸고 손쉽게 분석해낼 수 있다는 장점을 가지고 있다.
도 6은 상기에서 구현된 스위치-오프 형(switch-off mode, signal-off mode) 외에도 스위치-온 형(switch-on mode, signal-on mode)에서 작동하는 발명을 구현하기 위해, 블로커 DNA(blocker DNA)의 도입을 통한 표적 핵산 검출 및 정량의 원리를 나타내는 개략도이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 검출 및 정량하고자 하는 표적 핵산이 존재하지 않는 경우, 블로커 DNA(blocker DNA)에 의해 안정화된 DNA 압터머(DNA aptamer)는 중합효소의 활성을 저해하게 되고, 이에 따라 낮은 형광신호를 띄게 된다. 반면, 표적 핵산이 존재하는 경우, 표적 핵산은 블로커 DNA(blocker DNA)를 DNA 압터머(DNA aptamer)로부터 분리시켜서 DNA 압터머(DNA aptamer)가 더 이상 중합효소의 활성을 저해하지 못하게 된다. 결과적으로 중합효소 활성은 상승하게 되고 높은 형광신호를 띄게 된다.
도 8은 본 발명을 응용한 표적 물질의 검출 및 정량 원리를 보여주는 개략도이다. 본 발명에서 블로커 DNA(blocker DNA)를 세포, 단백질, 소분자 물질 등을 특이적으로 인식할 수 있는 aptamer 염기서열로 설계하면 표적 물질의 존재가 블로커 DNA(blocker DNA)를 DNA 압터머(DNA aptamer)로부터 분리시키게 되고 중합효소는 고유의 효소 활성을 통해서 높은 형광신호를 생성할 수 있다. 결과적으로, 본 시스템에서 블로커 DNA(blocker DNA)의 염기서열을 조절함으로써, 표적 핵산뿐만 아니라, 표적 세포, 표적 단백질, 표적 소분자 물질 등을 분석할 수 있다.
도 9는 본 발명의 발명이 표적 효소의 활성 분석에 적용될 수 있다는 것을 보여주는 개략도이다. 다양한 표적 효소 중 하나의 표본으로 UDG(uracil DNA glycosylase)를 선정하였으며 DNA 압터머(DNA aptamer)에 포함된 단일가닥 DNA에 결합하는 상보적인 블로커 DNA(blocker DNA)가 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase)를 포함하도록 디자인하였다.
이를 통해, 검출 및 정량하고자 하는 표적 효소(UDG)가 존재하는 경우에만, 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase)의 절단반응이 이루어지게 되고 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase)를 포함하는(손실한) 블로커 DNA(blocker DNA)는 DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 부분으로부터 분리되게 된다. 이를 통해, 불안정화된 DNA 압터머(DNA aptamer)는 더 이상 중합효소를 저해하지 못하게 되고 결과적으로 중합효소의 활성은 상승하게 된다. 상승된 중합효소 활성은 TaqMan 프로브에 기반을 두고 있는 프프라이머 신장(primer extension) 반응을 통해 관찰된다.
상기 시도 되어진 표적 효소에 의한 중합효소 활성 조절 및 이를 기반으로 한 검출 및 정량 시스템은 TaqMan 프로브 기반의 신호를 읽어 들이는 과정은 동일하게 유지하면서, DNA 압터머(DNA aptamer)의 단일가닥 부분만을 변경해가며 다양한 표적 효소의 분석을 위한 시스템에 적용될 수 있는 장점을 가지고 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 스위치-오프(switch-off)형 표적 DNA 검출 및 정량 방법
반응 혼합물은 파트 A 및 파트 B로 별도로 분리하였다. 파트 A(총부피는 20μL)는 1X Taq 반응 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 4mM MgCl2), 500μM dNTPs, 400nM DNA 압터머(DNA aptamer), 및 다양한 농도의 상보적 타깃 DNA(complementary target DNA)로 구성되어 있으며, 90℃에서 5분간 가열한 후 천천히 25℃에 이르도록 식힌 다음(0.1℃/s), 25℃에서 30분간 처리(인큐베이션)하였다. 그다음, Taq DNA 중합효소(11nM)를 각 용액에 첨가하고, 20분간 처리하였다. 파트 B(총부피는 20μL)는 1X Taq 반응 완충액, 600nM 주형핵산(template), 600nM 프라이머, 및 500nM TaqMan 프로브는 90℃에서 5분간 가열한 후 천천히 25℃에 이르도록 식힌 다음(0.1℃/s), 25℃에서 60분간 처리하였다. 파트 A 및 파트 B를 혼합하고, C1000TM thermal cycler(Bio-Rad, CA, USA)로 형광을 측정하였다. 프라이머 신장 반응 중 TaqMan 프로브로부터 유래한 형광 시그널은 중합반응 온도 20∼30℃에서(바람직하게는, 25℃에서) 2분 간격으로 모니터링하였다. 실시예 1의 방법으로 하기 실험예 1∼4를 수행하였다.
실험예 1
도 2는 다양한 단일가닥 염기서열을 포함하도록 디자인된 DNA 압터머가 상보적인 표적 핵산과의 결합을 통해서 중합효소의 활성을 저해한다는 사실을 규명한 실험 결과를 나타낸 것이다. 표 1은 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸 것이다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region)). 도 2의 (a)와 (b)에 나타난 바와 같이, DNA 압터머의 단일가닥 염기서열에 상보적인 표적 핵산이 존재하는 경우에만, DNA 압터머가 중합효소의 효소 활성을 저해하고 이에 따라 낮은 형광신호를 나타냄을 확인할 수 있었다(2-5). 또한, 표적 핵산의 존재하에서 DNA 압터머가 중합효소를 저해하는 정도는 최초의 78-mer DNA 압터머가 중합효소 활성을 저해시키는 정도와 유사함을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2015011817-appb-T000001
실험예 2
도 3은, 도 2에서 확인된 표적 핵산에 의한 중합효소 활성 조절 현상을 성병(sexually transmitted disease)을 일으키는 병원균 중의 하나인 Urea(Ureaplasma urealyticum)의 검출 및 정량에 적용한 실험 결과를 나타낸 것이다. 표 2 는 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸 것이다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region)). 도 3의 (a), (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, Urea DNA에 특이적으로 결합하도록 디자인된 DNA 압터머의 경우, 표적 핵산인 Urea DNA가 존재하는 경우에만 중합효소의 활성을 저해시킨다는 사실을 확인할 수 있었다(2). 반면, 음성 대조군(negative control)으로 DNA 압터머와 상호작용하지 않는 Chlamydia(Chlamydia trachomatis) DNA를 첨가한 경우, DNA 중합효소의 활성은 저해되지 않고 고유의 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(3).
Figure PCTKR2015011817-appb-T000002
실험예 3
도 4는, 실험을 통해 최적화된 조건을 바탕으로 서로 다른 농도의 Urea DNA를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정한 결과를 나타낸 것이다. Urea DNA의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 저해되고, 결과적으로 감소된 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. Urea DNA의 농도가 0-10nM 구간에서 형광신호가 선형적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 검출한계는 0.91nM임을 확인할 수 있었다. 표 2 는 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸다.
실험예 4
도 5는 스위치-오프(switch-off)형 타깃 DNA 검출 및 정량 방법이 다양한 표적 핵산의 검출 및 정량을 위해 범용적으로 적용될 수 있음을 확인해 본 결과를 나타낸 것이다. 본 실험에서는 Chlamydia DNA에 특이적으로 결합하는 단일가닥 DNA를 포함하는 DNA 압터머를 디자인하였으며, 이를 서로 다른 농도의 Chlamydia DNA와 반응시켜보았다. 표 3은 본 실험에서 사용 되어진 DNA 염기서열을 나타낸 것이다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region)). 도 5에서, Chlamydia DNA의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 저해되고, 결과적으로 감소된 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. Chlamydia DNA의 농도가 0-10nM 구간에서 형광신호가 선형적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 검출 한계는 1.47nM임을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2015011817-appb-T000003
실시예 2: 스위치-온(switch-on)형 표적 DNA 검출 및 정량 방법
반응 혼합물은 파트 A 및 파트 B로 별도로 분리하였다. 파트 A(총부피는 20μL)는 1X Taq 반응 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 4mM MgCl2), 500μM dNTPs, 400nM DNA 압터머(DNA aptamer), 40nM 블로커 DNA(blocker DNA) 및 다양한 농도의 상보적 타깃 DNA(complementary target DNA)로 구성되어 있으며, 90℃에서 5분간 가열한 후 천천히 25℃에 이르도록 식힌 다음(0.1℃/s), 25℃에서 30분간 처리(인큐베이션)하였다. 그다음, Taq DNA 중합효소(11nM)를 각 용액에 첨가하고, 20분간 처리하였다. 파트 B(총부피는 20μL)는 1X Taq 반응 완충액, 600nM 주형핵산(template), 600nM 프라이머, 및 500nM TaqMan 프로브는 90℃에서 5분간 가열한 후 천천히 25℃에 이르도록 식힌 다음(0.1℃/s), 25℃에서 60분간 처리하였다. 파트 A 및 파트 B를 혼합하고, C1000TM thermal cycler(Bio-Rad, CA, USA)로 형광을 측정하였다. 프라이머 신장 반응 중 TaqMan 프로브로부터 유래한 형광 시그널은 중합반응 온도 20∼30℃에서(바람직하게는, 25℃에서) 2분 간격으로 모니터링하였다. 실시예 2의 방법으로 하기 실험예 5를 수행하였다.
실험예 5
도 7은 스위치-온 형(switch-on mode, signal-on mode)에서 작동하도록 디자인된 표적 핵산 검출 및 정량 시스템에서 표적 핵산에 의한 중합효소의 활성 조절 현상에 대한 실험결과를 나타낸 것이다. 본 실험에서는 Urea DNA를 특이적으로 인식하는 블로커 DNA(blocker DNA)를 디자인하였으며, 이에 적합한 DNA 압터머를 구성하고 실험을 진행하였다. 표 4는 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸 것이다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region)). 도 7의 (a)는 도입된 블로커 DNA(blocker DNA)의 농도를 최적화된 결과이다. 블로커 DNA(blocker DNA) 농도가 증가함에 따라 중합효소 활성이 저해됨을 확인할 수 있었으며, 여기서 최적화된 20nM의 블로커 DNA(blocker DNA) 농도를 이용하여 Urea DNA 검출 및 정량을 진행하였다. 도 7의 (b)에 나타난 바와 같이, 표적 핵산인 Urea DNA가 존재하는 경우에만 (3), 중합효소가 활성화되고 높은 형광신호를 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 음성 대조군(negative control)인 Chlamydia DNA가 존재하는 경우 (4), 중합효소 활성은 계속 저해되고 낮은 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. 상기 실험을 통해서 선정된 조건에서 서로 다른 농도의 Urea DNA를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정하였다. 도 7 (c)와 (d)에 나타난 바와 같이, Urea DNA의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 상승하고, 결과적으로 높은 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. Urea DNA의 농도가 0-20nM 구간에서 형광신호가 선형적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 검출 한계는 2.67nM임을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2015011817-appb-T000004
실시예 3: 스위치-온(switch-on)형 표적 UDG 검출 및 정량 방법
반응 혼합물은 파트 A 및 파트 B로 별도로 분리하였다. 파트 A(총부피는 2μL)는 1X Taq 반응 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 4mM MgCl2), 500μM dNTPs, 400nM UDG aptamer, 및 20nM UDG 블로커(UDG blocker)로 구성되어 있으며, 90℃에서 5분간 가열한 후 천천히 37℃에 이르도록 식힌 다음(0,1℃/s), 37℃에서 20분간 처리(인큐베이션)하였다. 그다음, 다양한 농도의 UDG, 또는 기타 효소인 hAAG, hOGG1, Fpg, BamHI, Exo I, 및 Lambda exonuclease를 각 용액에 첨가하고, 37℃에서 30분간 처리하였다. 상기와 같이 처리된 용액은 천천히 25℃에 이르도록 식힌 다음(0.1℃/s), 25℃에서 5분간 처리하였다. 그다음, Taq DNA 중합효소(11nM)를 각 용액에 첨가하고, 20분간 처리하였다. 파트 B(총부피는 20μL)는 1X Taq 반응 완충액, 600nM 주형핵산(template), 600nM 프라이머, 및 500nM TaqMan 프로브는 90℃에서 5분간 가열한 후 천천히 25℃에 이르도록 식힌 다음(0.1℃/s), 25℃에서 60분간 처리하였다. 파트 A 및 파트 B를 혼합하고, C1000TM thermal cycler(Bio-Rad, CA, USA)로 형광을 측정하였다. 프라이머 신장 반응 중 TaqMan 프로브로부터 유래한 형광 시그널은 중합반응 온도 20∼30℃에서(바람직하게는, 25℃에서) 2분 간격으로 모니터링하였다. 실시예 3의 방법으로 하기 실험예 6∼8를 수행하였다.
실험예 6
도 10은 UDG 에 특이적으로 반응하도록 디자인된 DNA 압터머를 이용하여 UDG가 중합효소의 활성에 미치는 영향을 실험해본 결과를 나타낸 것이다. 표 5는 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸 것이다. 도 10의 (a)와 (b)에 나타난 바와 같이, UDG 표적 효소가 존재하는 경우에만, 중합효소의 활성이 상승하게 되고 이에 따라 높은 형광신호를 발생함을 확인할 수 있었다 (3). 반면, DNA 압터머의 단일가닥 부분에 상보적인 블로커 DNA(blocker DNA)에 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase) 대신 티민(thymine)을 포함하는 DNA를 도입하여 실험을 수행한 경우, UDG의 존재 유무에 상관없이 중합효소의 활성이 DNA 압터머(DNA aptamer)에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다(4 및 5). 이를 통해, UDG에 의한 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase) 절단반응이 중합효소의 활성 복구에 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었으며, 이를 기반으로 UDG 효소 활성의 검출 및 정량이 가능함을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2015011817-appb-T000005
실험예 7
도 11은, 도 10에 나타난 바와 같이, 실험을 통해 최적화된 조건을 바탕으로 서로 다른 농도의 UDG를 첨가하였을 때 발생하는 형광신호를 측정한 결과이다. 표 5는 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region)). UDG의 농도가 증가할수록 중합효소 활성은 상승하고, 결과적으로 높은 형광신호가 발생함을 확인할 수 있었다. UDG의 농도가 0-0.3U/mL 구간에서 형광신호가 선형적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 검출 한계는 0.024U/mL임을 확인할 수 있었다.
실험예 8
도 12는 새롭게 개발된 표적 효소 분석 시스템의 특이도를 실험해 본 결과이다. 표 5는 본 실험에서 사용되어진 DNA 염기서열을 나타낸 것이다(밑줄: 보존된 염기서열(conserved region)). 도 12의 결과에 나타난 바와 같이, hAAG(human alkyladenine DNA glycosylase)(3), hOGG1(human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1)(4), Fpg(formamidopyrimidine-DNA glycosylase)(5), BamHI(6), Exo I(7), 및 Lambda exonuclease(8)이 존재하는 경우, DNA 압터머에 의해 저해된 중합효소 활성은 회복되지 않고, 낮은 형광신호를 띄게 된다. 반면, 표적 효소인 UDG가 존재하는 경우, 유라실 뉴클레오베이스(uracil nucleobase)의 절단반응을 통해 단일가닥을 포함하는 DNA 압터머 구조로 전환하게 되고, 이를 통해 중합효소는 활성화되고 결과적으로 높은 형광신호를 띄게 된다.
본 발명에 따르면, 표적 물질에 의한 DNA 압터머(DNA aptamer) 구조 변화를 통해 중합효소의 활성을 조절함으로써, 표적 핵산, 표적 단백질, 표적 소분자 물질, 표적 효소 활성 등을 표지 없이(label-free) 민감하게 검출 및 정량할 수 있는 방법을 제공하는 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (64)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량방법:
    (a) 표적 핵산을 특이적으로 인식하는 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 상기 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료를 함유하는 혼합물에 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-표적 핵산 복합체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및
    (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 표적 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 압터머는 표적 핵산과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 압터머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 12로 구성된 군에서 선택되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 압터머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 12로 구성된 군에서 선택되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시키는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  10. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 핵산의 존재 여부를 분석하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-오프 형(switch-off mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  14. 다음의 단계를 포함하는, 표적 핵산에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법:
    (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및
    (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산을 검출 또는 정량하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 압터머는 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 표적 핵산은 상보적 유레아-타깃 2(Complementary Urea-target 2) 또는 비-상보적 Chlamydia-타깃 2(Non-complementary Chlamydia-target 2)인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  20. 제14항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  21. 제14항에 있어서, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  23. 제14항에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  24. 제14항 또는 제23항에 있어서, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  26. 제14항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 핵산의 존재 여부를 분석하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  27. 제14항에 있어서, 상기 블로커 핵산은 블로커 DNA(blocker DNA) 또는 블로커 RNA(blocker RNA)인 것을 특징으로 하는 중합효소 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  28. 제14항에 있어서, 상기 블로커 핵산은 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 가지는 유레아-특이적 블로커(Urea-specific blocker)인 것을 특징으로 하는 중합효소 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산의 검출 또는 정량 방법.
  29. 다음의 단계를 포함하는, 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법:
    (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 물질을 특이적으로 인식하고 결합하는 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및
    (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응물을 분석하여 표적 물질을 검출 또는 정량하는 단계.
  30. 제29항에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 블로커 핵산은 표적 물질을 특이적으로 인식하고, 이에 결합하는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 표적 물질은 핵산, 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 단백질, 펩타이드, 항원, 항체, 효소, 합텐(hapten), 저분자 물질, 거대분자 복합체(macromolecular complex), 세포, 약학제제(pharmaceutical agent), 유기화합물 및 무기화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  37. 제29항에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  38. 제29항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 물질의 존재 여부를 분석하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  39. 제29항에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 물질의 검출 또는 정량 방법.
  40. 다음의 단계를 포함하는, 표적 BER(Base Excision Repair) 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법:
    (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 표적 BER 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 BER 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응을(primer extension)을 시키는 단계; 및
    (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응물을 분석하여 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성을 검출 또는 정량하는 단계.
  41. 제40항에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 압터머는 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 블로커 핵산은 BER 효소의 기질로서 사용되는 DNA인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  46. 제40항에 있어서, 상기 블로커 핵산은 BER 효소의 기질로서 사용되는 서열번호 19로 표시되는 염기서열을 가지는 UDG 블로커(UDG(uracil DNA glycosylase) blocker)인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  47. 제40항에 있어서, 상기 표적 BER 효소는 UDG(uracil DNA glycosylase)인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  48. 제40항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  49. 제40항에 있어서, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  50. 제40항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 37℃로 서서히 냉각시킨 다음, BER(Base Excision Repair) 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료를 첨가하고, 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 표적 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시키는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  51. 제40항에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  52. 제40항 또는 제51항에 있어서, 상기 (b) 단계의 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 약 90℃에서 약 5분간 가열한 후 약 25℃로 서서히 냉각시킨 다음, 주형핵산(template)에 프라이머 및 TaqMan 프로브를 결합시키는 반응을 수행한 다음, 상기 (a) 단계의 반응생성물과 혼합하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  53. 제40항에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  54. 제40항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성을 분석하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 BER(Base Excision Repair) 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  55. 다음의 단계를 포함하는, 표적 핵산 효소에 의해 조절되는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법:
    (a) 블로커 핵산(blocker nucleic acid)에 상보적인 단일가닥 핵산을 포함하는 압터머 및 상기 표적 핵산 효소에 특이적인 염기서열을 가지는 블로커 핵산을 함유하는 혼합물에 표적 핵산 효소를 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 핵산 중합효소를 첨가하고, 반응시켜 핵산 중합효소와 압터머-블로커 핵산 복합체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 반응생성물에 프라이머와 신호발생 물질을 함유하는 혼합물을 혼합하고, 프라이머 신장반응(primer extension)을 시키는 단계; 및
    (C) 상기 (b) 단계의 프라이머 신장반응을 분석하여 표적 핵산 효소의 활성을 검출 또는 정량하는 단계.
  56. 제55항에 있어서, 상기 압터머의 단일가닥은 블로커 핵산과 상보적 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 압터머는 블로커 핵산(blocker nucleic acid)과 결합 시 안정된 구조를 이룬 다음, 핵산 중합효소와 결합하여 상기 효소의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 압터머는 5' 말단 또는 3' 말단에 서열번호 21로 표시되는 보존된 부위(conserved region)를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 블로커 핵산은 표적 핵산 효소의 기질로서 사용되는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  60. 제55항에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 Taq DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  61. 제55항에 있어서, 상기 프라이머 신장반응의 온도는 20∼30℃인 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  62. 제55항에 있어서, 상기 신호발생 물질은 방사성 동위원소, 형광물질, 염료, 나노입자, 효소, 효소기질, 발광성 물질 및 전기화학적 작용기(electrochemical functional group)를 함유하는 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  63. 제55항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (b) 단계의 프라이머 신장반응에서 유래하는 신호를 검출 또는 정량함으로써 표적 핵산 효소의 활성을 분석하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
  64. 제55항에 있어서, 상기 신호발생 물질을 함유하는 혼합물은 주형핵산(template) 및 TaqMan 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 중합효소의 활성을 이용한 스위치-온 형(switch-on mode) 표적 핵산 효소의 활성 검출 또는 정량 방법.
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