CN106442827A - 一种利用流体动力色谱同时分离检测多组microRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用流体动力色谱同时分离检测多组microRNA的方法，属于生物化学领域。包括以下步骤：1)确定多组microRNA，设计互补配对的ssDNA序列，第一条ssDNA完全与第一条microRNA互补配对，第二条ssDNA在互补链碱基个数的基础上增加若干个碱基，作为分离标签，以此类推；2)将多组microRNA混合物与相对应设计好的互补ssDNA杂交，杂交后加入核酸荧光染料，发出强荧光信号；3)多组杂交后的双链混合物，通过低气压进样，并在高气压驱动下，在微纳毛细管内完成色谱分离，最后在毛细管尾端窗口完成定量检测。本发明方法可实现多组microRNA色谱分离，并进行实时高灵敏快速检测。

Description

一种利用流体动力色谱同时分离检测多组microRNA的方法
技术领域
本发明涉及一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，属于生物化学领域。该方法主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测和microRNA相关药物研究以及筛选。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长度为19～25个核苷酸(nt)的单链RNA序列，该序列具有内源性，不编码蛋白质，且高度保守。miRNA可与蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体。游离在细胞质和细胞核的miRNA,当其与目标mRNA完全互补配对时，会造成mRNA降解，当其与目标mRNA不完全互补配对时，会抑制mRNA翻译蛋白质，通过这种特殊作用，来实现基因表达调控的作用。已有研究证明，miRNA在动物、植物和真菌中的表达存在明显的差异性，从而影响细胞生长和发育过程。近年来，科学家已发现人体中存在的miRNA有2千多种，约占人类基因组的1％，但却参与调控约30％基因的表达。miRNA不仅影响人体内的细胞增殖、分化、发育、凋亡等生理过程，而且与人类心脏病、癌症、神经性疾病等密切相关。
目前，已经报道多种方法检测miRNA。传统的检测手段包括三种，第一种是Northern Bloting法，这种方法被认为是最经典的检测方法，但是该方法要求样品量多，特异性低，分析时间长，灵敏度低且不可区分序列差别少的miRNA。第二种是Microarray技术，该方法灵敏度和特异性有所提高，所需样品量也有所减少，但是Microarray技术的分析时间较长，灵敏性和特异性仍有待提高。第三种RT-PCR技术常被用来进行miRNA的定量分析，检测灵敏度得到大幅度提高，可以实现单分子高通量检测，但是RT-PCR技术分析链长较短的miRNA会使得实验设计非常复杂，理想的扩增技术也需要非常精确的循环温度控制。近期报道了一些检测miRNA的新方法，例如基于生物发光的检测、基于纳米颗粒的检测、基于酶方法的检测、基于修饰引物入侵法的检测、基于核酸序列的检测等。
毛细管流体动力色谱法是一种基于流体动力学的分离方法，即在窄内径、未经修饰的毛细管内达到多种样品分离的方法，该方法以低样品量、高选择性、高灵敏度、分析时间短、检测成本低等优点在分离聚合物颗粒、胶体颗粒和蛋白等得到广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时分离检测多组microRNA的方法。该方法灵敏度高、特异性强、分析时间短、检测成本低。
本发明是将毛细管流体动力色谱法引入到分子生物分析检测领域，首次利用流体动力色谱法分离检测多组microRNA。
本发明采用如下技术方案：
一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，包括以下步骤：
1)确定几组待分离检测的microRNA，设计与其互补的ssDNA；
其中假设几组待分离检测的microRNA依次为microRNA-1、microRNA-2、以此类推直到microRNA-n，则与microRNA-1、microRNA-2……microRNA-n互补的ssDNA以此为ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n；
ssDNA-1完全与microRNA-1互补，不添加其他碱基；ssDNA-2除了完全与microRNA-2互补的序列之外，另添加一定长度的碱基序列；ssDNA-3完全与microRNA-3互补的序列之外，还添加了相对ssDNA-2具有一定长度的的碱基序列，以此类推，ssDNA-n相对ssDNA-n-1增加有一定长度的碱基序列，在ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n中增加的碱基序列可以相同也可以不同，但ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n均不互相杂交缠绕；以此类推，ssDNA-n总是比ssDNA-n-1多出一定数量的碱基，构成分离标签；
ssDNA-n总是比ssDNA-n-1多出至少10个碱基；
2)设计好的ssDNA分别与microRNA杂交，杂交条件：95℃变性5min，温度降至42℃退火25min；杂交后得到杂交双链；杂交后加入核酸荧光染料，反应10min；
3)杂交后加入核酸荧光染料的体系在高纯氮气(如不低于99.9％)低压下进样，在未经任何修饰的裸微纳毛细管内分离；分离后，在毛细管尾端进行激光诱导荧光检测器定量。
优选的是，设计的ssDNA自身不会杂交缠绕，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零，具有相当稳定的单链结构且与人体中已发现的基因组保持最小相似度，相关检测干扰达到最低。
优选的是，杂交时，microRNA溶于DEPC处理水中，ssDNA溶于1×TE，两互补杂交单链摩尔比1:1。
优选的是，所述微纳毛细管内径在400-1100nm之间，总长度40-70cm，有效长度35-65cm。
优选的是，所用缓冲溶液1×TE溶液，浓度10-100mM，pH7.5-8.5。
优选的是，所述核酸荧光染料为YoYo-1、或具有结合在双链之间后发出荧光的核酸染料。
优选的是，步骤3)进样时低压控制在20-300psi，进样时间控制在5-60s，分离时高压控制在700-1600psi。
优选的是，激光功率采用10-50mW，光电倍增器采用200-700mV。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和良好效果：
1)运用流体动力色谱分离的原理，将多组microRNA混合物分离，实现多组份同时检测。
2)高灵敏度：采用窄内径毛细管，低气压低浓度短时间进样，样品量仅几个纳升，激光诱导荧光检测大大提高了检测的灵敏度
3)高特异性：采用完全互补的两条单链，增加碱基识别的特异性，更有利于microRNA与ssDNA杂交，结合后的双链更牢固。
4)分析时间短：整个分离检测操作1小时内完成。
5)检测成本低：本方法采用了价格便宜的TE缓冲液和核酸荧光染料。
6)无污染：整个检测过程不需要用到有机溶剂或有毒试剂。
附图说明
图1为本发明实施例分离标签的构建示意图。
图2为本发明实施例的整个流体动力色谱分离系统示意图。
图3为本发明实施例分离检测三种microRNA所得到的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的内容、目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合说明书附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域内的技术人员所熟知的一般替换也涵盖在本发明的保护范围内。
实施例1(以检测3组microRNA为例)
1.microRNAs检测探针体系的设计
选定的三组目标microRNA为
hsa-let-7a-5p：5’UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 3’
hsa-miR-99b-5p：5’CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 3’
has-miR-182-5p：5’UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU3’
设计ssDNA：
ssDNA-1(与let7a互补)：
5’AACTATACAACCTACTACCTCA 3’
ssDNA-2(与miR99b互补):
5’CGCAAGGTCGGTTCTACGGGTGATTGTGTCTCTCTGCAG3’
ssDNA-3(与miR182互补):
5’AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAATATTTCATCGCGCTGCCTATCCATTGTTGTC 3’
其中，需要说明的是，设计的ssDNA序列中下划线部分为另外设计的分离标签序列，ssDNA自身不会缠绕在一起，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零，具有相当稳定的单链结构且与人体中已发现的基因组保持最小相似度，相关检测干扰达到最低。
2.实验部分
1)将订购的microRNA干粉离心1min，转速设置为10000转/分钟，加入适量DEPC处理水，震荡3min至充分溶解。
2)将订购的ssDNA干粉离心1min，转速设置为10000转/分钟，加入适量1×TE缓冲液(pH＝8.0)，震荡3min至充分溶解。
3)配制好的microRNA和ssDNA摩尔比1:1。两条互补链分别杂交，杂交条件：95℃变性5min，温度降至42℃退火25min。杂交后加入YoYo-1荧光染料，YoYo-1与杂交双链的摩尔比为1:10。
4)将两个杂交双链混合，采用750nm内径，50cm总长，45cm有效长度毛细管，高纯氮气100psi压力下进样15s，1500psi压力下分离。
5)流体动力色谱系统分离检测过程(附图2)，激光功率采用20mW，光电倍增器采用360mV。
6)系统分离检测三组microRNA所得到的色谱图(附图3)。
尽管本发明已以较佳实施例公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，所述实施例仅为了便于说明而已，对于熟悉本领域的人员而言，在不脱离本发明精神和范围的前提下可作若干的更动与润饰，本发明所主张的保护范围应以权利要求书所述为准。

Claims (9)

1.一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)确定几组待分离检测的microRNA，设计与其互补的ssDNA；
其中假设几组待分离检测的microRNA依次为microRNA-1、microRNA-2、以此类推直到microRNA-n，则与microRNA-1、microRNA-2……microRNA-n互补的ssDNA以此为ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n；
ssDNA-1完全与microRNA-1互补，不添加其他碱基；ssDNA-2除了完全与microRNA-2互补的序列之外，另添加一定长度的碱基序列；ssDNA-3完全与microRNA-3互补的序列之外，还添加了相对ssDNA-2具有一定长度的的碱基序列，以此类推，ssDNA-n相对ssDNA-n-1增加有一定长度的碱基序列，在ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n中增加的碱基序列可以相同也可以不同，但ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n均不互相杂交缠绕；以此类推，ssDNA-n总是比ssDNA-n-1多出一定数量的碱基，构成分离标签；
2)设计好的ssDNA分别与microRNA杂交，杂交条件：95℃变性5min，温度降至42℃退火25min；杂交后得到杂交双链；杂交后加入核酸荧光染料，反应10min；
3)杂交后加入核酸荧光染料的体系在高纯氮气低压下进样，在未经任何修饰的裸微纳毛细管内分离；分离后，在毛细管尾端进行激光诱导荧光检测器定量。
2.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，ssDNA-n比ssDNA-n-1多出至少10个碱基。
3.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，设计的ssDNA自身不会杂交缠绕，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零，具有稳定的单链结构且与人体中已发现的基因组保持最小相似度。
4.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，杂交时，microRNA溶于DEPC处理水中，ssDNA溶于1×TE，两互补杂交单链摩尔比1:1。
5.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所述微纳毛细管内径在400-1100nm之间，总长度40-70cm，有效长度35-65cm。
6.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所用缓冲溶液1×TE溶液，浓度10-100mM，pH7.5-8.5。
7.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所述核酸荧光染料为YoYo-1、或具有结合在双链之间后发出荧光的核酸染料。
8.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，步骤3)进样时低压控制在20-300psi，进样时间控制在5-60s，分离时高压控制在700-1600psi。
9.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，激光功率采用10-50mW，光电倍增器采用200-700mV。
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