CN104730128B - 一种检测b族链球菌的电化学传感器及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及一种检测B族链球菌的电化学传感器及其制备与应用。所述传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极金电极表面固定捕获探针所得，所述传感器还包括与所述捕获探针相匹配的模板探针、延伸探针、检测探针。所述传感器可以用于灵敏、快速、特异地检测GBS。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及一种检测B族链球菌的电化学传感器及其制备与应用。
背景技术
B族链球菌(GBS)是一种革兰阳性球菌，正常寄居于人体的阴道和直肠，属于一种条件致病菌，能引起严重的败血症和新生儿脑膜炎感染，是造成孕妇产褥感染的主要致病菌，也是产妇死亡的四大原因之一。GBS在孕妇中的感染率高达20％-40％，其中母婴垂直传播的比例高达75％并且会有将近1％受感染的婴儿发展成早发型的GBS败血症。鉴于上述GBS的高感染性和危害性，对孕妇进行产前筛查显得尤为必要。根据2002年美国疾病控制与预防中心发布的GBS预防指南中指出，对于怀孕35-37周的孕妇，进行阴道或直肠的病菌培养。这些准则的实施降低了早发型GBS新生儿的发病率，在1000个存活的婴儿中，发病率从1.5降到了0.3。当前诊断GBS的金标准，是在选择性的肉汤培养基中培养阴道或者直肠拭子上的分泌物，整个过程需要48小时。这种培养的方法能直观的做出结果判读，容易展开成本低，可进行药敏学分析，但是其耗时长，特别不适合临产时孕妇不知道自身是否有GBS感染的情况，且48h以上GBS培养难度较高，灵敏度低，实验操作人员需要较深的经验。此外，细菌抗原检测操作简便，成本较低，但是需要培养后进行检测，花费时间较长，且B族链球菌血清型较多，容易造成漏检，灵敏度相对较低；全面自动化的微生物自动分析鉴定系统也需花费较长的时间，成本高且设备昂贵。目前，临床上采用的最广的方法是实时荧光PCR，采用设计好的荧光探针，PCR法进行核酸扩增，该探针是选择B族链球菌的表面免疫源性蛋白(基因ID：1012782)的保守序列，该序列在所有GBS中都存在，此方法与标准的细菌培养方法在GBS检测的敏感性和特异性方面均达到90％以上，重复性好，检测快速，操作简单，但操作过程需要不断的温度循环，专门的PCR实验室及荧光PCR仪，且需设计引物，从而限制了该方法的使用。
因此，为适应临床诊断治疗，特别是床旁检测(POCT)的需求，现有技术旨在建立一种GBS电化学传感器用于GBS快速、灵敏、特异及符合POCT要求的检测手段。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测B族链球菌(GBS)的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极金电极表面固定捕获探针(Capture Probe)所得，所述传感器还包括与所述捕获探针(CaptureProbe)相匹配的模板探针(Template Probe)、延伸探针(Extension Probe)、检测探针(Detection Probe)。
优选地，所述模板探针(Template Probe)与延伸探针(Extension Probe)之间有多个碱基互补配对，所述模板探针(Template Probe)与延伸探针(Extension Probe)分别与待测B族链球菌单链DNA靶序列(GBS ssDNA)的不同部位之间有多个碱基互补配对，所述模板探针(Template Probe)、延伸探针(Extension Probe)与待测B族链球菌单链DNA靶序列(GBS ssDNA)结合后在DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用下，形成单链RNA，所述单链RNA与检测探针(Detection Probe)以及所述捕获探针(Capture Probe)均互补结合。
优选地，所述待测B族链球菌单链DNA靶序列(GBS ssDNA)如SEQ ID NO.1所示，具体为：
GAC ACC AGA AGC AGC AAC AAC GAT TGT TTC GCC AAT GAA GAC ATA TTC TTCTGC GCC AG。
优选地，所述模板探针(Template Probe)与延伸探针(Extension Probe)之间有5～7个碱基互补配对。更优选地，所述模板探针(Template Probe)与延伸探针(ExtensionProbe)之间有6个碱基互补配对。
优选地，所述模板探针(Template Probe)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
具体为：5’-GTG GCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATAGTG AGT CGT ATT AAA ACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-3’。
优选地，所述延伸探针(Extension probe)的核苷酸序列SEQ ID NO.3～5所示。
具体地：
当T/E碱基配对个数为6时，模板探针(Template Probe)的核苷酸序列为：5’-GTGGCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAAACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；延伸探针(Extension probe)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTCGTT-3’(SEQ ID NO.3)；
当T/E碱基配对个数为5时，模板探针(Template Probe)的核苷酸序列为5’-GTGGCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAAACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；延伸探针(Extension probe)的核苷酸序列为5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GT-3’(SEQ ID NO.4)。
当T/E碱基配对个数为7时，模板探针(Template Probe)的核苷酸序列为：5’-GTGGCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAAACG AAC GAA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；延伸探针(Extension probe)的核苷酸序列为：
5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GTT T-3’(SEQ ID NO.5)。
进一步优选地，所述模板探针(Template Probe)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：5’-GTG GCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTGAGT CGT ATT AAA AAC GAA CTA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-3’。
进一步优选地，所述延伸探针(Extension probe)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GTA TTC GTT-3’。
当所述模板探针(Template Probe)和所述延伸探针(Extension probe)分别有两个碱基与待测B族链球菌单链DNA靶序列有两个碱基不互补时，三者之间结合时，会形成一个带有空泡的不完美T型结构，大大减小了模板探针和延伸探针与靶序列之间结合的空间位阻，从而大大降低了背景信号，提高了信噪比，使实验结果更为理想。
优选地，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：5'-TTT TTTTTT GTG GCT GTT CTA GGT AAT CG-3'。
更优选地，所述检测探针为生物素(Biotin)修饰的检测探针，核苷酸序列为：
5'-Biotin-TTT TTT TTT GTG GCT GTT CTA GGT AAT CG-3'。
优选地，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：
5'-ATG CCT GGG AAA GTC CCC TCT TTT TT-3'。
优选地，所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，核苷酸序列为：
5'-ATG CCT GGG AAA GTC CCC TCT TTT TT-SH-3'。
优选地，每个所述工作电极上，含有所述捕获探针的摩尔量为1pmol～10pmol，更优选为2pmol。
进一步地，所述电化学传感器中的参比电极和对电极与工作电极构成三电极系统。
优选地，所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极(Ag/AgCl)之任意一种；更优选地，所述参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl)电极。
优选地，所述对电极为铂丝电极。
优选地，所述电化学传感器还进一步包括链霉亲和素标记的碱性磷酸酶和含α-NP的缓冲液。
更优选的，所述缓冲液为二乙醇胺(DEA)缓冲液。
本发明第二方面提供了前述电化学传感器中的工作电极的制备方法，所述方法为先在基底电极金表面固定捕获探针，而后进行封闭电极所得。
优选地，所述工作电极按照以下步骤制备：
(1)金电极表面处理：将金电极表面进行抛光处理，使其表面光洁；
(2)固定捕获探针：将捕获探针滴涂在处理干净的金电极表面；
(3)封闭电极：封闭非特异性吸附位点，即得工作电极。
优选地，步骤(1)中，可采用氧化铝粉对所述基底电极进行抛光处理。
优选地，步骤(2)中，所述捕获探针的浓度为100～1000nmol/L。更优选为200nmol/L。
所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，步骤(3)中，采用MCH、BSA封闭非特异性吸附位点。
本发明第三方面提供了一种检测B族链球菌(GBS)的方法，为采用前述的电化学传感器对样品中的B族链球菌(GBS)进行检测，所述方法具体包括以下步骤：
(a)聚合延伸：将延伸探针(Extension Probe)和模板探针(Template Probe)与待测B族链球菌靶序列(GBS ssDNA)溶解，混合，变性，恢复室温；然后加入DNA聚合酶，聚合延伸，得聚合延伸产物；
(b)将步骤(a)所得聚合延伸产物，加入T7RNA聚合酶，转录扩增，得转录扩增产物，加入检测探针，得转录扩增产物与检测探针的结合物；
(c)将步骤(b)所得转录扩增产物与检测探针的结合物加到前述构建的电化学传感器的修饰有捕获探针工作电极上，孵育，反应一段时间；加链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，孵育；
(d)将步骤(c)所得工作电极置于含α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液中，并将工作电极、参比电极以及对电极正确连接到电化学工作站上，用差分脉冲伏安(DPV)进行测定。
优选地，步骤(a)中，所述模板探针(Template Probe)的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或6所示。
优选地，步骤(a)中，所述延伸探针(Extension probe)的核苷酸序列SEQ ID NO.3～5或7所示。
优选地，步骤(a)中，所述延伸探针(Extension probe)的浓度为2nM。
优选地，步骤(a)中，所述模板探针(Template probe)的浓度为2nM。
优选地，步骤(a)中，用于稀释所述延伸探针(Extension probe)、模板探针(Template probe)以及待测GBSDNA的溶剂选用1x转录缓冲液。
优选地，步骤(a)中，所述DNA聚合酶选自Klenow fragment或Phi29DNA聚合酶。
优选地，步骤(a)中，所述聚合延伸的反应时间为15～75min。更优选为45min。
优选地，步骤(b)中，所述T7RNA聚合酶的浓度为0.13～0.67U/μL。更优选为0.4U/μL。
优选地，步骤(b)中，所述转录扩增的反应时间为1～3h。更优选为2h。
优选地，步骤(c)中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
更优选地，所述检测探针(Extension probe)的5’端做的标记为生物素(Biotin)修饰。
优选地，所述检测探针(Extension probe)的浓度为500～10000nmol L-1，更优选为500nmol L-1。
优选地，步骤(c)中，所述反应的温度为4～37℃。更优选为25℃。
优选地，步骤(d)中，所述含α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液中，α-NP的浓度为0.25～1.5mg ml-1；最佳为1.00mg mL-1。
优选地，步骤(d)中，所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极(Ag/AgCl)之任意一种；更优选地，所述参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl)电极。
优选地，步骤(d)中，所述对电极为铂丝电极。
上述方法可以是非疾病诊断目的方法，例如用于科研目的，研究B族链球菌(GBS)的致病机理，或者与其他疾病之间的关联等等。
本发明第四方面提供了前述电化学传感器或检测方法在快速检测低量B族链球菌(GBS)中的用途。
优选地，所述低量是指B族链球菌(GBS)浓度范围为1fM—1nM。
进一步的，本发明的检测原理阐述如下：
在均相反应体系中，延伸探针(Extension Probe)和模板探针(Template Probe)和待测B族链球菌靶序列(GBSssDNA)之间根据碱基互补原则能够形成T型结构；在DNA聚合酶的作用下，延伸探针(Extension Probe)以模板探针(Template Probe)为模板沿5’→3’延伸形成双链结构；当加入T7RNA聚合酶时，T7RNA聚合酶识别所述双链结构上的T7启动子，沿5’→3’转录合成大量的单链RNA，所述单链RNA与生物素修饰的检测探针之间通过碱基互补配对结合。然后上述均相反应体系滴加到已经修饰有捕获探针的金电极表面，捕获探针与单链RNA通过碱基互补配对结合，检测探针上的生物素与链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶结合，将碱性磷酸酶引入电极表面，将带有碱性磷酸酶的工作电极在底物溶液α-NP中能够产生电化学信号，通过检测电化学信息即可获知待测B族链球菌的量。
本发明的有益效果为：
(1)本发明研制了一种基于有缺陷的T型结构介导的转录方法的电化学传感器，所述传感器可以用于灵敏、快速、特异地检测GBS。所述GBS电化学传感器的线性范围为1fM—1nM，线性方程式为Y＝3.82033E-7+2.05397E-7LogX，检测限位0.4fM,线性相关系数为0.999。
(2)特异性好：本发明首先制得Extension Probe(延伸探针)和Template Probe(模板探针)，两条探针的引入大大增加了对靶序列GBS的识别特异性，所述GBS电化学传感器能特异性的识别区别GBS和其它不同的细菌核苷酸序列。
(3)检测速度快：现有的电化学DNA生物传感器大多是基于目标识别、信号放大和电信号输出这几个过程，这些过程总是被分离或者在传感器表面直接反应，会引起强大的空间位阻、低的杂交效率和酶动力学，造成传感器低的灵敏度和重现性，从而使检测基因组DNA变得困难。和传统的检测过程相比，本发明设计了特殊的延伸探针和模板探针，进行目标的识别和信号放大，而后再采用捕获探针和检测探针进行检测，此时的结合过程更加迅速，结合效率更高，大大简化了操作过程。采用本发明的GBS电化学传感器，能够大大缩短检测时间，整个检测过程不超过4.5h，非常适合床旁检测(POCT)的需求。
(4)灵敏度高：现有的电化学传感器对于基因组的检测很困难，通常会结合PCR进行特异性片段的扩增。本方法不需进行PCR即可测定基因组DNA，可达104CFU mL-1，即最低可检测到400个细菌每微升。
(5)综上所述，本发明成功构建了可用于检测GBS的电化学传感器，应用本发明的传感器，对GBS的测定显示了灵敏度高、稳定、重现性好的能力。与现有技术比较，本发明的传感器成本低，操作简单方便，检测周期短，特异性好，假阳性率和假阴性率低。适用于实际样品的测定和临床标本的测定等，能成为具有实际临床应用价值的传感器。
附图说明
图1：对实施例1中所得的T/E/GBS、聚合延伸产物及转录扩增产物用琼脂糖凝胶电泳和电化学过程进行验证
图1A中第3、4、5显示，T(模板探针)、E(延伸探针)和GBS能结合，在KF酶的作用下能够聚合延伸，在T7RNA Polymerase的作用下，能转录扩增出大约40bp的核酸片段；
图1B中显示，只有同时加入KF和T7RNA Polymerase时，才能够得到理想的电化学信号；
图1A.琼脂糖凝胶电泳对实验的可行性进行表征
条带1为500bp的Marker；
条带2为GBS；
条带3为T/E；
条带4为T/E/GBS；
条带5为KF作用产物；
条带6为T7RNA Polymerase作用产物；
条带7为500bp的Marker。
图1B.构建电化学生物传感器对实验进行验证
a为空白；
b为不加KF酶时获得的电化学信号；
c为不加T7RNA Polymerase获得的电化学信号；
d为同时加入KF酶和T7RNA Polymerase时获得的电化学信号。
图2：模板探针与延伸探针碱基配对个数优化实验，信噪比随着碱基配对个数的不同而不同，当T/E碱基配对个数为6时，信噪比为最大值，说明这个碱基配对个数为最佳。
图3：当模板探针与延伸探针的碱基配对个数为6时，完美的T型结构与不完美T型结构的电化学测定图
a为完美的T型结构电化学信号图；b为不完美的T型结构(有缺陷的T型结构)的电化学信号图。
图4：为考察转录扩增产物与捕获探针杂交的温度对使用GBS电化学传感器检测结果的影响，本实验采用了不同的杂交温度(4℃，25℃，37℃)，然后进行电化学检测，结果显示，信噪比最佳的杂交温度为25℃。
图5：为考察聚合延伸体系中反应时间对使用传感器检测效果的影响，本实验采用了含不同反应时间(15，30,45,60,75min)的反应缓冲体系，然后进行电化学检测，结果显示聚合延伸体系的最佳反应时间为45min。
图6：为考察T7RNA Polymerase的浓度对使用GBS电化学传感器的影响，本实验采用了不同浓度的T7RNA Polymerase(0.13，0.27,0.4,0.53,0.67U/μL)，然后进行电化学检测，结果显示，最佳浓度为0.4U/μL。
图7：为考察转录扩增体系中反应时间对使用传感器的影响，本实验采用了不同反应时间(1,1.5,2,2.5,3h)，然后进行电化学检测。结果显示，转录扩增体系的最佳反应时间为2h。
图8：实施例4对电化学传感器的性能分析所得标准曲线，结果显示当GBSssDNA浓度在1fM到1nM之间时，得到的电化学信号与GBSssDNA浓度的对数呈线性相关，线性方程为Y＝3.82033E-7+2.05397E-7LogX，检测限位0.4fM,线性相关系数为0.999。
图9：实施例5电化学传感器的特异性和准确性分析，配对四格表卡方检验P<0.01，回归分析回归系数为0.961，P<0.01。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1制备电化学传感器并检测GBS
1.材料与方法
1.1材料
Klenow Fragment(KF),T7RNA Polymerase，DEPC,RNase Inhibitor，dNTPmixture
solution和NTP mixture solution购于上海生工。6-Mercapto-1-hexanol(MCH),α-naphthyl
phosphate(α-NP),链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(streptavidin-alkalinephosphatase，
ST-ALP),deionized formamide购于Sigma-Aldrich(中国，上海)。HPLC纯化的DNA由
上海生工合成。临床标本来源于重庆医科大学附属第一医院。
1.2检测仪器
上海辰华CHI660D电化学工作站，检测系统为三电极系统，包括参比电极为Ag/AgCl电极、对电极为铂丝电极、工作电极直径为3mm的金电极。
1.3检测原理
在均相反应体系中，延伸探针(Extension Probe)和模板探针(Template Probe)和待测B族链球菌靶序列(GBSssDNA)之间根据碱基互补原则能够形成T型结构；在DNA聚合酶的作用下，延伸探针(Extension Probe)以模板探针(Template Probe)为模板沿5’→3’延伸形成双链结构；当加入T7RNA聚合酶时，T7RNA聚合酶识别所述双链结构上的T7启动子，沿5’→3’转录合成大量的单链RNA，所述单链RNA与生物素修饰的检测探针之间通过碱基互补配对结合。然后上述均相反应体系滴加到已经修饰有捕获探针的金电极表面，捕获探针与单链RNA通过碱基互补配对结合，检测探针上的生物素与链霉亲和素标记的碱性磷酸酶结合，将碱性磷酸酶引入电极表面，将带有碱性磷酸酶的工作电极在底物溶液α-NP中能够产生电化学信号，通过检测电化学信息即可获知待测B族链球菌的量。
2.工作电极的制备
(1)金电极表面处理：
用0.05μm铝粉对金电极进行抛光处理至“镜面状”，去离子水超声清洗3次，每次1min；
然后用食人鱼溶液(H2SO4:H2O2＝3:1)处理金电极3次，每次3min，去离子水冲洗干净后室温晾干；
(2)固定捕获探针：将10μL 200nmol/L巯基标记的捕获探针滴加在处理好的电极表面，放入4℃冰箱过夜；
所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，具体序列为：5'-ATG CCT GGG AAA GTC
CCC TCT TTT TT-SH-3'。
(3)采用MCH、BSA封闭电极：捕获探针组装好的电极表面用Tris-HCl洗液冲洗电极三次后，滴加10μL 1mM MCH封闭1h。重复冲洗电极，用2％BSA进一步封闭金电极，从而封闭非特异性吸附位点，得工作电极备用。
3.采用延伸探针和模板探针对GBSssDNA进行聚合延伸和转录扩增
(1)聚合延伸：将T(模板探针)，E(延伸探针)和待测GBS ssDNA分别溶解于1×转录缓冲溶液中，得到T(模板探针)溶液(浓度为2nM)、E(延伸探针)溶液(浓度为2nM)、待测GBSssDNA溶液(2nM)，以三者体积比为1:1:2混合，95℃变性，缓慢恢复至室温备用，得含GBS/T/E的反应体系。
构建聚合延伸反应体系：
将所述聚合延伸反应体系在41℃下反应45min后，在75℃条件下灭活10min，得聚合延伸产物。
(2)转录扩增
构建转录扩增反应体系：
将所述转录扩增反应体系在37℃下反应2h，转录扩增产物。
(3)将转录扩增产物滴加到步骤2中制备好的含有捕获探针的工作电极上室温杂交反应1h。
(4)用DEA溶液冲洗电极3次后，在电极表面滴加10μL包含1.25μg/mL ST-ALP和10mg/mL BSA的溶液，室温反应30min。
(5)以现配制的含1mg mL-1α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液作为反应缓冲体系，将经步骤(4)处理后的工作电极置于其中，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在室温下，用差分脉冲伏安法(DPV)进行测定。
实施例2验证GBS电化学传感器的可行性
1.对T/E/GBS、聚合延伸产物及转录扩增产物的验证
对实施例1中所得的T/E/GBS、聚合延伸产物及转录扩增产物用琼脂糖凝胶电泳和电化学过程进行验证，如图1A中第3、4、5显示，T(模板探针)、E(延伸探针)和GBS能结合，在KF酶的作用下能够聚合延伸，在T7RNA Polymerase的作用下，能转录扩增出大约40bp的核酸片段。图1B中也可看到，只有同时加入KF和T7RNA Polymerase时，才能够得到理想的电化学信号。
如图1A:
条带1为500bp的Marker；
条带2为GBS；
条带3为T/E；
条带4为T/E/GBS；
条带5为KF作用后所得聚合延伸产物；
条带6为T7RNA Polymerase作用后转录扩增产物；
条带7为500bp的Marker。
如图1B所示，为本发明实施过程的电化学DPV图，其中
a为空白；
b为不加KF酶时获得的电化学信号；
c为不加T7RNA Polymerase获得的电化学信号；
d为同时加入KF酶和T7RNA Polymerase时获得的电化学信号。
实施例3GBS电化学传感器及其使用条件的优化
我们还对实验过程中几个重要的条件即T/E碱基互补配对个数、有缺陷T型结构介导转录放大对于T型结构介导的转录放大的优化、转录扩增产物和DP杂交的温度、聚合延伸的时间、T7RNA Polymerase的浓度、转录扩增体系的反应时间这几个测定条件进行了进一步的优化，对每一个优化条件都由低浓度到高浓度分别选取至少五个点进行一系列实验。
1.为考察T/E碱基互补配对个数对GBS电化学传感器检测结果的影响，本实验采用了不同的碱基配对个数构建GBS电化学传感器。如图2可见，信噪比随着碱基配对个数的不同而不同，当T/E碱基配对个数为6时，信噪比为最大值，说明这个碱基配对个数为最佳。
当T/E碱基配对个数为6时，T(模板探针)的核苷酸序列为：5’-GTG GCT GTT CTAGGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA ACG AAC GAAACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；E(延伸探针)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GTT-3’(SEQ ID NO.3)。
当T/E碱基配对个数为5时，T(模板探针)的核苷酸序列为5’-GTG GCT GTT CTAGGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA ACG AAC GAAACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；E(延伸探针)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GT-3’(SEQ ID NO.4)。
当T/E碱基配对个数为7时，T(模板探针)的核苷酸序列为：5’-GTG GCT GTT CTAGGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA ACG AAC GAAACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；E(延伸探针)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GTT T-3’(SEQ ID NO.5)。
2.同理，为考察有缺陷T型结构介导转录放大相对于完美型T型结构介导的转录放大的优势，本实验设计了T/E探针中各有两个互不互补的游离碱基，使T/E探针与靶序列GBS三链结合时形成一个空泡结构。对两种结构分别进行电化学测定，如图3所示，a为完美的T型结构电化学信号图；b为不完美的T型结构(有缺陷的T型结构)的电化学信号图，可见，有缺陷的T型结构有一个较大的信噪比值，说明这个设计是成功的。此时，形成有缺陷T型结构的T(模板探针)的核苷酸序列为：5’-GTG GCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGA AAGTCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA AAC GAA CTA ACA ATC GTT GTT GCT GCT TCTGGT-P-3’(SEQ ID NO.6)；E(延伸探针)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTCTTC ATT GTA TTC GTT-3’(SEQ ID NO.7)。
所述的形成完美T型结构的(模板探针)的核苷酸序列为：5’-GTG GCT GTT CTAGGT AAT CGA TGC CTG GGA AAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA ACG AAC GAAACA ATC GTT GTT GCT GCT TCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.2)；E(延伸探针)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TAT GTC TTC ATT GGC TTC GTT-3’(SEQ ID NO.3)。
3.同理，为考察1条件中转录扩增产物与捕获探针杂交的温度对使用GBS电化学传感器检测结果的影响，本实验采用了不同的杂交温度(4℃，25℃，37℃)，然后进行电化学检测。如图4可见，信噪比最佳的杂交温度为25℃。
4.同理，为考察聚合延伸体系中反应时间对使用传感器检测效果的影响，本实验采用了含不同反应时间(15，30,45,60,75min)的反应缓冲体系，然后进行电化学检测，如图5可见，聚合延伸体系的最佳反应时间为45min。
5.同理，为考察1条件中T7RNA Polymerase的浓度对使用GBS电化学传感器的影响，本实验采用了不同浓度的T7RNA Polymerase(0.13，0.27,0.4,0.53,0.67U/μL)，然后进行电化学检测。如图6可见，最佳浓度为0.4U/μL。
6.同理，为考察转录扩增体系中反应时间对使用传感器的影响，本实验采用了不同反应时间(1,1.5,2,2.5,3h)，然后进行电化学检测。如图7可见，转录扩增体系的最佳反应时间为2h。
实施例4.制备的GBS电化学传感器的性能分析
为了评估本发明GBS电化学传感器的性能，在最优实验条件下，对以1x转录缓冲液配备的不同浓度的GBSssDNA标准品进行分析。具体的，所述最优实验条件如下：
1.工作电极的制备
(1)金电极表面处理：
用0.05μm铝粉对金电极进行抛光处理至“镜面状”，去离子水超声清洗3次，每次1min；
然后用食人鱼溶液(H2SO4:H2O2＝3:1)处理金电极3次，每次3min，去离子水冲洗干净后室温晾干；
(2)固定捕获探针：将10μL 200nmol/L巯基标记的捕获探针滴加在处理好的电极表面，放入4℃冰箱过夜；
所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，具体序列为：5'-ATG CCT GGG AAA GTCCCCTCT TTT TT-SH-3'。
(3)采用MCH、BSA封闭电极：捕获探针组装好的电极表面用Tris-HCl洗液冲洗电极三次后，滴加10μL 1mM MCH封闭1h。重复冲洗电极，用2％BSA进一步封闭金电极，从而封闭非特异性吸附位点，得工作电极备用。
2采用延伸探针和模板探针对GBS进行聚合延伸和转录扩增
(1)聚合延伸：将T(模板探针)和E(延伸探针)分别溶解于1×转录缓冲溶液中，待测GBS ssDNA标准品溶于1x转录缓冲液中，得到T(模板探针)溶液(浓度为2nM)、E(延伸探针)溶液(浓度为2nM)、待测GBS ssDNA标准品溶液(0.001nmol/ml,0.01nmol/ml,0.1nmol/ml,1nmol/ml,10nmol/ml，100nmol/ml，1000nmol/ml)，以三者体积比为1:1:2混合，95℃变性，缓慢恢复至室温备用，得含GBS/T/E的反应体系。
构建聚合延伸反应体系：
将所述聚合延伸反应体系在41℃下反应45min后，在75℃条件下灭活10min，得聚合延伸产物。
T(模板探针)的核苷酸序列为：5’-GTG GCT GTT CTA GGT AAT CGA TGC CTG GGAAAG TCC CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT AAA AAC GAA CTA ACA ATC GTT GTT GCT GCTTCT GGT-P-3’(SEQ ID NO.6)；E(延伸探针)的核苷酸序列为：5’-GGC GCA GAA GAA TATGTC TTC ATT GTA TTC GTT-3’(SEQ ID NO.7)；所述GBS ssDNA的核苷酸序列为：GAC ACCAGA AGC AGC AAC AAC GAT TGT TTC GCC AAT GAA GAC ATA TTC TTC TGC GCC AG(SEQ IDNO.1)。
(2)转录扩增
构建转录扩增反应体系：
将所述转录扩增反应体系在37℃下反应2h，转录扩增产物。所述DP(检测探针)的核苷酸序列为：5’Biotin-TTT TTT TTT GTG GCT GTT CTA GGT AAT CG-3’，浓度为500nM。
(3)将转录扩增产物滴加到步骤1中制备好的含有捕获探针的工作电极上室温杂交反应1h，所述室温为亦即25℃。
(4)用DEA溶液冲洗电极3次后，在电极表面滴加10μL包含1.25μg/mL ST-ALP和
10mg/mL BSA的溶液，室温反应30min。
(5)以现配制的含1mg mL-1α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液作为反应缓冲体系，将经步骤(4)处理后的工作电极置于其中，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在室温下，用差分脉冲伏安法(DPV)进行测定，电化学信号的变化，绘制标准曲线，如图8所示。检测实验结果显示，当GBSssDNA浓度在1fM到1nM之间时，得到的电化学信号与GBSssDNA浓度的对数呈线性相关，线性方程为Y＝3.82033E-7+2.05397E-7LogX，检测限位0.4fM,线性相关系数为0.999。将传感器在空白溶液(是指没有GBS标准品加入反应体系的溶液)中重复检测3次，根据空白信号加上3倍标准差所对应的信号值估计检出限，计算得0.4fM。
实施例5.制备的GBS电化学传感器临床标本分析
GBS电化学传感器的特异性，在分析不分离的生物样本中的基因序列时具有重要的作用，主要取决于设计的两条具有缺陷的T型结构T、E探针的特异性。为评价本传感器的特异性和准确性，我们对临床标本进行检测。具体的，将临床上取得的直肠和阴道拭子标本提取基因组DNA，然后用实施例4所构建的GBS电化学传感器进行测定。和临床采用的荧光PCR检测方法(该实验方法采用的试剂盒为TIB的B族链球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法))，比较进行统计分析，结果如图9所示，配对四格表卡方检验P<0.01，回归分析回归系数为0.961，P<0.01。这些结果说明制备的GBS电化学传感器能够有效的分别其他种类的基因组DNA,具有良好的特异性。和临床上所用的荧光PCR相比，两者的检测结果相同，且对于荧光PCR方法的临界值检测有一个更好的检测性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种检测B族链球菌的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为在基底电极金电极表面固定捕获探针所得，所述传感器还包括与所述捕获探针相匹配的模板探针、延伸探针、检测探针；所述模板探针与延伸探针之间有5～7个碱基互补配对；所述模板探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或6所示；所述延伸探针的核苷酸序列如SEQID NO.3～5或7任一序列所示；所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述电化学传感器中的工作电极的制备方法，所述方法为先在基底电极金表面固定捕获探针，而后进行封闭电极所得。
3.一种非疾病诊断目的的检测B族链球菌(GBS)的方法，所述方法具体包括以下步骤：
(a)聚合延伸：将延伸探针、模板探针及待测B族链球菌靶序列分别溶解，混合，变性，恢复室温；然后加入DNA聚合酶，聚合延伸，得聚合延伸产物；
(b)将步骤(a)所得聚合延伸产物，加入T7RNA聚合酶，转录扩增，得转录扩增产物，加入检测探针，得转录扩增产物与检测探针的结合物；
(c)将步骤(b)所得转录扩增产物与检测探针的结合物加到前述构建的电化学传感器的修饰有捕获探针工作电极上，孵育，反应一段时间；加链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，孵育；
(d)将步骤(c)所得工作电极置于含α-NP的二乙醇胺(DEA)缓冲液中，并将工作电极、参比电极以及对电极正确连接到电化学工作站上，用差分脉冲伏安(DPV)进行测定。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述T7RNA聚合酶的浓度为0.13～0.67U/μL。
5.根据权利要求1所述的电化学传感器或权利要求3～4任一方法在快速检测低量B族链球菌中的用途。
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