CN115948512A - 一种基于dna纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒，该检测方法使用表面经发夹DNA分子修饰的纳米粒子作为纳米机器人，捕获核酸标志物，然后在DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，实现纳米机器人的行走，以发夹DNA分子为模板产生dsDNA链，实现信号放大；再与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在或计算核酸标志物的浓度。本发明的特异性强，检测灵敏度高，检测限宽，并且无需专业的荧光PCR设备和实验条件，方便快捷，成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，涉及与疾病相关核酸检测，具体涉及一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒。
背景技术
随着医学、生命科学的发展，对诸多疾病病理的研究越来越深入，疾病发展早期的一些标志物逐渐被发现，特别是与基因突变和蛋白表达过程相关的一些分子往往在病症之前出现。针对这些标志物分子，通过早期检测，能够实现在疾病初期的诊断、治疗，从而显著改善预后。例如，口腔鳞状细胞癌是一类高发病率的恶性肿瘤，极大影响了人类的健康。Hsa-miRNA31-5p(miRNA-31)是早期口腔鳞状细胞癌的可靠标志物，在患者唾液中即可检出，但因其含量较低，在样本中准确检测微量的miRNA-31成为了一个挑战。传统检测miRNA的方法主要为RNA印迹术(Northern blotting)、定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)等，但这些方法非常耗时，且引物设计繁琐，存在假阳性问题，并且需要昂贵的检测仪器，以及受过专业训练的专业检测人员进行操作。更便捷、准确性高、成本低廉的检测手段有待开发。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法。
其技术方案如下：
一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其关键在于，
S1，提供一种靶向纳米粒子，该靶向纳米粒子由纳米粒子表面连接发夹DNA分子形成，该发夹DNA分子包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，所述核酸标志物具有能够与所述环区结合的单链；
S2，将分散于缓冲液中的靶向纳米粒子、DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，待测样本中的核酸标志物与所述发夹DNA分子结合，在所述靶向纳米粒子表面行走，从而使所述发夹DNA分子以其自身为模板产生dsDNA链，实现信号放大，此时所述靶向纳米粒子转化为双链修饰纳米粒子；
S3，将步骤S2孵育后的液体或所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；
S4，根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在，或与预先根据梯度标准试样建立的标准曲线对比，判断核酸标志物的浓度。
作为优选，上述纳米粒子为Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子，所述纳米粒子表面经链霉亲和素修饰；
所述发夹DNA分子连接有生物素，所述发夹DNA分子通过生物素-链霉亲和素相互作用连接到所述纳米粒子上。
作为优选，上述步骤S2中，孵育温度为37℃，时间30min。
作为优选，上述电化学传感器包括金电极，所述金电极上预先修饰有DNA报告探针，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成复合物并在金电极表面滚动，同时剪切所述DNA报告探针以释放出电化学分子，从而使金电极信号发生变化；
步骤S3中，将活化孵育后的液体滴加到金电极上。
作为优选，上述DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5’端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3’端与所述金电极连接。
作为优选，步骤S4中，读取在电化学传感器上反应30min的电信号值进行判断和计算核酸标志物浓度。
本发明的目的之二在于提供一种试剂盒。
其技术方案如下：
一种试剂盒，其关键在于包括：链霉亲和素化的纳米粒子；
发夹DNA分子，包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，该发夹DNA分子的3’端脱氧核苷酸连接有生物素，该发夹DNA分子与其互补序列形成的DNA双链具有能够被Cas12a蛋白识别的原间隔基序(PAM序列)；
引物，能够与所述发夹DNA下游特异性识别；
DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、缓冲液；
CRISPR/Cas12a试剂，包括crRNA和Cas12a蛋白，其中crRNA具有与所述发夹DNA分子相对应的核苷酸片段；以及
固定有DNA报告探针的电化学传感器电极。
作为优选，上述链霉亲和素化的纳米粒子为表面修饰有链霉亲和素的Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子。
作为优选，上述电化学传感器电极包括金电极，所述金电极上修饰有DNA报告探针，该DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5’端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3’端与所述金电极表面连接。
作为优选，上述DNA报告探针的的碱基序列如SEQ NO.10所示。
作为优选，上述核酸标志物为Hsa-miRNA31-5p(miRNA-31)，其碱基序列如SEQNO.3所示；
所述发夹DNA分子的碱基序列如SEQ NO.1所示，所述引物的碱基序列如SEQ NO.2所示，所述crRNA的碱基序列如SEQ NO.4所示。
附图说明
图1为本发明的检测原理示意图；
图2为PAGE实验验证ISAR(invading stacking primer amplificationreaction)和CRISPR/Cas12的反应可行性的PAGE电泳实验结果；
图3为链霉亲和素化的Fe3O4纳米粒子(A)、表面结合发夹DNA后(B)以及进行ISAR反应后(C)粒子表面电位变化；
图4为ISAR反应后双链修饰的Fe3O4纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物具有切割报告探针能力的验证实验结果；
图5为金电极电流信号随着检测反应体系反应时间的变化曲线；
图6为使用本发明的方法检测不同浓度miR-31试样的结果，其中：(A)金电极电流信号与电压关系曲线；(B)金电极电流信号与核酸标志物浓度关系拟合曲线；
图7为用于检测口腔鳞状细胞癌标志物miR-31的试剂盒特异性试验结果，其中：(A)添加不同核酸试样进行测试的金电极电流信号对比；(B)分别以标准缓冲液和唾液作为miR-31溶剂制备的不同浓度核酸试样进行测试的金电极电流信号对比。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例一核酸标志物检测方法
一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，原理如图1所示，其过程为：
S1，提供一种靶向纳米粒子，该靶向纳米粒子由纳米粒子表面连接发夹DNA分子形成，该发夹DNA分子包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，所述核酸标志物具有能够与所述环区结合的单链；
S2，将分散于缓冲液中的靶向纳米粒子、DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，待测样本中的核酸标志物与所述发夹DNA分子结合，在所述靶向纳米粒子表面行走，从而使所述发夹DNA分子以其自身为模板产生dsDNA链，实现信号放大，此时所述靶向纳米粒子转化为双链修饰纳米粒子；
S3，步骤S2孵育后的液体或所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；
S4，根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在，或与预先根据梯度标准试样建立的标准曲线对比，判断核酸标志物的浓度。
步骤S2中，靶向纳米粒子通过其表面的发夹DNA分子将核酸标志物捕获，与核酸标志物结合的发夹DNA分子的发夹被打开，然后引物与发夹DNA分子结合，在DNA聚合酶的催化作用下，引物延伸并与发夹DNA分子形成互补结合的双链(dsDNA)，并逐渐置换出核酸标志物，使之与相邻的一个发夹DNA分子结合，再次重复上述过程，实现DNA行走，这一反应过程称为ISAR反应(invading stacking primer amplification reaction)，最终得到双链修饰纳米粒子。靶向纳米粒子、DNA聚合酶和核酸标志物即形成DNA行走机器人。在这一步骤中，由少量的核酸标志物孵育得到大量的dsDNA，信号得到显著放大。
待测样本为人体或动物体体液或经预处理以释放RNA或/和DNA后的液体，如组织裂解液或细胞裂解液；核酸标志物可以是单链的RNA或DNA，直接存在于液体样本中，或者存在于外泌体中。
所述步骤S2中，孵育温度为37℃，时间30min。
在一种实施方式中，所述纳米粒子为Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子，所述纳米粒子表面经链霉亲和素修饰。所述发夹DNA分子连接有生物素，所述发夹DNA分子通过生物素-链霉亲和素相互作用连接到所述纳米粒子上。
在一种实施方式中，所述电化学传感器包括金电极，所述金电极上预先修饰有DNA报告探针。具体地，所述DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5’端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3’端与所述金电极连接，这种DNA报告探针选择非特异性探针。
所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成复合物，使其顺式切割和侧链反式切割被激活，复合物在金电极表面滚动，同时剪切所述DNA报告探针以释放出电化学分子，从而使金电极信号发生变化。步骤S3中，将活化孵育后的液体滴加到金电极上，同时观测电化学传感器电信号的变化情况。双链修饰纳米粒子、CRISPR/Cas12a以及修饰有DNA报告探针的金电极形成DNA滚动机器人体系，以CRISPR/Cas12a作为动力酶。
以一种口腔鳞状细胞癌核酸标志物Hsa-miRNA31-5p(miRNA-31)为例，具体说明上述方法。
实验材料
试剂：Cas12a(Cpf1)，品牌NEB，货号M0653T；DNA聚合酶Bst 3.0，品牌：NEB，货号M0374S；BeyoMagTMStreptavidin Magnetic Beads(链霉亲和素磁珠)，品牌：Beyotime/碧云天，货号：P2151-1ml，粒径约200nm。6-巯基-1-己醇(MCH)、三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、TE缓冲液以及其他化学试剂均为市售分析纯试剂。
实验所用的核酸均委托上海生工生物工程公司合成，各核酸的碱基序列如表1所示。
表1核酸序列
实验方法
实验过程如图1所示：①金电极和纳米粒子的准备：将MB-hpDNA(序列如Seq IDNo.10)通过其5’端的巯基连接到金电极表面，得到修饰有DNA报告探针的金电极；另一方面，将40ul链霉亲和素化磁珠(Fe3O4粒子)分别在TBS、DEPC处理过的0.1M NaCL清洗3min，去除上清液，再用TE缓冲液30ul重悬。②结合发夹DNA：将20ul浓度为10uM的Biotin-hDNA(序列如Seq ID No.1)加入准备好的磁珠，室温孵育30min。③进行ISAR反应：将孵育后的磁珠与含有核酸标志物miRNA-31(序列如Seq ID No.3)的样本反应，核酸标志物被磁珠上的hDNA捕获，再在引物(序列如Seq ID No.2)和DNA聚合酶的作用下，在37℃反应30min，这个过程是等温扩增和DNA行走的过程，得到双链修饰纳米粒子。④激活Cas蛋白并检测电信号：将双链修饰纳米粒子加入组装好的Cas12a-crRNA缓冲液，激活Cas12a蛋白，然后滴加在预先孵育好DNA报告探针的金电极上，在37℃下反应，观测电信号的变化。
电泳实验验证ISAR和CRISPR/Cas12的反应可行性
模拟上述方法的反应过程，将miR-31(序列如Seq ID No.3)、Biotin-hpDNA、DNA聚合酶、单链DNA(ssDNA，序列如Seq ID NO.11)、Cas12a和crRNA(序列如Seq ID No.4)添加到缓冲液中进行孵育，形成模拟反应体系；同时为研究各个组分的影响，对照组中省去一种或几种组分，同样进行孵育。其中单链DNA作为测试Crispr/Cas12a活性的底物。孵育完成后的溶液进行PAGE电泳分析，以各单独组分作为marker。
如图2所示，第4泳道的条带显示出ISAR反应后生成的dsDNA；第6泳道的原始样本溶液中因为没有miR-31加入，故不能产生dsDNA，也不能激活Cas蛋白剪切底物ssDNA；相反第7泳道的原始样本溶液中有miR-31加入，故能进行反式切割产生dsDNA。本实验表明，ISAR反应和Crispr/Cas12a反应具有可行性。
Fe3O4纳米粒子进行不同处理后的表面电位变化
分别取链霉亲和素磁珠、经上述方法步骤②处理后的磁珠、经步骤③处理并分离的磁珠，分散后按照常规方法进行Zeta电位测试。如图3所示，三种磁珠的Zeta电位越来越低，这与上述方法各步骤处理后预期的表面变化一致。由于核酸带负电荷，步骤②处理后的磁珠表面结合有发夹DNA分子(Biotin-hDNA)，步骤③处理后磁珠表面因为ISAR反应产生了大量dsDNA。
荧光试验验证反应体系中CRISPR/Cas12a的核酸切割能力
模拟上述方法的反应过程，在反应体系中加入FQ-ssDNA作为报告探针(reporter)，FQ-DNA的碱基序列如Seq ID NO.12，其3’端连接荧光基团，5’端连接淬灭基团，当FQ-ssDNA链断裂时，淬灭基团远离荧光基团，然后发出荧光。将miR-31、Biotin-hpDNA、DNA聚合酶、FQ-ssDNA、Cas12a和crRNA添加到缓冲液中进行孵育，检测荧光强度变化。同时，以反应体系中不加入FQ-ssDNA或Cas12a作为对照。
如图4所示，在各关键组分均存在时，FQ-DNA才能被CRISPR/Cas12a切割并产生荧光。表明，经过ISAR反应后的体系中，CRISPR/Cas12a的切割能力确实被激活。
反应体系在金电极上反应使得金电极电流信号的变化
按照本实验的操作进行测试，将组装好的纳米机器人试剂滴加10ul至金电极上，在室温反应30min后蒸馏水冲洗，放入PBS(0.01M,pH＝7.2-7.5)中进行差分脉冲伏安法(DPV)测定(DPV参数:Init E-0.5V,Final E 0V,Incr E0.004V,Amplitude 0.05V.)。步骤④中，持续检测并记录电流变化。如图5所示，反应液滴加到电极上后，电流逐渐减小，至30min时信号趋于稳定。因此，在进行检测时，优选以在电极上反应30min的电信号作为测量信号值。
检测范围和灵敏性
分别配制不同浓度的miR-31试样进行测试，读取30min中的电流值，分别绘制电流-电压曲线，并拟合建立电流变化幅度与miR-31浓度关系曲线。如图6所示，检测结果表明，本检测体系非常灵敏，检测下限为LOD＝3.5Fm，并且在10fM-10nM的浓度范围内有很好的线性关系。建立的电流信号变化幅度△I％与核酸标志物试样浓度的对数lgc关系方程为：
△I％＝17.1lgc+45.4，R2＝0.995。
检测特异性
按照本实验的方法进行测试，分别取几种唾液常见的肿瘤标志物miRNA作为对照，代替miR-31进行实验，这些miRNA分别为miR-10b(序列如Seq ID No.5)、miR-141(序列如Seq ID No.6)、miR-153(序列如Seq ID No.7)、miR-21(序列如Seq ID No.8)，并设置一组阴性对照(NC，序列如Seq ID No.9)。各组试样配制为1×10-8M，分别测量电流信号的变化。此外，分别以标准缓冲液(Buffer组)和两例健康志愿者的唾液作为溶剂配制不同浓度的miR-31试样，也进行上述测试。
如图7(A)所示，添加有miRNA-31的试样组的电流信号变化幅度显著高于其余各对照组，表明本反应体系具有很好的靶标特异性；同时以标准缓冲液和真实唾液作为溶剂配制的miR-31试样测试结果一致，如图7(B)所示，表明本反应体系不受真实口腔环境中各种物质的干扰，稳定性好。
基于上述方法，提供一种检测试剂盒。
实施例二核酸检测试剂盒
一种试剂盒，包括：链霉亲和素化的纳米粒子；
发夹DNA分子，包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，该发夹DNA分子的3’端脱氧核苷酸连接有生物素；
引物，能够与所述发夹DNA下游特异性识别；
DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、缓冲液；
CRISPR/Cas12a试剂，包括crRNA和Cas12a蛋白，其中crRNA具有与所述发夹DNA分子相对应的核苷酸片段；以及
固定有DNA报告探针的电化学传感器电极。
本领域人员容易理解，根据CRISPR/Cas12a系统的工作原理，crRNA分子中与所述发夹DNA分子相对应的核苷酸片段是指该核苷酸片段与发夹DNA的部分碱基序列一致，只是T被U取代。这一核苷酸片段能够与ISAR反应后以发夹DNA分子为模板产生的dsDNA结合。同时，发夹DNA分子与其互补序列形成的双链dsDNA具有能被Cas12a靶向识别的原间隔基序(protospacer adjacent motif，PAM)。在crRNA引导下Cas12a与dsDNA结合后，能够实现Cas12a蛋白的激活，对dsDNA靶序列进行特异性切割，同时附带非特异性切割ssDNA的活性。
具体地，所述链霉亲和素化的纳米粒子为表面修饰有链霉亲和素的Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子。
所述电化学传感器电极包括金电极，所述金电极上修饰有DNA报告探针，该DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5’端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3’端与所述金电极表面连接。一种DNA报告探针的的碱基序列如SEQ NO.10所示。
本领域人员容易理解，针对不同的靶标——核酸标志物，只需要针对性地设计发夹DNA分子、引物以及crRNA，即可得到能够特异性检测相应核酸标志物的试剂盒。
具体地，一种检测试剂盒用于口腔鳞状细胞癌的核酸标志物Hsa-miRNA31-5p(miRNA-31)的检测，其碱基序列如SEQ NO.3所示。所述发夹DNA分子的碱基序列如SEQ NO.1所示，所述引物的碱基序列如SEQ NO.2所示，所述crRNA的碱基序列如SEQ NO.4所示。
标记有亚甲蓝的DNA报告探针通过MCH连接到金电极表面。所使用的电极可以为柱状电极，也可使用丝网印刷电极以进一步提高检测灵敏性。
检测miRNA-31的试剂盒中各成分分为两个试剂包：试剂A，包含了链霉亲和素化的铁纳米磁珠、与发夹DNA分子特异识别的引物(IS-Primer)、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、缓冲液；试剂B，包含了crRNA、Cas12a蛋白、缓冲液。测试的流程为：首先，取得待测唾液样本，取1ul至试剂A，37℃孵育30min；接着，磁分离或者离心分离试剂A中磁珠，至试剂B，室温孵育10分钟；吸取试剂B中溶液10-20ul滴加到电极上，电极连接到电化学检测设备，使电极反应液上温度保持在37℃，30分钟后读取信号。
本发明设计了一种DNA步行和滚动纳米机器人，分别由DNA聚合酶和CRISPR/Cas12a系统驱动，首先在核酸标志物存在的情况下会在发夹DNA分子修饰的纳米粒子上发生行走过程，产生大量dsDNA链，然后再激活下游的CRISPR/Cas12a的顺式切割和侧链反式切割并发生滚动，在反式切割效应下，纳米粒子-dsDNA-CRISPR/Cas12a复合物能在预先孵育好非特异性的发夹DNA报告探针的电极上依次滚动并剪切报告探针，释放出电化学分子，从而使电极产生信号变化。
与现有技术相比，本发明的有益效果：通过先后的ISAR反应和CRISPR/Cas12a切割DNA信号探针，实现靶标信号放大和向电化学信号的转化，从而实现定性和定量检测；本检测方法特异性强；检测灵敏度高，检测限宽，电信号与试样浓度线性关系稳定；检测条件温和，不需要专业荧光PCR设备和实验环境，易于操作、成本低廉。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：
S1，提供一种靶向纳米粒子，该靶向纳米粒子由纳米粒子表面连接发夹DNA分子形成，该发夹DNA分子包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，所述核酸标志物具有能够与所述环区结合的单链；
S2，将分散于缓冲液中的靶向纳米粒子、DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，待测样本中的核酸标志物与所述发夹DNA分子结合，在所述靶向纳米粒子表面行走，从而使所述发夹DNA分子以其自身为模板产生dsDNA链，实现信号放大，此时所述靶向纳米粒子转化为双链修饰纳米粒子；
S3，将步骤S2孵育后的液体或所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；
S4，根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在，或与预先根据梯度标准试样建立的标准曲线对比，判断核酸标志物的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述纳米粒子为Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子，所述纳米粒子表面经链霉亲和素修饰；
所述发夹DNA分子连接有生物素，所述发夹DNA分子通过生物素-链霉亲和素相互作用连接到所述纳米粒子上。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，孵育温度为37℃，时间30min。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述电化学传感器包括金电极，所述金电极上预先修饰有DNA报告探针，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成复合物并在金电极表面滚动，同时剪切所述DNA报告探针以释放出电化学分子，从而使金电极信号发生变化；
步骤S3中，将活化孵育后的液体滴加到金电极上。
5.根据权利要求4所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5’端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3’端与所述金电极连接。
6.一种试剂盒，其特征在于包括：链霉亲和素化的纳米粒子；
发夹DNA分子，包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，该发夹DNA分子的3’端脱氧核苷酸连接有生物素，该发夹DNA分子与其互补序列形成的DNA双链具有能够被Cas12a蛋白识别的原间隔基序(PAM序列)；
引物，能够与所述发夹DNA下游特异性识别；
DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、缓冲液；
CRISPR/Cas12a试剂，包括crRNA和Cas12a蛋白，其中crRNA具有与所述发夹DNA分子相对应的核苷酸片段；以及
固定有DNA报告探针的电化学传感器电极。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素化的纳米粒子为表面修饰有链霉亲和素的Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述电化学传感器电极包括金电极，所述金电极上修饰有DNA报告探针，该DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5’端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3’端与所述金电极表面连接。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA报告探针的的碱基序列如SEQNO.10所示。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸标志物为Hsa-miRNA31-5p(miRNA-31)，其碱基序列如SEQ NO.3所示；
所述发夹DNA分子的碱基序列如SEQ NO.1所示，所述引物的碱基序列如SEQ NO.2所示，所述crRNA的碱基序列如SEQ NO.4所示。
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2022
- 2022-12-03 CN CN202211543997.6A patent/CN115948512A/zh not_active Withdrawn
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