CN102037144A - 稳定化的核酸暗猝灭剂-荧光团探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于合成修饰的核酸寡聚体的新类型固体载体，和具有在所述新载体上方便地合成的形式的核酸探针。示例性的固体载体包括至少一种猝灭剂，其通过连接物连接到固体载体上。不同的示例性的实施方案包括使核酸的双链体、三链体或更高阶聚集体(例如，杂交)稳定化的部分，本发明的寡聚体是所述核酸的组分。固体载体的其它组分包括使核酸的聚集体稳定化的部分，例如，嵌入剂、小沟结合部分、用稳定化部分(例如，炔基部分和氟代烷基部分)修饰的碱基、和构象稳定化部分，例如在共同拥有的美国专利申请公开号2007/0059752中所述的那些。

Description

稳定化的核酸暗猝灭剂-荧光团探针
相关申请的交叉参考
这是一件非临时申请，要求2008年4月1日提交的美国临时专利申请号61/041,515的优先权，其公开内容为所有目的通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明概括地涉及用于核酸合成的新颖的材料(例如，固体载体和亚磷酰胺)。示例性的材料包括用稳定化部分官能化的固体载体和亚磷酰胺。多种材料用稳定化部分和猝灭剂官能化。本发明也提供了核酸单体和寡聚体，包括使用这些材料合成的荧光标记的探针。也提供了使用结合核酸靶序列的本发明的寡聚体探针的基于寡聚体的分析和诊断方法。
背景技术
在基因组研究和开发中，以及在临床医学中，荧光寡核苷酸探针是遗传分析的重要工具。一种特别有用的荧光探针类型是自猝灭探针，也称作荧光能量转移探针或FET探针。尽管使用该基序的不同探针的设计可能在细节上存在差异，FET探针含有连接到寡核苷酸上的荧光团和猝灭剂。荧光团和猝灭剂设计成，仅作为与预期靶物杂交的结果而产生信号。尽管FET探针的可用性有限，包含它们的应用的技术正在快速地替代竞争方法。
已经为杂交测定开发出含有荧光团-猝灭剂对的探针，在所述杂交测定中，探针形成发夹结构，即在没有阻止发夹结构形成的互补核酸序列存在下，探针与它自身杂交，形成环，使得猝灭剂分子到达报道分子附近(参见，例如，WO 90/03446；欧洲专利申请号0 601 889 A2)。当存在互补靶序列时，探针与互补靶序列的杂交会破坏发夹结构，并造成探针形成这样的构象，其中猝灭剂分子与报道分子不再近得足以猝灭报道分子。结果，当与靶序列杂交时，探针会提供比它们未杂交时更强的荧光信号。包含发夹结构的探针难以设计，且可能妨碍探针与靶序列的杂交。
还已经开发出测定法，用于鉴别发夹结构的存在，其中使用2个分开的探针，一个含有报道分子，且另一个含有猝灭剂分子(参见，Meringue，等人，Nucleic Acids Research，22：920-928(1994))。在这些测定法中，当与靶序列杂交时，报道分子的荧光信号减弱，这是由于猝灭剂分子到达报道分子附近。
包含报道分子-猝灭剂分子对的探针的一个特别重要的应用是它们在核酸扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)中的应用，用于检测靶核酸序列的存在和扩增靶核酸序列。一般而言，核酸扩增技术已经为基因测定和DNA分析开发出了许多新方案(参见，例如，Arnheim等人Ann.Rev.Biochem.，61：131-156(1992))。具体地，PCR已经成为非常重要的研究工具，其应用于例如，克隆、基因表达的分析、DNA测序、遗传作图和药物发现(参见，Arnheim等人，同上；Gilliland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2725-2729(1990)；Bevan等人，PCR Methods and Applications，1：222-228(1992)；Green等人，PCR Methods and Applications，1：77-90(1991)；Blackwell等人，Science，250：1104-1110(1990))。
常用于检测核酸扩增产物的方法要求扩增的产物与未反应的引物分离。这通常如下实现：通过使用凝胶电泳，其基于大小差别，将扩增产物与引物分离，或通过产物的固定化，使游离的引物被洗掉。但是，已经描述了3种监视扩增过程的方法，且无需事先分离引物。它们都是基于FRET，它们都不能直接检测扩增的产物。相反，所有3种方法检测一些与扩增有关的事件。为此原因，它们伴有高背景的问题，且不是定量的，如下面所讨论的。
一种方法，如Wang等人(美国专利号5,348,853；Wang等人，Anal.Chem.，67：1197-1203(1995))所述，使用能量转移系统，其中能量转移发生在探针上的2个荧光团之间。在该方法中，扩增的分子的检测发生在扩增反应容器中，不需要分离步骤。但是，该方法不检测扩增的产物，而是检测引物从“能量-槽”寡核苷酸的解离。因而，该方法依赖于发射减少的检测；必须使用大部分标记的引物，以便实现反应之前和之后的信号之间的可靠差异。
第二种无需事先分离引物和产物的检测扩增产物的方法是5′-核酸酶PCR测定法(也称作TaqManTM测定法)(Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7276-7280(1991)；Lee等人，Nucleic Acids Res.，21：3761-3766(1993))。该测定法通过扩增反应过程中双标记的荧光探针(″TaqMan″探针)的杂交和切割，检测特定PCR产物的积累。所述荧光探针由用荧光报道分子染料和猝灭剂染料二者标记的寡核苷酸组成。在PCR过程中，在且仅在它与要扩增的区段杂交的情况下，该探针被DNA聚合酶的5′-外切核酸酶活性切割。探针的切割导致报道分子染料的荧光强度的增加。
在TaqMan测定法中，供体和猝灭剂优选地位于探针的3′-和5′-末端上，因为只有当这两个部分彼此不是太接近时，才能满足在荧光团和猝灭剂之间发生5′-3水解的要求(Lyamichev等人，Science，260：778-783(1993)。该要求是该测定法的一个严重缺点，因为能量转移的效率随着报道分子和猝灭剂之间的距离的反转6次方(inverse sixth power)而降低。因而，如果猝灭剂与报道分子不能近得足以实现最有效的猝灭，来自未杂交的探针的背景发射可以是非常高。
再一个依赖于能量转移的应用的检测扩增产物的方法是Tyagi等人(Nature Biotech.，14：303-309(1996))所述的“指示标探针”方法，它也是Lizardi等人的美国专利号5,119,801和5,312,728的主题。该方法采用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5′-或3′-末端)存在供体荧光团，在另一端存在受体部分。在该方法中，受体部分是猝灭剂，吸收来自供体的能量。因而，当指示标是处于开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当指示标是处于发夹(关闭)构象时，供体荧光团的荧光被猝灭。当用于PCR中时，与PCR产物的一条链杂交的分子指示标探针是处于“开放构象”，检测到荧光，而保持未杂交的那些不会发出荧光。结果，荧光的数量随PCR产物数量的增加而增加，因而可以用作PCR进展的度量。
因为该方法是基于探针与引物序列之间的模板区域的杂交，它具有许多与之有关的问题。例如，指示标探针不可能与双链PCR产物的一条链定量杂交，特别是当扩增产物比指示标探针长得多时。
其它限制也已经阻碍FET探针的应用和使用。首先，目前可利用的探针设计具有比希望更高的荧光噪音背景。在有些情况下，这是由于难以纯化探针，所述探针必须严格地清除掉任何假的荧光副产物。结果，在它们是可接受之前，探针必须经历至少2个纯化水平。该劳力因素导致非常高的探针成本，约$300-$600/探针。第二个根本限制是探针自身的固有噪音，它是探针的物理几何学的结果，这对荧光团和猝灭剂相互作用产生限制。
最近，已经证实寡核苷酸会以序列特异性的方式结合双链体DNA，形成三链体。单链核酸(主要是RNA)是寡核苷酸的靶分子，所述寡核苷酸用于通过“反义”机理抑制基因表达(Uhlmann，E.，等人，Chem Reviews(1990)90：543-584；van der Krol，A.R.，等人，Biotechniques(1988)6：958-976)。根据假说，反义寡核苷酸通过与互补RNA序列杂交，对靶基因表达产生影响。在该模型中，杂种RNA-寡核苷酸双链体干扰RNA代谢的一个或多个方面，包括加工、翻译和代谢更新。化学修饰的寡核苷酸已经用于增强它们的核酸酶稳定性。
基于可识别的核单体序列，双链体DNA可以被寡聚体特异性地识别。示例性的识别规则概括在：Maher III，L.J.，等人，Science(1989)245：725-730；Moser，H.E.，等人，Science(1987)238：645-650；Beal，P.A.，等人，Science(1992)251：1360-1363；Cooney，M.，等人，Science(1988)241：456-459；和Hogan，M.E.，等人，EP公开375408。
单链和双链体靶序列的序列特异性的靶向可以用于诊断、分析和治疗。在有些其中要实现这样的结合的情况下，长时间地稳定化得到的双链体或三链体是有利的。
以前引证了三链螺旋(或三链体)复合物作为抑制靶基因表达的工具的应用(国际申请号PCT/US89/05769)。已经证实，三链螺旋结构会干扰靶基因表达(国际申请号PCT/US91/09321；Young，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88：10023-10026)，这证实了该方案的可行性。
欧洲专利申请号92103712.3，Rahim，S.G.，等人(Antiviral Chem.Chemother.(1992)3：293-297)和国际申请号PCT/SE91/00653描述了在5-位置具有不饱和基团的嘧啶核单体。5-丙炔基和5-乙炔基属于所述的衍生物。
已经描述了在尿嘧啶的5-位置具有不饱和烷基的核单体的合成(DeClercq，E.，等人，J.Med.Chem.(1983)26：661-666；Goodchild，J.，等人，J.Med.Chem.(1983)26：1252-1257)。已经描述了含有5-丙炔基修饰的嘧啶的寡聚体(Froehler，B.C.，等人，Tetrahedron Letters(1992)33：5307-5310)。
已经描述了5-丙炔基-2′-脱氧尿苷、5-丁炔基-2′-脱氧尿苷和有关的化合物向5′-三磷酸盐的转化，随后通过大肠杆菌聚合酶将单体掺入寡聚体(Valko，K.，等人，J.Liquid Chromatog.(1989)12：2103-2116；Valko，K.等人，J.Chromatog.(1990)506：35-44)。进行这些研究，作为在尿嘧啶的5-位置具有一系列取代的核苷酸类似物的结构-活性分析。检查了核苷酸类似物作为大肠杆菌聚合酶底物的活性，并与诸如单体的疏水性等特征相关联。没有呈现关于含有类似物的寡聚体的性质的信息。
具有增强的对互补靶核酸序列的亲和力的寡聚体将会具有提高的用于诊断用途、治疗用途和研究剂的性质。此外，本领域需要改良的探针，用于快速地、灵敏地、可靠地和定量地检测核酸(例如，扩增产物)。理想的探针会产生最小的背景信号，且可以容易地和廉价地制备。非常令人惊讶地，本发明提供了这样的探针。本发明的寡聚的FET和FRET探针具有提高的对双链和/或单链靶序列的结合亲和力。
附图说明
图1是显示用稳定化部分官能化的本发明的固体载体的示例性制备的流程图。
图2是显示用官能部分衍生的本发明的固体载体的示例性制备的流程图。
发明内容
本发明提供了一种新的亚磷酰胺和固体载体类型，其用于合成修饰的核酸寡聚体和核酸探针(例如寡聚体，例如寡核苷酸)，它们是使用所述亚磷酰胺或在所述新载体上方便地合成的形式。示例性的固体载体包括至少一种猝灭剂，其通过连接物结合至固体载体。不同的示例性的实施方案提供了固体载体或用部分官能化的亚磷酰胺，所述部分会稳定化本发明寡聚体与靶核酸的双链体、三链体或更高阶聚集体(例如，杂交)。固体载体(和寡聚体)的示例性组分包括使核酸的杂交稳定化的部分，例如，嵌入剂、小沟结合部分、用稳定化部分(例如，炔基部分和氟代烷基部分)修饰的碱基和构象稳定化部分，例如在共同拥有的美国专利申请公开号2007/0059752中所述的那些。在本发明的固体载体上或使用本发明的亚磷酰胺合成的示例性的寡聚体包括猝灭剂和稳定化部分。不同的寡聚体也包括荧光团和任选的一种或多种其它可检测的部分、稳定化部分或猝灭剂部分。
在一个示例性的实施方案中，连接到本发明的固体载体、亚磷酰胺或寡聚体上的猝灭剂是这样的猝灭剂类型的一个成员：其中第一个取代的或未取代的芳基或第一个取代的或未取代的杂芳基部分通过环外重氮键连接至第二个取代的或未取代的芳基或第二个取代的或未取代的杂芳基部分。在一个示例性的实施方案中，所述猝灭剂是基本上无荧光的(“暗猝灭剂”)，且任选地是称作“黑洞猝灭剂”(“BHQ”)的化合物类型的成员，它们公开在共同拥有的美国专利号7,109,301中。用这些猝灭剂官能化的固体载体、亚磷酰胺和寡聚体也可以结合至一个或多个缀合的组分，通常通过连接物共价地缀合至核酸亚磷酰胺、固体载体或寡聚体的碱基或糖上。一个示例性的缀合的组分是小沟结合剂、嵌入剂、碳氟化合物杂交稳定化部分、炔基杂交稳定化部分(统一称作“稳定化部分”)、荧光团和荧光能量的猝灭剂。
在示例性的实施方案中，本发明提供了适合用于合成寡聚核酸探针的固体载体和亚磷酰胺，所述寡聚核酸探针包含稳定化部分、猝灭剂和/或荧光团。也提供了在这样的固体载体上或使用这样的亚磷酰胺方便地生产的形式的探针。本发明的示例性的寡聚核酸探针的特征在于猝灭剂和荧光团之间的相互作用，所述猝灭剂和荧光团各自缀合到寡聚体上，以便在不存在它与靶物的相互作用(例如，与核酸杂交，所述核酸与靶序列至少部分地互补)的情况下，使探针的荧光最小化。
在许多双标记的核酸探针中，通过使用形成二级结构(例如，发夹、环，等)的核酸探针序列，实现荧光团和猝灭剂之间的相互作用。探针采用二级结构的要求，使得探针的设计非常复杂化，且极大限制了可以用作探针组分的核酸序列。相反，本发明的示例性的寡聚核酸探针促进了猝灭剂和荧光团之间的相互作用，不需要伴随地形成核酸二级结构，从而允许更加多样化的核酸序列用作荧光探针的组分。在不同的实施方案中，这些探针包括一种或多种如本文定义的暗猝灭剂(例如，黑洞猝灭剂)。
此外，通过改变在本发明中使用的猝灭剂的缀合的重氮基-(杂)芳基系统的成员的数目和身份，可以使猝灭剂的光谱性质(例如，吸光度)“调成”与一种或多种荧光团的光谱特征(例如，发射)匹配。该特征会提供本发明的寡聚探针，其可选择地具有广范围的最大吸光度。因此，本发明的寡聚探针非常适用于多路用途。此外，本发明提供了可用于多路用途的固体载体和探针，其中使用一种或多种不同的荧光团与一种或多种猝灭剂的组合，从而扩展了可以掺入寡聚探针中的供体-受体对的选择。因此，在不同的实施方案中，本发明提供了至少2种、至少3种、或至少4种寡聚探针，它们各自用猝灭剂官能化，所述猝灭剂具有可与其它探针中的猝灭剂的相同性质区分开的光谱性质(例如，发射波长)。
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了具有根据式I的结构的化合物：
Figure BPA00001258097200081
其中Xa是选自下述的稳定化部分：氟代烷基，取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。在不同的实施方案中，Xa是小沟结合剂或嵌入剂。
符号L1、L2、L3和L4代表连接物。所述连接物独立地选自单个共价键，取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基部分。Ya是选自CRa和N的成员，其中Ra是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。Ra任选地是与官能组分的连接物。
符号Za代表固体载体、ORb或NRbRb′，其中Rb和Rb′是独立地选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。符号Rc代表选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基，取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基和共价结合核酸的含有磷的连接物。在一个示例性的实施方案中，Rc是核酸保护基，例如，二甲氧基三苯甲基(“DMT”)。在另一个实施方案中，Rc是与另一个核酸部分的磷酸二酯键，所述核酸部分任选地用一种或多种官能组分衍生化。
本发明的化合物包括荧光能量的猝灭剂。猝灭剂由符号Q表示，且在示例性的实施方案中，包括一个或多个下述结构特征：
(a)至少3个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基，其中第一个残基通过第一个环外重氮键共价连接至第二个残基。第一个或第二个残基通过第二个重氮键共价连接至第三个残基；和
(b)至少2个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基。第一个残基通过环外重氮键共价连接至第二个残基，且至少一个残基是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基。
猝灭剂通过连接物连接至本发明的化合物的剩余部分。通过前体猝灭剂上的反应官能团和连接物上的反应官能团的反应，猝灭剂和连接物偶联。两种反应官能团具有互补反应性，且在反应后形成如本文定义的连接片段。
从下面的详细描述会明白本发明的其它目的、优点和方面。
具体实施方式
缩写
本文使用的“BHQ”泛指包含一个或多个重氮键的暗猝灭剂，具体地指“黑洞猝灭剂”。用于本发明中的示例性的BHQ描述在美国专利号中。本文使用的“FET”是指“荧光能量转移”。本文使用的“FRET”是指“荧光共振能转移”。这些术语在本文中用于指放射性的和非放射性的能量转移过程。例如，这些术语包括其中发射光子的过程，和包含远程电子转移的过程。在本说明书中，这两种现象都包含在一般性术语“供体-受体能量转移”下。“SNP”是指“单核苷酸多态现象”。
定义
下面的定义广泛地适用于下文所述的本发明的每个实施方案。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。一般而言，本文使用的命名法和下面所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室操作，是本领域熟知的和常用的那些。使用标准的技术进行核酸和肽合成。通常根据本领域的常规方法和不同的一般性参考文献进行分子生物技术和操作(通常参见，Sambrook等人MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，它通过引用并入本文)。本文使用的命名法和分析化学和有机合成中的实验室操作是本领域熟知的和常用的那些。使用标准的技术或其改进进行化学合成和化学分析。
除非另外说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的部分，都是指直链或支链或环状的烃基或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的，且可以包含单-、二-、三-和四-价基团，所述基团具有指定的碳原子数(即，C1-C10指1-10个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，及其同类物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、及其高级同类物和异构体。除非另外说明，术语“烷基”还任选地包括在下文中更详细定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基称为“同型烷基”。本文使用的术语“烷基”是指烷基、烯基和炔基部分，它们每个可以是单-、二-或多价基团，只要适当地满足化合价要求。烷基任选地被取代，例如，被一个或多个在本文中称作“烷基取代基”的基团取代。
术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的部分，是指衍生自烷基部分的二价基团，例如，但不限于，-CH2CH2CH2CH2-，且进一步包括下文称为“杂亚烷基”的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)具有1-24个碳原子，在本发明中优选具有10个或更少碳原子的那些基团。对于亚烷基和杂亚烷基连接物基团，任选地，连接物基团的朝向不是由连接物基团的通式的书写方向来指示。例如，式C(O)2R′-代表-C(O)2R′-和任选地-R′C(O)2-。“低级烷基”或“低级亚烷基”是更短的链烷基或亚烷基，通常具有8、7、6、5或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以常规意义使用，是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的那些烷基。
除非另外说明，术语“杂烷基”本身或与另一术语组合，是指稳定的直链或支链或环状烷基，其由所述数目的碳原子和至少一个选自B、O、N、Si和S的杂原子组成，其中所述杂原子可以任选地被氧化，且氮原子可以任选地被季胺化。杂原子可以置于杂烷基的任意内部位置，或在链的末端，例如，供烷基结合分子的其它部分的位置。“杂烷基”的实例包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3，和CH＝CH-N(CH3)-CH3。2个或多个杂原子可以是相连的，例如，-CH2-NH-OCH3和CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，是指取代的或未取代的二价杂烷基，例如，但不限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据任一个或两个链末端(例如，亚烷基氧、亚烷基二氧、亚烷基氨基、亚烷基二氨基，等)。
除非另外说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合，分别代表“烷基”和“杂烷基”的环状形式。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据供杂环结合分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于，环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、等。杂环烷基的实例包括但不限于，1(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1哌嗪基、2-哌嗪基、等。
除非另外说明，术语“卤代”或“卤素”本身或作为其它取代基的一部分，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，“卤代烷基”等术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基，等。
除非另外说明，术语“芳基”是指多不饱和的芳族取代基，其可以是单环，或稠合在一起或共价连接的多环(优选1-3个环，其中的一个或多个任选地是环烷基或杂环烷基)。术语“杂芳基”指含有1-4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中所述氮和硫原子任选地被氧化，且所述氮原子任选地被季胺化。杂芳基可通过杂原子连接分子的其它部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-二苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹噁啉基、5-喹噁啉基、3-喹啉基、和6-喹啉基。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自下述的“芳基取代基”。
为了简便，当与其它术语(例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)联用时，术语“芳基”任选地包括如上定义的同型芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烷基”任选地包括其中芳基与烷基连接的那些基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶甲基等)，包括其中碳原子(例如，亚甲基)被例如氧原子替换的那些烷基(例如，苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
烷基和杂烷基的取代基(包括常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)统称为“烷基取代基”，它们可以是众多选自、但不限于下述的基团中的一个或多个：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R”、-SR′、-卤素、-SiR′R”R”′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R”、-OC(O)NR′R”、-NR”C(O)R′、-NR′-C(O)NR”R”′、-NR”C(O)2R′、-NR-C(NR′R”R′”)＝NR””、-NR-C(NR′R”)＝NR′”、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R”、-NRSO2R′、-CN和NO2，其数量是从0至(2m′+1)，其中m′是这样的基团中的碳原子总数。R′、R”、R”′和R””每个优选地独立地指氢、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基，例如，被1-3个卤素取代的芳基、取代的或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳烷基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如，独立地选择每个R基团，如同当存在超过一个这样的基团时选择各个R′、R”、R′”和R””基团一样。当R′和R”结合同一个氮原子时，它们可以与氮原子结合，形成5-、6-或7-元环。例如，-NR′R”意在包括但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上面取代基的讨论中，本领域技术人员将理解，术语“烷基”包括含有与氢以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如，-CF3和CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。示例性的烷基取代基包括在本文中称作“反应官能团”和“连接片段”的那些基团。在不同的实施方案中，烷基取代基是含有磷的部分，例如，磷酸二酯或磷酸二酯修饰，例如本文所述的那些。
类似于关于烷基所述的取代基，芳基和杂芳基的取代基统称为“芳基取代基”。示例性的取代基选自烷基取代基列表和其它，例如：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R”、-SR′、-SiR′R”R”′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R”、-OC(O)NR′R”、-NR”C(O)R′、-NR′-C(O)NR”R”′、-NR”C(O)2R′、-NR-C(NR′R”R′”)＝NR””、-NR-C(NR′R”)＝NR′”、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R”、-NRSO2R′、-CN和NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基，和氟代(C1-C4)烷基，其数量是从0至芳族环系统上的开放价的总数；且其中R′、R”、R”′和R””优选地独立地选自：氢、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如，独立地选择每个R基团，如同当存在超过一个这样的基团时选择各个R′、R”、R′”和R””基团一样。
芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可以任选地被式T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基替换，其中T和U独立地是NR-、-O-、-CRR′-或单键，且q是0-3的整数。或者，芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替换，其中A和B独立地是CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键，且r是1-4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地被双键替换。或者，芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR′)s-X-(CR”R′”)d-的取代基替换，其中s和d独立地是0-3的整数，且X是O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或S(O)2NR′-。取代基R、R′、R”和R′”优选地独立地选自：氢或取代的或未取代的(C1-C16)烷基。示例性的芳基取代基包括在本文中称作“反应官能团”和“连接片段”的那些基团。
本文使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
符号″R″是代表取代基的一般缩写，所述取代基选自：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基，和取代的或未取代的杂环基。R也可以是指烷基取代基和芳基取代基。
术语“盐”包括，根据本文所述化合物上的特定取代基，用相对无毒的酸或碱制备的化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可通过使这些化合物的中性形式与足量所需的碱(纯的或溶于合适的惰性溶剂中)接触而获得碱加成盐。碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，可通过使这些化合物的中性形式与足量所需的酸(纯的或溶于合适的惰性溶剂中)接触而获得酸加成盐。酸加成盐的实例包括衍生自下述无机酸的盐：如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自下述相对无毒的有机酸的盐：如乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸、苯二酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，例如精氨酸盐等，以及诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等有机酸的盐(参见，例如，Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science，66：1-19(1977))。本发明的某些特定化合物含有碱性和酸性两种官能团，使该化合物可转化成碱或酸加成盐。也包括盐的水合物。
本文使用的“核酸”是指核苷、核苷酸和寡核苷酸，例如，DNA、RNA、无论是单链的、双链的，还是更高聚集体的杂交基序，和它们的任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供化学基团的那些，所述化学基团将其它电荷、极化性、氢键合、静电相互作用和流动性(fluxionality)掺入核酸配体基质或核酸配体整体。这样的修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在环外胺处的修饰、4-硫脲苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基化(例如，5′和/或3′)、罕见的碱基配对组合例如异碱基，异胞苷和异胍等。核酸也可以包括非天然碱基。“核单体”是指单个核酸单元，其可以是核苷、核苷酸或其修饰。
本文使用的“碱基”包括，不仅含有已知的嘌呤和嘧啶杂环和本发明的嘧啶、而且含有杂环类似物和其互变异构体的那些部分。嘌呤包括腺嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤，示例性的嘌呤类似物包括8-氧-N6-甲基腺嘌呤和7-脱氮黄嘌呤。嘧啶包括尿嘧啶和胞嘧啶和它们的类似物，例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和4，4-桥亚乙基胞嘧啶。该术语也包括非天然碱基。代表性的非天然碱基包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基-2-硫脲苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧醋酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧醋酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、硝基吲哚，和2，6-二氨基嘌呤。
在不同的实施方案中，本发明的化合物包括在5-位衍生的嘧啶。衍生物是1-烯基-、1-炔基-、杂芳族-和1-炔基-杂芳族修饰。″1-烯基″是指烯族不饱和的(含有双键的)非环状基团。″1-炔基″是指炔族不饱和的(含有三键的)非环状基团。
本文使用的″核苷″是指核酸的子集，其中碱基共价结合糖或糖类似物，且其任选地包含亚磷酸盐、亚磷酰胺或膦。术语核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷或是碱基的N-糖苷或C-糖苷的任意其它核苷。糖碳的立体化学可以不同于D-核糖的立体化学。核苷也包括这样的物质，其含有糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被替换为卤素、杂原子、脂族基团，或被官能化成醚、胺、硫醇等。戊糖部分可以被替换为己糖或替代结构。例如环戊烷环、6-元吗啉代环等。本文定义的核苷也包括与氨基酸和/或具有游离羧基和/或游离氨基和/或它们的被保护形式的氨基酸类似物连接的碱基。核苷也任选地包括一种或多种碱基修饰，例如，用氟碳基、烯基或炔基部分修饰。包含磷酸二酯或磷酸二酯修饰的核苷在本文中称作核苷酸。
本文使用的“糖修饰”是指除2′-脱氧核糖以外的任意戊糖或己糖部分。修饰的糖包括，例如，D-核糖、2′-O-烷基、2′-氨基、2′-卤代官能化的戊糖、己糖等。示例性的糖修饰包括这样的糖，其中一个或多个羟基被替换为卤素、杂原子、烷基部分，或被官能化成醚、酯等。戊糖部分可以被替换为己糖或替代结构，例如环戊烷环、6-元吗啉代环等。本文定义的核苷也意在包括与氨基酸和/或具有游离羧基和/或游离氨基和/或它们的被保护形式的氨基酸类似物连接的碱基。也包括其立体化学不同于D-核糖的立体化学的糖。
“磷酸二酯基团修饰”是指天然磷酸二酯基团的任意类似物，其共价偶联邻近的核单体。替代连接包括磷酸二酯类似物，例如硫代磷酸酯和甲基膦酸酯，和含非磷的连接，例如缩醛和酰胺。
核酸修饰也包括3′和5′修饰，例如用猝灭剂(例如，BHQ)、荧光团、嵌入剂、小沟结合剂、碳氟化合物、构象辅助的稳定化部分或其它部分加帽。在不同的实施方案中，加帽基团通过连接物基团共价结合寡聚体。
寡聚体在本文中定义为，通过磷酸二酯或修饰的磷酸二酯部分彼此共价偶联的2个或多个核单体。因而，寡聚体可以具有少至2个核单体(二聚体)，且基本上不具有核单体的上限。寡聚体可以是结合活性的，且因而可以与同源的单链或双链(或更高阶聚集体)核酸序列进行碱基配对。寡聚体也可以用作本文所述的更长的寡聚体的合成子。寡聚体也可以含有无碱基位点和假核苷。在不同的实施方案中，本发明的寡聚体被官能化。下面讨论了官能化寡聚体的部分。在所述的某些实施方案中，术语“寡聚体”互换地用于指寡聚体的核酸序列、提供探针的修饰的核酸序列或提供本发明的固体载体的修饰的核酸序列。
“肽”是指这样的寡聚体，其中单体是氨基酸，且通过酰胺键连接到一起，或者是指多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-旋光异构体或D-旋光异构体。另外，也包括非天然氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。常遇到的非基因编码的氨基酸也可以用于本发明中。在本发明中使用的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。L-异构体通常是优选的。另外，其它模拟肽也可以用于本发明中。关于一般综述，参见，Spatola，A.F.，CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，编，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。
″固体载体″是固体材料，其具有用于结合分子、化合物、细胞或其它实体的表面，或这样的物质结合所述的表面。固体载体的表面可以是平的或另外设计。固体载体可以是多孔的或无孔的。固体载体可以是包含表面的芯片或阵列，且其可以包含玻璃、硅、尼龙、聚合物、塑料、陶瓷或金属。固体载体也可以是膜，例如尼龙、硝酸纤维素或高分子膜，或平板或盘子，且可以由玻璃、陶瓷、金属或塑料制成，例如，由例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或异质同晶聚合物制成的96-孔板。固体载体也可以是任意形状的珠子或颗粒，且优选地是球形或接近球形，优选地珠子或颗粒具有1毫米或更小的直径或最大宽度，更优选0.1-100微米。这样的颗粒或珠子可以由任意合适的材料制成，例如，玻璃或陶瓷，和/或一种或多种聚合物，例如，尼龙、聚四氟乙烯、TEFLON、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素、纤维素衍生物、或葡聚糖，且/或可以包含金属，尤其是顺磁金属，例如铁。
用于固相合成的载体是本领域已知的，包括但不限于，高交联剂聚苯乙烯(McCollum，等人，Tetrahedron Lett.32：4069-4072(1991)，聚苯乙烯/PEG共聚物(Gao，等人，Tetrahedron Lett.32：5477-5480(1991)，硅胶(Chow，等人，Nucl.Acids Res.9：2807-2817(1981))，聚酰胺结合的硅胶(Gait，等人，Nucl.Acids Res.10：6243-6254(1982))，纤维素(Crea，等人，Nucl.Acids Res.8：2331-2348(1980))，(和可控孔度玻璃(CPG)(Koster，等人，Tetrahedron Lett.24：747-750(1983))。一种示例性的固体载体是CPG珠子。可以以多种方式衍生化CPG珠子，以用于结合核单体或寡聚体。例如，可以用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理CPG珠子，以添加氨基丙基连接物手柄，用于结合寡核苷酸类似物单体或二聚体(Koster，等人，Tetrahedron Lett.24：747-750(1983))，或优选地长链烷基胺基团，最优选地包括末端核苷，可以结合到CPG上(Adams，等人，J.Am.Chem.Soc.105：661-663(1983))。用于寡核苷酸合成或肽合成的载体，例如dT-LCAA-CPG(Applied Biosystems)，可商业上获得。
″嵌入剂″是指平面的芳族或杂芳族部分，其能部分地插入和堆叠在邻近的核碱基之间。这些部分可以是小分子或更大的实体的一部分，例如蛋白。嵌入剂的非限制性实例包括吖啶、蒽、蒽环类抗生素、anthracyclinone、亚甲蓝、吲哚、蒽醌、喹啉、异喹啉、二氢醌、四环素、补骨脂素、香豆素、胡米胺卤化物、胡米胺同型二聚体、同型二聚的噁唑黄(YOYO)、噻唑橙(TOTO)、蒽环类抗生素、1，10-菲咯啉-铜、卡奇霉素、卟啉、偏端霉素、纺缍菌素，和联吡啶氯化物。
“小沟结合剂”是指通常具有约150至约2000道尔顿的分子量的部分。所述部分以非嵌入方式结合进双链(或更高阶聚集体)DNA、RNA或其杂合体的小沟，优选地具有大于约103M-1的结合常数。小沟结合化合物具有差别很大的化学结构，但是，示例性的小沟结合剂具有新月形三维结构。实例包括某些天然存在的化合物例如纺锤菌素、偏端霉素和lexitropsin、光神霉素、色霉素A3、橄榄霉素、氨茴霉素、矛霉素，以及其它有关的抗生素和合成的衍生物。某些二季铵杂环化合物、二芳基脒例如喷他脒、二苯乙烯脒和重氮氨苯眯乙酰甘氨酸盐(berenil)、CC-1065和有关的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst 33258、4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以及许多由天然存在的或合成的氨基酸组成的寡肽，是小沟结合剂化合物。示例性的小沟结合剂描述在美国专利号6,084,102。通过非常确定的分光光度计测量方法，例如紫外线(u.v.)和核磁共振(nmr)波谱法，以及通过凝胶电泳，可以检测该结合类型。小沟结合剂分子结合后的紫外光谱转移，和利用“核欧沃豪斯效应”(NOSEY)的nmr波谱法，是特别众所周知的，且是对于该目的有用的技术。凝胶电泳会检测小沟结合剂与双链DNA或其片段的结合，因为在这样的结合后，双链DNA的迁移率发生变化。
小沟结合剂通常通过连接物结合寡聚体或固体载体，所述连接物具有约20个、约15个原子、约10个或约5个原子的链。
基于嵌入剂是平的芳族(优选多环)分子，而小沟结合剂是″新月形″或类似的几何形状，可以将嵌入部分或试剂容易地与小沟结合剂区分开。通过利用核欧沃豪斯效应的nmr波谱法，也可以进行实验区分。
本文使用的术语″连接物″或″L″是指单个共价键(“零阶”)或其中掺入1-30个选自C、N、O、S、Si和P的非氢原子的一系列稳定的共价键，其与本发明化合物的组分共价连接到一起，例如，将固体载体连接至本发明的稳定剂、猝灭剂、核单体或寡聚体；或将猝灭剂或稳定化部分连接至在本发明的一个酰胺化物中的碱基。示例性的连接物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个非氢原子。除非另有说明，与连接有关的“连接”、“连接的”、“结合”、“缀合”、“缀合的”和类似术语是指利用连接物的技术和掺入连接物的物质。示例性的连接物包括如本文定义的连接片段。此外，连接物可以用于使寡聚体或初生的寡聚体(在寡聚体合成过程中)连接至本发明的固体载体。因而，本发明也提供了通过连接物与固体载体(例如，本发明的固体载体)共价连接的本发明的寡聚体。本发明的固体载体和寡聚体任选地包括可切割的连接物，其在固体载体和寡聚体的2个组分之间(例如，在寡聚体和固体载体之间，在荧光团和寡聚体之间，在猝灭剂和寡聚体之间，在荧光团和猝灭剂之间等)。在不同的实施方案中，使固体载体连接至寡聚体的连接物是可切割的连接物。
″可切割的连接物″是具有一个或多个可切割的基团的连接物，所述基团通过反应或条件的作用可以断裂。示例性的可切割的连接物位于式I的L2内，用于使本发明的合成的寡聚体与合成它的固体载体方便地分离。术语″可切割的基团″是指这样的部分，其允许通过切割将释放部分与缀合物剩余部分相连的键，释放出本发明的固体载体或寡聚体的组分。在制备和使用本发明的寡聚体和固体载体中都可使用的示例性的切割机理是酶促地或化学地介导的。
除了酶促地可切割的基团以外，在本发明的范围内包括一个或多个通过酶以外的试剂的作用而被切割的部位。示例性的非酶切割剂包括但不限于，酸、碱、光(例如，硝基苄基衍生物、苯酰基、邻-羟基肉冠酸酯、安息香酯)和热。许多可切割的基团是本领域已知的。参见，例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.，265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.，261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，143：1859-1867(1989)。此外，广范围的可切割的、双功能的(同型-和异型-双功能的)间隔臂可商业上得到。
示例性的可切割的基团可被诸如氢氧化钠、氨或其它胺等试剂切割。在不同的实施方案中，可切割的连接物可在室温或在微波条件下容易地切割。在一个实施方案中，可切割的连接物是L2，且通过用胺(例如，氨或基本上无水的胺)在有机溶剂中处理来切割它。
“连接片段”是连接2个或多个组分(例如，官能组分、固体载体或连接物)的部分。该术语是指通过互补反应配偶体的反应形成的共价键，每个所述反应配偶体具有反应性与它的配偶体的反应性互补的反应官能团。独立地选择本发明的固体载体和寡聚体中的连接片段。示例性的连接片段包括但不限于，S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oYx-PEG，其中，Yx是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH，或O，o是1-50的整数。在每个这样的示例性的连接片段中，NH可以是NRt，其中Rt是取代的或未取代的烷基或取代的或未取代的杂烷基。连接片段也可以是磷酸二酯或磷酸二酯修饰。在不同的实施方案中，连接片段是在连接物和荧光团之间，在连接物和猝灭剂之间，在连接物和稳定化部分之间，或在连接物和固体载体之间。在本发明的固体载体和寡聚体的一个示例性的实施方案中，每个连接片段是不同的连接片段。
本文使用的术语″荧光团″是指，固有地发荧光的、或在结合生物化合物或金属离子或被酶代谢后表现出荧光变化(即，产生荧光的)的部分。可以取代荧光团，以改变荧光团的溶解度、光谱性质或物理性质。许多荧光团是本领域技术人员已知的，包括但不限于，香豆素类、吖啶类、呋喃类、丹酰类、酞菁类、芘类、萘类、苯并呋喃类、喹啉类、喹唑酮类、吲哚类、苯并吡咯类、borapolyazaindacenes、噁嗪类和呫吨类，后者包括荧光素类、若丹明类、rosamines和rhodols。用于本发明的这些和其它荧光团描述在：Haugland，MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS。其它有用的荧光团描述在共同拥有的美国专利申请公开号2005/0214833和2005/0170363和下文中。
本文使用的″猝灭剂″是指本发明的任意荧光修饰部分，其可以至少部分地减弱荧光团发出的光。该减弱在本文中称作″猝灭″。因此，在不同的实施方案中，在有猝灭基团存在下荧光团的激发会产生强度比预期更弱的发射信号，或甚至完全消失。猝灭典型地通过激发的荧光团和猝灭基团之间的能量转移而发生。
荧光团或猝灭剂可以包括，与在没有这样的取代基的情况下与“母本”化合物相比增强希望的性质的取代基，所述希望的性质例如，在水中的溶解度、细胞渗透性和光谱吸收和发射。这样，用于本发明中的荧光团或猝灭剂包括，与在没有提高取代基的情况下与同一母本化合物相比增强希望的性质的取代基。
“官能组分”是本发明化合物中的部分的总称，其具有选自猝灭剂、荧光团和稳定化部分的结构(包括，但不限于，嵌入剂，小沟结合部分，被稳定化部分(例如，炔基部分和氟代烷基部分)修饰的碱基，和构象稳定化部分，例如在共同拥有的美国专利申请公开号2007/0059752中所述的那些)。
词语″多核苷酸的扩增″包括但不限于，诸如聚合酶链式反应(PCR)、连接扩增(或连接酶链式反应，LCR)和基于Q-β复制酶的应用的扩增方法等方法。这些方法在本领域众所周知且广泛实践。参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202和Innis等人，1990(对于PCR)；和Wu等人，1989a(对于LCR)。用于进行PCR的试剂和硬件可商业上得到。用于从特定基因区域扩增序列的引物优选地与在目标区域中或在它的侧翼区中的序列互补，且特异性地杂交。可以对扩增产生的核酸序列直接测序。或者，可以在序列分析之前，克隆扩增的序列。Scharf(1986)已经描述了关于对酶促扩增的基因组区段进行直接克隆和序列分析的方法。本发明提供了用于扩增过程的寡聚引物。此外，提供了用于合成这样的引物的固体载体。除了引物以外，本发明提供了探针和使用这种探针检测、表征和/或定量扩增产物的方法，也提供了用于合成这些寡聚探针的固体载体。
术语″碱基堆积扰动″是指造成碱基堆积的扰动的任意事件，例如，碱基对错配、蛋白与它的识别位点的结合、或形成寡核苷酸加成物的任意其它实体。本发明的各种探针能检测、表征和/或定量这样的碱基堆积扰动。此外，本发明提供了用于合成能检测、表征和/或定量这样的碱基堆积扰动的探针的固体载体。
术语″杂交″是指彼此结合的2条核酸链，它们可以是或不是完全碱基配对的；一般而言，该术语是指包含本发明的寡聚体的结合，无论是结合在固体载体上，还是在溶液中。
术语″变性″是指这样的过程，它使核酸双链体(或更高的聚集体)的链不再通过氢键合而碱基配对，且分成单链分子。变性的方法是本领域技术人员熟知的，包括热变性和碱变性。该术语通常是指本发明的探针与它的靶核酸的解离。
术语″错配″是指，杂交的核酸双链体(或更高的聚集体)内的核酸碱基不是100％互补。错配包括位于核酸的互补链上的2个碱基的任意不正确的碱基间配对，其不是Watson-Crick碱基对，例如A:T或G:C。总同源性的缺乏可能是由于缺失、插入、反转、置换或移码突变。在不同的实施方案中，本发明的寡聚体包括相当于它的靶核酸的错配，优选地允许检测和/或表征和/或定量它的靶物中的对应错配。在某些实施方案中，错配是单个核苷酸错配。
本文使用的术语″多态现象″是指基因中的序列变化，且″突变″是指与表型有关的或被认为与表型有关的基因中的序列变化。术语″基因″是指编码功能产物蛋白控制区的基因组的区段。根据本发明用于受试者标识的多态标志物可以位于基因组的编码区或非编码区，且本发明的各种探针设计成与包含这些标志物的核酸区域杂交。本文使用的术语″受试者″是指提供实验样品的受试者，从所述实验样品得到用于基因测定的靶核酸。本发明的寡聚体可以用于检测和/或表征和/或定量多态现象和突变。此外，本发明的固体载体可以用于合成寡聚体，所述寡聚体用于检测和/或表征和/或定量多态现象和突变。
本文使用的术语“探针”是指使用本发明的固体载体或酰胺化物制备的核酸寡聚体。在不同的实施方案中，探针在与结合配偶体相互作用后产生可检测的响应。探针包括至少一个可检测的部分，或一对部分，该对部分在探针状态发生一些变化(响应于探针与结合配偶体的相互作用)后形成可检测的能量转移对。本发明提供了探针和用于合成探针的酰胺化物和固体载体。本发明的示例性的探针用于检测多态现象。在不同的实施方案中，多态现象是单个核酸多态现象(SNP)。
本文使用的术语″可检测的响应″是指，通过观察或通过仪器可直接或间接检测的信号的变化或发生，和实验样品中探针的目标结合配偶体的存在，或优选地，其量级随探针的目标结合配偶体的存在而变化。典型地，可检测的响应是来自荧光团的光学响应，其导致波长分布模式或吸光度或荧光强度的变化，或光散射、荧光量子产率、荧光寿命、荧光极化的变化，激发或发射波长的迁移，或上述参数的组合。特定光谱性质的可检测的变化通常是增加或降低。但是，导致荧光强度的增加和/或荧光发射或激发波长的迁移的光谱变化也是有用的。离子结合上的荧光变化通常是由于指示剂的构象或电子变化(这可能发生在荧光团的激发态或基态)，由于在离子结合部位的电子密度的变化，由于结合的靶金属离子对荧光的猝灭，或由于这些或其它效应的任意组合。或者，可检测的响应是信号的发生，其中荧光团固有地发荧光，且在结合金属离子或生物化合物后不产生信号的变化。本发明提供了提供可检测的响应的探针和用于合成这样的探针的固体载体。
简介
本发明提供了亚磷酰胺、固体载体和在这些固体载体上容易地制备的形式的寡聚体。在它们的与靶核酸序列杂交形成双链体或三链体的能力方面，稳定化示例性的寡聚体。本发明的各种寡聚体适用于通过CT或GT三链螺旋结合基序结合DNA双链体靶序列。
在不同的实施方案中，与不具有修饰的寡脱氧核苷酸相比，本发明的寡聚体可抗核酸酶降解。本发明的核酸酶抗性的寡聚体有利地用于存在核酸酶的条件下。对于某些用途，例如通过反义机制调节基因表达，本发明的寡聚体的核酸酶稳定性是寡聚体的一个重要的功能方面。
本发明的另一个方面包括，检测特定单链DNA或RNA或特定目标双链体在生物(或其它)样品中存在与否或其量的方法，其中使用本发明的寡聚体检测选定的核酸序列。这样的序列可以与肿瘤生长、病毒或疾病状况的存在相关联。
与不具有本发明寡聚体的稳定化部分组分的未修饰的寡聚体相比，本发明的示例性的寡聚体具有增强的结合互补单链和双链核酸序列的性质。在不同的实施方案中，在7.0和更高的生理pH水平，可以形成三链螺旋结构。在示例性的实施方案中，也提供了改良的双链体形成。
本发明提供了寡聚体，其在示例性的实施方案中，可用于：(1)在体外调节细胞中的基因表达，包括在组织培养物中生长的细胞(例如，治疗病症，例如，癌症、感染，等)，和(2)检测和/或定量靶核酸序列。
本发明也涉及试剂和试剂盒，其包含本发明的亚磷酰胺、固体载体和/或寡聚体。
实施方案
在一个示例性的实施方案中，本发明提供了具有根据式I的结构的化合物：
Figure BPA00001258097200251
其中Xa是选自下述的稳定化部分：氟代烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。在不同的实施方案中，Xa是小沟结合剂或嵌入剂。
符号L1、L2、L3和L4代表连接物。连接物独立地选自单个共价键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基部分。Ya是选自CRa和N的成员，其中Ra是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。Ra任选地是与官能组分的连接物。
符号Za代表固体载体、ORb或NRbRb′，其中Rb和Rb′是独立地选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。符号Rc代表选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基和共价结合核酸的含有磷的连接物。在一个示例性的实施方案中，Rc是核酸保护基，例如，二甲氧基三苯甲基(“DMT”)。在另一个实施方案中，Rc是与另一个核酸部分的磷酸二酯键，所述核酸部分任选地用一种或多种官能组分衍生化。
本发明的化合物包括荧光能量的猝灭剂。猝灭剂由符号Q表示，且在示例性的实施方案中，包括一个或多个下述结构特征：
(a)至少3个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基，其中第一个残基通过第一个环外重氮键共价连接至第二个残基。第一个或第二个残基通过第二个重氮键共价连接至第三个残基；和
(b)至少2个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基。第一个残基通过环外重氮键共价连接至第二个残基，且至少一个残基是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基。
猝灭剂通过连接物连接至本发明的化合物的剩余部分。通过前体猝灭剂上的反应官能团和连接物上的反应官能团的反应偶联猝灭剂和连接物。两种反应官能团具有互补反应性，且在反应后，形成如本文定义的连接片段。
式I中的示例性的连接物包括：
对于L1，
Figure BPA00001258097200261
例如
Figure BPA00001258097200262
其中z是1-20的整数，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。
对于L2，
Figure BPA00001258097200271
例如
Figure BPA00001258097200272
其中y、w和u是独立地选择的1-20的整数，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。
对于L3，
Figure BPA00001258097200273
例如
其中v、t和s是独立地选择的1-20的整数，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。符号Xb代表选自O和S的成员。Xc是选自OR8、SR8和NR8R8a的成员，其中R8和R8a是独立地选自下述的成员：H和取代的或未取代的烷基，或所述化合物是盐，且OR8和SR8选自O-M+和S-M+。M+是能与带负电荷的离子形成盐的任意阳离子，包括金属离子或铵离子。R9是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基和任选地通过含有磷的连接物连接的核酸。
对于L1-Ya-L3，
例如
Figure BPA00001258097200276
其中指标和可变基团是如上所述。
对于L1-Ya-L2，
Figure BPA00001258097200281
例如
其中指标和可变基团是如上所述。
对于L1-Ya-L3，
例如
Figure BPA00001258097200284
其中指标和可变基团是如上所述。
在示例性的实施方案中，本发明提供了具有根据式VII的结构的化合物：
Figure BPA00001258097200285
其中指标和可变基团是如上所述。
在选择的实施方案中，本发明包括具有根据式VIII的结构的化合物：
Figure BPA00001258097200286
其中Q1是猝灭剂的片段。该片段包含选自下述的成员：
(a)2个选自下述的部分：取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基，所述2个部分通过环外重氮键连接；和
(b)选自下述的部分：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基。
每个R12是独立地选自本文定义的芳基取代基的成员；且整数p是0，1，2，3，或4。其它指标和基团是如上所述。
关于用于本发明的化合物中的连接物，提供了一个示例性的实施方案，其中Za是固体载体，且L2-Za包含根据式IX的结构：
Figure BPA00001258097200291
其中指标是如上所述；且SS是固体载体。
在本发明的某些实施方案中，在固体载体或亚磷酰胺上，或在固体载体上合成的寡聚体上，包含稳定化部分。根据任意上述实施方案的本发明的一种示例性的化合物是这样的化合物，其中Xa选自嵌入剂和小沟结合剂。
在不同的实施方案中，本发明的固体载体或亚磷酰胺或寡聚体包括具有选自下式的碱基：
Figure BPA00001258097200292
其中R10是选自下述的成员：炔基和氟代烷基部分。
″炔基″是指炔族不饱和无环基团，例如乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、1-戊炔基、1，3-戊二炔基、苯基乙炔基、苯基乙炔基、吡啶-乙炔基、嘧啶-乙炔基、三嗪-乙炔基、噻吩-乙炔基、噻唑-乙炔基和咪唑-乙炔基。示例性的取代的基团包括取代的或未取代的C1-C10炔基，例如，被下述取代基取代的C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10炔基：2-、3-和4-吡啶(例如，2-、3-和4-嘧啶-乙炔基)、三嗪(例如，三嗪-乙炔基)、2-、4-和5-嘧啶基、2-、4-和5-噻唑基、1、甲基-2-咪唑基、2-和4-咪唑基、2-、4-和5-噁唑基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-吡啶基、2-和3-呋喃基-乙炔基、2-和3-噻吩基-乙炔基、2-和4-咪唑基-乙炔基、2-、4-和5-噻唑基-乙炔基、2-、4-和5-噁唑基-乙炔基、2-和3-吡咯基-乙炔基、2-和3-噻吩基、2-和3-呋喃基、2-和3-吡咯基、丙烯基(-CH≡CH-CH3)、乙烯基和-C≡C-Z′，其中Z′是氢(H)或C1-C10烷基、卤代烷基(含有1-6个卤素原子的C1-C10)或杂烷基(含有1-3个选自O、N和S的杂原子的C1-C10)。炔基部分也可以是连接物组分或连接片段。
示例性的氟代烷基包括被一个或多个氟部分取代的直链烷基(例如，C1-C20、C2-C16、C3-C10，C4-C8)和环烷基(例如，C3-C8)部分。示例性的氟代烷基包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个碳原子。全氟化合物可以用于本发明的化合物。
单体
在不同的实施方案中，本发明提供了用于合成寡聚体的单体核酸。在一个代表性的实施方案中，单体核酸是携带稳定化部分的亚磷酰胺。根据该实施方案的一个示例性的单体核酸具有式：
在不同的实施方案中，稳定化部分是炔烃残基，提供具有下式的单体核酸：
Figure BPA00001258097200301
其中Q是猝灭剂，且L4是连接物。示例性的连接物包括零阶和取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。Rd是H、取代的或未取代的烷基，或取代的或未取代的杂烷基。在一个示例性的实施方案中，Rd是核酸保护基，例如，DMT。Rc是H，或是亚磷酰胺的组分，例如，-OPN(i-Pr)2(OCNE)。用B标记的环代表如本文定义的碱基。示例性的碱基包括：
Figure BPA00001258097200311
其中R10代表L4-Q。
在不同的实施方案中，Q-L4具有式：
Figure BPA00001258097200312
其中Rq是H、取代的或未取代的烷基或取代的或未取代的杂烷基，且指标e代表1-20的整数，即，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。
也提供了核酸寡聚体，例如探针，其使用本发明的单体制备，且包括用于合成它的单体的组分。
寡聚体
示例性的寡聚体包括寡核苷酸、寡核苷、寡脱氧核糖核苷酸(含有2′-脱氧-D-核糖或其修饰形式)即DNA、寡核糖核苷酸(含有D-核糖或其修饰形式)即RNA，和是嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的任意其它类型的多核苷酸。本文使用的寡聚体也包括这样的化合物，其中邻近的核单体通过酰胺键相连，如以前所述(Nielsen等人，Science(1991)254：1497-1500)。认为含有本发明碱基的寡聚体的增强的结合感受态基本上仅随碱基而变化。因此，在寡聚体中常见的元件，例如呋喃糖环和/或磷酸二酯键，可以用任意合适的功能上等效的元件替换。″寡聚体″因而意在包括用作碱基的支架或载体的任意结构，其中所述支架允许以序列-依赖性的方式结合靶核酸。
连接本发明的寡聚体中的核单体的示例性的基团包括：(i)磷酸二酯和磷酸二酯修饰(硫代磷酸酯、甲基膦酸酯，等)，(ii)含有非磷电子等排体的替代连接(甲缩醛(formacetal)、核糖缩醛(riboacetal)、氨甲酸酯，等)，(iii)吗啉代残基、碳环残基或其它呋喃糖，例如阿拉伯糖，或代替核糖或脱氧核糖的己糖，和(iv)通过酰胺键连接的核单体，或通过任意合适的替代连接相连的无环核单体。
使用修饰的和常规的核单体，可以制备本发明的寡聚体，且可以使用标准的固相(或溶液相)寡聚体合成技术来合成，它们现在可以商业上获得。一般而言，通过包含下述步骤的方法，可以合成寡聚体：合成具有保护基和碱基和偶联基团的核单体或寡聚体合成子，所述偶联基团能偶联至核单体或寡聚体；使核单体或寡聚体合成子偶联至受体核单体或受体寡聚体；去除保护基；并根据需要重复该循环，直到合成希望的寡聚体。
本发明的寡聚体可以具有任意长度，包括大于40、50或100个核单体的长度。在不同的实施方案中，寡聚体含有2-30个核单体。大于或等于约8至20个核单体的长度可用于治疗或诊断用途。含有2、3、4或5个核单体的短寡聚体特别地包含在本发明中，且可以用作例如合成子。
具有随机化的序列且含有少于20个、少于15个或少于10个核单体的寡聚体可以用作引物，例如，在使用随机序列引物的克隆或扩增方法中，条件是，所述寡聚体含有用作聚合酶或反转录酶的引物的残基。
寡聚体可以含有常规的磷酸二酯键，或可以含有磷酸二酯修饰例如氨基磷酸酯键。这些替代连接包括但不限于这样的实施方案，其中式-O-P(O)(S)-O-(″硫代磷酸酯″)、-O-P(S)(S)-O-(″二硫代磷酸酯″)、-O-P(O)-(NRo 2)-X-、-O-P(O)(Ro)-O-O-P(S)(Ro)-O-(″硫羰烷基膦酸酯″)、-P(O)(或p)-X-、-O-C(O)-X-、或-O-C(O)(NRp 2)-X-(其中Ro是H(或盐)或烷基(1-12C)，且Rp是烷基(1-9C)和键)的部分，通过与核单体的碳相连的-O-或-S-，连接至邻近的核单体。在不同的实施方案中，用于本发明的寡聚体中的替代连接包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和硫羰甲基膦酸酯键。硫代磷酸酯和甲基膦酸酯键会赋予在生理环境中的寡聚体额外的稳定性。尽管相同寡聚体中的所有这样的键不需要一致，本发明的特别优选的寡聚体含有一致的硫代磷酸酯键或一致的甲基膦酸酯键。
常规地合成寡聚体或其区段，且可以使用本发明的固体载体和/或亚磷酰胺制备。本领域已知的和本文所述的合成方法可以用于合成含有本发明的碱基以及本领域已知的其它碱基的寡聚体，其中使用适当保护的核单体。合成寡聚体的方法，参见，例如，Froehler，B.，等人，Nucleic Acids Res.(1986)14：5399-5467；Nucleic Acids Res.(1988)16：4831-4839；Nucleosides and Nucleotides(1987)6：287-291；Froehler，B.，Tetrahedron Lett.(1986)27：5575-5578；Caruthers，M.H.见：Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression(1989)，J.S.Cohen，主编，CRC Press，Boca Raton，p7-24；Reese，C.B.等人，Tetrahedron Lett.(1985)26：2245-2248。还已经描述了通过磷酰亚胺酸甲酯化学方法合成甲基膦酸酯连接的寡聚体(Agrawal，S.等人，Tetrahedron Lett.(1987)28：3539-3542；Klem，R.E.，等人，国际公开号WO 92/07864)。
如本文公开的，本发明提供了寡聚体的″缀合物″。例如，寡聚体可以共价连接至不同的官能组分，例如，稳定化部分(Xa)、荧光团、猝灭剂、嵌入剂、和与DNA双螺旋的小沟特异性地相互作用的物质(小沟结合剂，“MGB”)。其它选择的缀合物部分可以是标记，例如放射性标记、荧光标记、酶，或使用切割连接物等促进细胞结合的部分。合适的放射性标记包括32P、35S、3H和14C；合适的荧光标记包括荧光素、试卤灵、若丹明、BODIPY(Molecular Probes)和德克萨斯红；合适的酶包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。其它荧光团如本文所述，且是本领域普遍公认的。其它共价连接的部分包括生物素、抗体或抗体片段和蛋白，例如，转铁蛋白和HIV Tat蛋白。
如本文讨论的和本领域公认的，通过任意方便的连接，可以衍生化寡聚体。例如，小沟结合剂、荧光团、猝灭剂和嵌入剂、例如吖啶或补骨脂素，可以通过任意可利用的-OH或-SH连接至本发明的寡聚体，例如，在寡聚体的末端5′-位，RNA的2′-位，或掺入嘧啶的5-位的OH、NH2、COOH或SH。含有例如在5-位的-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2OH或-CH2CH2CH2SH的衍生化形式，可以用于本发明中。可以按照描述来合成包含聚赖氨酸或赖氨酸的缀合物，且可以进一步增强寡聚体与它的靶核酸序列的结合亲和力(Lemaitre，M.等人，Proc Natl Acad Sci(1987)84：648-652；Lemaitre，M.等人，Nucleosides and Nucleotides(1987)6：311-315)。
可以结合许多种取代基，包括通过连接或替代连接结合的那些。寡聚体的磷酸二酯连接中的-OH部分可以替换为磷酸基，用标准的保护基保护，或偶联基团，以产生与其它核单体的额外连接，或可以结合缀合的取代基。5′-末端OH可以被磷酸化；2′-OH或在3′-末端的OH取代基也可以被磷酸化。羟基也可以衍生化成标准的保护基。
使用可切割的连接物，可以将本发明的寡聚体共价地衍生成促进细胞结合的部分。用于这样的缀合物的连接物可以包括，在寡聚体-运载剂缀合物已经进入细胞后还原的二硫键。这类含有二硫键的连接物具有可控的半衰期。由于二硫键的氧化还原电位，与胞内条件相比，这样的连接物在胞外条件下是稳定的。
供体和受体部分
猝灭剂
本发明的示例性的固体载体和寡聚体包括，任选地通过连接物与其共价结合的猝灭剂。在不同的实施方案中，猝灭剂是具有根据式(II)的结构的部分
Figure BPA00001258097200341
其中R1、R2和R3是独立地选自下述的成员：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基。符号X、Y和Y′是独立地选自下述的成员：反应官能团和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段。指标f是选自0-4的数字(即，0，1，2，3，或4)，且包含端值，使得当(f x s)大于1时，Y′基团是相同的或不同的。指标m是选自0-5的数字(即，0，1，2，3，4，或5)，且包含端值，使得当m大于1时，X基团是相同的或不同的。指标n是选自0-6的数字(即，0，1，2，3，4，5或6)，且包含端值，使得当(n x t)大于1时，Y基团是相同的或不同的。指标s是选自0-6的数字(即，0，1，2，3，4，5或6)，且包含端值，使得当s大于1时，R3基团是相同的或不同的。指标t是选自1-6的数字(即，1，2，3，4，5或6)，且包含端值，使得当t大于1时，R2基团是相同的或不同的，且当t是1、且s是0时，选自R1、R2及其组合的成员是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基。
在不同的实施方案中，猝灭剂具有根据式(III)的结构：
Figure BPA00001258097200351
本发明的固体载体和寡聚体也可以包括根据式III的猝灭剂，其中选自R1、R2和R3的成员包括根据式IV的结构：
Figure BPA00001258097200352
其中R4是选自下述的成员：烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
用于不同实施方案中的猝灭剂具有根据式V的结构：
Figure BPA00001258097200353
(V)
其中v是1-10的整数(即，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)。
在示例性的实施方案中，猝灭剂具有根据式VI的结构：
Figure BPA00001258097200361
其中符号R5、R6和R7是独立地选自下述的成员：-NR′R”、取代的或未取代的芳基、硝基、取代的或未取代的C1-C6烷基，和取代的或未取代的C1-C6烷氧基。R′和R”独立地选自H和取代的或未取代的C1-C6烷基。指标n是0-1的整数。指标a是0-4的整数(即，0，1，2，3，或4)，使得当a大于1时，R5基团是相同的或不同的。指标b是0-4的整数(即，0，1，2，3，或4)，使得当(v x b)大于1时，R6基团是相同的或不同的。指标c是0-5的整数(即，0，1，2，3，4，或5)，使得当c大于1时，R7基团是相同的或不同的；且v是1-10的整数(即，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)，使得当v大于1时，每个b苯基环上的b值是相同的或不同的。
不同的实施方案利用具有根据式VII的结构的猝灭剂：
Figure BPA00001258097200362
其中R5、R6和R7是独立地选自下述的成员：胺、烷基胺、取代的或未取代的芳基、硝基、取代的或未取代的C1-C6烷基、取代的或未取代的C1-C6烷氧基。符号X1和X2代表独立地选自下述的成员：C1-C6烷基或C1-C6取代的烷基、-OH、-COOH、-NR′R″、-SH、-OP(OX3)(NR′R”)和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段。R′和R”是独立地选自下述的成员：H，和取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在某些实施方案中，本发明的化合物利用具有选自下述的结构的猝灭剂：
Figure BPA00001258097200371
其中X5和X6是独立地选自下述的成员：H，反应官能团和使所述猝灭剂(Q)共价连接至L3的连接片段，条件是，X5和X6中的至少一个是这样的连接片段。
因而，本发明提供了根据式I的化合物，其包括选自下述的组分：
Figure BPA00001258097200372
技术人员会理解，上述结构中的L3可以替换为L4和它与丙炔修饰的碱基的连接。
本发明的化合物的优点之一是，广范围的能量供体分子可以与猝灭剂-官能化的固体载体和寡聚体联合使用。众多荧光团是本领域技术人员已知的。参见，例如，Cardullo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8790-8794(1988)；Dexter，D.L.，J.of Chemical Physics 21：836-850(1953)；Hochstrasser等人，Biophysical Chemistry 45：133-141(1992)；Selvin，P.，Methods in Enzymology 246：300-334(1995)；Steinberg，I.Ann.Rev.Biochem.，40：83-114(1971)；Stryer，L.Ann.Rev.Biochem.，47：819-846(1978)；Wang等人，Tetrahedron Letters 31：6493-6496(1990)；Wang等人，Anal.Chem.67：1197-1203(1995)。
在表1中提供了可以与本发明的猝灭剂联合使用的示例性供体的非限制性列表。
表1
                                                          
可以选择作为供体-受体能量转移对中的供体或受体的合适的部分
                                                          
4-乙酰胺基-4′-异硫代氰氧基均二苯乙烯-2，2′二磺酸
吖啶和衍生物：
吖啶
吖啶异硫代氰酸酯
5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)
4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘亚胺-3，5二磺酸酯
N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺
2-氨基苯甲酰胺
BODIPY
灿烂黄
香豆素和衍生物：
香豆素
7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)
7-氨基-4-三氟甲基couluarin(香豆满151)
酞菁染料
四溴四氯荧光素钠
4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)
5′，5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)
7-二乙氨基-3-(4′-异硫代氰氧基苯基)-4-甲基香豆素二亚乙基三胺五乙酸酯
4，4′-二异硫代氰氧基二氢-均二苯乙烯-2，2′-二磺酸
4，4′-二异硫代氰氧基均二苯乙烯-2，2′-二磺酸
5-[二甲氨基]萘-1-磺酰基氯(DNS，丹磺酰氯)
4-(4′-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)
4-二甲氨基苯偶氮基苯基-4′-异硫代氰酸酯(DABITC)
曙红和衍生物：
曙红
曙红异硫代氰酸酯
赤藓红和衍生物：
赤藓红B
赤藓红异硫代氰酸酯
胡米胺
荧光素和衍生物：
5-羧基荧光素(FAM)
5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)
2′，7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)
荧光素
荧光素异硫代氰酸酯
QFITC(XRITC)
荧光胺
IR144
IR1446
孔雀绿异硫代氰酸酯
4-甲基伞形酮
邻甲酚酞
硝基酪氨酸
碱性副品红
酚红
B-藻红蛋白
邻-酞二醛
芘和衍生物：
芘
芘丁酸酯
琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯
量子点(quantum dots)
活性红4(CibacronTM亮红3B-A)
若丹明和衍生物：
6-羧基-X-若丹明(ROX)
6-羧基若丹明(R6G)
丽丝胺玫瑰红B磺酰基氯若丹明(Rhod)
若丹明B
若丹明123
若丹明X异硫代氰酸酯
磺酰若丹明B
磺酰若丹明101
磺酰若丹明101的磺酰基氯衍生物(德克萨斯红)
N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)
四甲基若丹明
四甲基若丹明异硫代氰酸酯(TRITC)
核黄素
玫红酸
金属螯合物，例如，镧系元素螯合物(例如，铕铽螯合物)，钌螯合物
关于为特定探针选择适当的供体-受体对，在文献中可得到大量实践指导，如下述参考文献所例证的：Pesce等人，编，FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker，New York，1971)；White et al.，FLUORESCENCE ANALYSIS：A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker，New York，1970)；等。文献也包括这样的参考文献，其提供了荧光和发色分子的详尽列表和它们的与选择报道分子-猝灭剂对有关的光学性质(参见，例如，Berlman，HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES，第2版(Academic Press，New York，1971)；Griffiths，COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press，New York，1976)；Bishop，编，INDICATORS(Pergamon Press，Oxford，1972)；Haugland，HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes，Eugene，1992)Pringsheim，FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers，New York，1949)；等。此外，关于衍生化报道分子和猝灭剂分子来实现通过可以添加到核酸上的普通反应基团的共价连接，文献中存在大量指导，如下述参考文献所例证的：Haugland(同上)；Ullman等人，美国专利号3,996,345；Khanna等人，美国专利号4,351,760。因而，本领域技术人员能够容易地为特定用途选择能量交换对，并将该对的成员缀合到探针分子上，例如核酸、肽或其它聚合物。
一般而言，优选地，BHQ的吸光度带基本上与供体的荧光发射带重叠。当供体(荧光团)是利用供体-受体能量转移的探针的组分时，优选地选择本发明的供体荧光部分和猝灭剂(受体)，使得当供体部分被激发时，供体和受体部分表现出供体-受体能量转移。在选择荧光团-猝灭剂对时要考虑的一个因素是它们之间的供体-受体能量转移效率。优选地，供体和受体部分之间的FRET效率是至少10％、更优选至少50％和甚至更优选至少80％。使用本文所述的和本领域已知的方法，可以容易地经验地检验FRET效率。
通过改变供体和受体基团的二聚化或紧密结合的能力，也可以调节供体-受体对之间的能量转移效率。如果已知或确定供体和受体部分会紧密结合，通过调节连接物部分或探针本身的长度，可以促进供体和受体之间结合的增加或降低。通过调节疏水或离子相互作用或探针构建体中的空间排斥，可以增加或降低供体-受体对的结合能力。因而，可以增强或减弱引起供体-受体对结合的分子内相互作用。因而，例如，通过例如利用携带总体负电荷的供体和具有总体正电荷的受体，可以增加供体-受体对之间的结合。
除了直接结合探针的荧光团以外，荧光团也可以通过间接方式连接。在该实施方案中，配体分子(例如，生物素)通常共价结合探针物质。所述配体然后结合另一个分子(例如，抗生蛋白链菌素)分子，后者是固有地可检测的，或共价结合至信号系统，例如荧光化合物或通过非荧光化合物的转化生成荧光化合物的酶。可用作标记的感兴趣的酶包括，例如，水解酶，尤其是磷酸酶，酯酶和糖苷酶，水解酶，肽酶或氧化酶，尤其是过氧化物酶，和。荧光化合物包括如上讨论的荧光素和它的衍生物、若丹明和它的衍生物、丹磺酰、伞形酮等。关于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见，美国专利号4,391,904。
目前优选的与BHQ联合使用的供体包括，例如，呫吨染料，包括荧光素，酞菁染料和若丹明染料。这些化合物的许多合适形式可广泛地商业上得到，在它们的苯基部分上有取代基，它们可以用作键合位点或连接核酸的键合官能团。另一组优选的荧光化合物是萘基胺，其具有在α或β位的氨基。这样的萘基氨基化合物包括1-二甲氨基萘基-5-磺酸酯，1-苯胺基-8-萘磺酸酯和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸酯。其它供体包括3-苯基-7-异氰氧基香豆素，吖啶，例如9-异硫代氰氧基吖啶和吖啶橙；N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并噁二唑，均二苯乙烯，芘，等。
为了说明清楚，下面的讨论重点是将BHQ和荧光团连接至核酸。把重点放在核酸探针上，无意限制BHQ可以连接的探针分子的范围。本领域技术人员会理解，使用标准的合成化学方法，BHQ也可以连接小分子、蛋白、肽、合成的聚合物、固体载体等。
在一个目前优选的实施方案中，其中探针是核酸探针，报道分子是荧光素染料(FAM)。荧光素部分优选地连接至核酸的3′-或5′-末端，尽管内部位点也是可接近的，且对于选择的目的而言具有实用性。无论FAM衍生物连接哪个末端，BHQ通常连接至它的对极(antipode)，或在核酸链的内部位置。优选地使用6-FAM酰胺化物引入FAM供体。也优选地使用供体的酰胺衍生物，引入不同的供体部分。或者，通过与结合至核酸的拴系或连接臂上的反应官能团(例如，己基胺)的反应，可以引入包含反应官能团(例如，异硫代氰酸酯，活性酯，等)的供体部分。
在另一个优选的实施方案中，利用衍生化的合成载体，可以使供体部分结合在核酸的3′-末端。例如，使用用该荧光团的类似物衍生化的固体载体(Biosearch Technologies，Inc.)，将TAMRA(四甲基若丹明羧酸)结合至核酸3′-末端。
考虑到关于将小分子缀合至核酸的丰富的文献内容，许多将供体/受体对连接至核酸的其它方法是本领域技术人员显而易见的。例如，通过用亚磷酰胺部分衍生化的染料，在固相合成结束时将若丹明和荧光素染料方便地连接至核酸的5′-羟基(参见，例如，Woo等人，美国专利号5,231,191；和Hobbs，Jr.，美国专利号4,997,928)。
更具体地，存在许多将基团连接至核酸的5′-或3′-末端的连接物部分和方法，如下述参考文献所例证的：Eckstein，编，Nucleic acids and Analogues：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research，15：5305-5321(1987)(核酸上的3′-巯基)；Sharma等人，Nucleic Acids Research，19：3019(1991)(3′-巯基)；Giusti等人，PCR Methods and Applications，2：223-227(1993)和Fung等人，美国专利号4,757,141(5′-磷酰化氨基，通过可从P.E.Biosystems，CA.得到的Aminolink TM II)Stabinsky，美国专利号4,739,044(3-氨基烷基磷酰基)；Agrawal等人，Tetrahedron Letters，31：1543-1546(1990)(通过氨基磷酸酯键连接)；Sproat等人，Nucleic Acids Research，15：4837(1987)(5-巯基)；Nelson等人，Nucleic Acids Research，17：7187-7194(1989)(3′-氨基)，等。
检测荧光标记的方法是本领域技术人员熟知的。因而，例如，通过用适当波长的光激发荧光团并检测得到的荧光，可以检测荧光标记。可以肉眼地、借助于胶卷、使用电子检测器例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等，检测荧光。类似地，通过为酶提供适当的底物并检测得到的反应产物，可以检测酶标记。
反应官能团
本发明的固体载体和寡聚体的组分(例如，连接物、荧光团、猝灭剂、稳定化部分)通过连接片段相连，所述连接片段通过第一种和第二种反应官能团的反应而形成。反应官能团具有互补反应性，且它们反应形成寡聚体的2种组分之间的共价键，在本文中称作连接片段。关于式I的固体载体，反应官能团存在于L1、L2和L3的前体上以及Q、Za和Xa的前体上。在不同的实施例中，Xa和L1通过连接片段共价连接；L2和Za通过连接片段进行连接；L3和Q通过连接片段进行连接，每个连接片段通过本发明的寡聚体的命名组分的前体上的反应官能团的反应而形成。连接片段存在于式VII和VIII的寡聚体的类似基团中。
关于本发明的固体载体、亚磷酰胺和寡聚体组分的前体，反应官能团可以位于这些前体上的任意位置，例如，烷基或杂烷基，芳基或杂芳基核，或芳基或杂芳基核上的取代基。类似地，反应官能团位于烷基或杂烷基链的任意位置。在不同的实施方案中，当反应基团连接至烷基(或杂烷基)或取代的烷基(或杂烷基)链时，反应基团优选地位于链的末端位置。
可用于实践本发明的反应基团和反应类型通常是生物缀合化学领域熟知的那些。本发明的寡聚体的反应前体可利用的目前优选的反应类型是在相对温和的条件下进行的那些。这些包括但不限于，亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)，亲电取代(例如，烯胺反应)和添加碳-碳和碳-杂原子重键(例如，迈克尔反应，Diels-Alder加成)。在下述参考文献中讨论了这些和其它有用的反应：例如，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in ChemistrySeries，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
作为实例，用于本发明的反应官能团包括但不限于，烯烃、乙炔、醇、苯酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫代氰酸酯、异硫代氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重盐、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐、次磺酸异腈、脒、酰亚胺、酰亚胺化物、硝酮、羟胺、肟、羟肟酸，硫代羟肟酸、丙二烯、邻酯、亚硫酸酯、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳化二亚胺、氨甲酸酯、亚胺、叠氮化合物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物，和亚硝基化合物。反应官能团也包括用于制备生物缀合物的那些，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。制备每个这样的官能团的方法是本领域熟知的，且它们用于特别目的的用途或为特定目的的改进属于本领域技术人员的常识(参见，例如，Sandler和Karo，编.ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS，Academic Press，San Diego，1989)。
有用的反应官能团转化包括，例如：
(a)羧基，其可以容易地转化成各种衍生物，包括，但不限于，活性酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、硫酯、对硝基苯基酯)、酸性卤化物、酰基咪唑、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)羟基，其可以转化成酯、醚、卤化物、醛，等；
(c)卤代烷基，其中卤化物可以在以后置换为亲核基团，例如，胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、负碳离子、或醇盐离子，从而导致新基团在卤素原子部位的共价结合；
(d)二烯亲合物基团，其能参与Diels-Alder反应，例如，马来酰亚胺基；
(e)醛或酮基团，使得可以通过形成羰基衍生物(例如，亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过诸如Grignard加成或烷基锂加成的机理，进行后续的衍生化；
(f)磺酰基卤基团，用于以后与胺反应，例如，形成磺胺；
(g)硫氢基，其可以例如转化成二硫键或与酰卤反应；
(h)胺或巯基，其可以例如被酰化、烷基化或氧化；
(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、Michael加成等；
(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；和
(k)亚磷酰胺和可用于核酸合成的其它标准的官能团。
可以选择反应官能团，使得它们不参与或干扰装配本发明的寡聚体所需的反应。或者，可以用保护基保护反应官能团，使其不参与反应。本领域技术人员理解如何保护特定官能团，使它不干扰选择的反应条件集合。关于有用的保护基的实例，参见，例如，Greene等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
共价键合部分
在本发明的有些寡聚体中包括反应官能团部分，其能实现寡聚体和靶序列之间的至少一个共价键。通过提供多个这样的部分，也可以形成多个共价键。共价键优选地连接至靶链中的碱基残基，但是也可以与靶物的其它部分(包括糖或磷酸二酯)形成。实现交联的部分的反应性质决定了双链体中的靶物的性质。优选的交联部分包括酰化剂和烷化剂，和具体地，相对于赋予序列特异性的部分安置的那些，以便允许与链中的靶位反应。
交联部分可以方便地安置成寡聚体序列中的类似的嘧啶或嘌呤残基。可以安置在5′-和/或3′-末端、序列的内部、或上述的组合。优选地，安置在末端，以实现提高的柔性。类似的部分也可以连接至肽主链。
可用于本发明中的示例性的烷化部分包括N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶和N6，N6-桥亚乙基腺嘌呤。
显然，碱基不需要是嘌呤或嘧啶；实际上，反应官能团连接的部分根本不需要是碱基，可以是糖、连接物、猝灭剂、稳定化部分、荧光团或本发明的寡聚体的这些组分的某种组合。只要安置是正确的，连接反应基团的任意方式都是令人满意的。
合成
通常常规地合成本发明的固体载体、单体(例如，亚磷酰胺)和寡聚体或其区段。本领域已知的和本文所述的合成方法可以用于合成含有本发明的碱基以及本领域已知的其它碱基的寡聚体，其中使用适当保护的核单体。合成寡聚体的方法，参见，例如，Froehler，B.，等人，Nucleic Acids Res.(1986)14：5399-5467；Nucleic Acids Res.(1988)16：4831-4839；Nucleosides and Nucleotides(1987)6：287-291；Froehler，B.，Tetrahedron Lett.(1986)27：5575-5578；Caruthers，M.H.见：Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression(1989)，J.S.Cohen，主编，CRC Press，Boca Raton，p7-24；Reese，C.B.等人，Tetrahedron Lett.(1985)26：2245-2248。还已经描述了通过磷酰亚胺酸甲酯化学方法合成甲基膦酸酯连接的寡聚体(Agrawal，S.等人，Tetrahedron Lett.(1987)28：3539-3542；Klem，R.E.，等人，国际公开号WO 92/07864)。
在图1、图2和所附实施例中，阐明了本发明固体载体的一种示例合成。
在一个示例性的实施方案中，使用标准的合成条件和试剂，将核单体直接掺入寡聚体或其合适片段中。通过该方法产生的示例性连接包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、碳酸酯、吗啉代氨甲酸酯和磺酸酯。
在不同的实施方案中，合成包含从适当前体开始合成短合成子(二聚体、三聚体，等)。该方案适用于合成下述连接，包括N-甲基羟胺、二甲基次联氨基、氨基磺酸酯、氨甲酸酯、磺酸酯、氨苯磺胺、甲缩醛、硫代甲缩醛和碳酸酯。
通过任意合适的化学方法，包括酰胺化物、三酯或氢膦酸酯偶联方法和条件，可以合成本发明的寡聚体。优选地从适当起始合成子合成寡聚体，所述起始合成子优选地在5′-位用DMT、MMT、FMOC(9-芴基甲氧基羰基)、PACO(苯氧基乙酰基)、甲硅烷基醚例如TBDMS(叔丁基联苯基甲硅烷基)或TMS(三甲基甲硅烷基)保护，且在3′-位用酯、H-膦酸酯、酰胺化物例如β-氰乙基亚磷酰胺、甲硅烷基醚例如TBDMS或TMS或叔丁基联苯基激活。或者，适当的尿苷或胞苷前体例如阻断的5-碘-2′-脱氧尿苷、5-碘-2′-O-烷基尿苷、5-溴-2′-脱氧尿苷、5-三氟甲烷磺酸酯-2′-脱氧尿苷、5-溴-2′-O-烷基尿苷或阻断的和受保护的5-碘-2′-脱氧胞苷、5-溴-2′-脱氧胞苷、5-三氟甲烷磺酸酯-2′-脱氧胞苷、5-碘-2′-O-烷基胞苷、5-溴-2′-O-烷基胞苷，可以方便地掺入短寡聚体例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更长的合成子，它们随后衍生化，生成合适的合成子和更长的寡聚体。
使用携带偶联基团的合成子例如单体、二聚体或三聚体，所述偶联基团适合与酰胺化物、H-膦酸酯或三酯化学试剂一起使用，实现含有约4个或更多个核单体残基的寡聚体的示例性合成。合成子可以用于通过磷酸二酯或除磷酸二酯以外的含磷连接(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硫羰甲基膦酸酯、氨基磷酸酯等)，连接寡聚体组分。
使用本领域已知的适当前体，可以实现其它不含磷的取代连接的合成。
一旦合成了希望的核酸，优选地从合成它的固体载体切割下来，并通过本领域已知的方法进行处理，以去除存在的所有保护基(例如，60℃，5h，浓氨水)。在那些其中碱敏感的基团连接至核酸(例如，TAMRA)的实施方案中，去保护优选地使用更温和的条件(例如，丁基胺∶水1∶3，8小时，70℃)。利用快速去保护的酰胺化物(例如，dC-乙酰基，dG-dmf)会促进这些条件下的去保护。
从载体切割下来并去保护后，通过本领域已知的任意方法纯化核酸，包括色谱法、萃取和凝胶纯化。在一个优选的实施方案中，使用HPLC纯化核酸。优选地通过在分光光度计中测量在260nm的光密度，测定分离的核酸的浓度和纯度。
本发明的测定法和寡聚探针
在不同的实施方案中，本发明提供了用于一个或多个测定形式中的寡聚体。在选择的实施方案中，在结合它的靶物或与之解离后，寡聚体参与可检测的信号的产生。本发明的寡聚探针不限于用于任何特定测定形式。因此，下面的描述意在解释在其中使用本发明的寡聚体的示例性测定形式，且无意限制在其中使用寡聚体的测定形式。
测定法
下面的讨论一般与本文所述的测定法有关。该讨论意在参考某些优选的实施方案解释本发明，不应当解释为限制探针的范围和在其中使用本发明的化合物的测定类型。利用本发明的化合物的其它测定形式是本领域技术人员显而易见的。
一般而言，为了测定靶分子(例如，核酸)的浓度，优选地首先得到参照数据，其中使恒定量的探针和核酸配体接触不同量的靶物。使用每个参照混合物的荧光发射得出图或表，在其中将靶物浓度与荧光发射相对比。例如，具有下述特征的探针可以用于获得这样的参照数据：a)与无靶物的核酸配体杂交；和b)具有茎-环结构，其5′和3′末端是荧光部分和BHQ标记的位点。这样的探针会产生特有的发射图谱，其中在有恒定量的探针和核酸配体存在下，荧光发射随着靶物浓度的增加而降低。然后，使含有未知量的靶物的实验混合物接触相同量的第一种核酸配体和第二种探针，并测定荧光发射。然后将荧光发射的值与参照数据进行对比，以得到实验混合物中靶物的浓度。
多路分析
在另一个实施方案中，本发明的固体载体和寡聚体用作探针或一种或多种探针的组分，它们在多路测定中用于检测混合物中的一种或多种物质。
基于本发明的固体载体或寡聚体的探针特别适用于进行多路型分析和测定。在一个典型的多路分析中，使用两种或多种探针检测两种或多种不同的物质(或一种或多种物质的区域)，其中每种探针用不同的荧光团标记。在依赖于供体-受体能量转移的多路分析中使用的优选物质满足至少2个标准：荧光物质是明亮的，且其光谱容易分辨；荧光物质和猝灭剂之间的能量转移是有效的。
本发明的固体载体和寡聚体允许设计多路测定，其中超过一种猝灭剂结构用于测定中。许多使用本发明的固体载体或寡聚体的不同的多路测定，是本领域技术人员显而易见的。在一个示例性的测定中，至少2种不同的猝灭剂中的每一种用于猝灭从一个或多个相同荧光团衍生的能量。或者，可以实施这样的测定，其中每种不同的猝灭剂猝灭从该猝灭剂“匹配的”不同荧光团衍生的能量。荧光团可以结合相同分子(作为猝灭剂)或不同分子。此外，类似于猝灭剂和荧光团，用于特定测定系统中的载体分子可以是相同的或不同的。
除了上述的混合物以外，本发明也提供了检测或定量特定分子物质的方法。该方法包括：(a)使所述物质接触含有本发明的固体载体或寡聚体的混合物；和(b)检测得到的混合物的一种或多种组分的荧光性质的变化，从而检测或定量所述分子物质。
两种或多种使用供体-受体能量转移的探针的同时应用，是本领域已知的。例如，已经描述这样的多路测定，其使用具有不同序列特异性的核酸探针。荧光探针已经用于测定个体是纯合的野生型、纯合的突变体，还是特定突变杂合的。例如，使用一种识别野生型序列的猝灭的-荧光素分子指示标和另一种识别突变体等位基因的若丹明-猝灭的分子指示标，可以对个体的β-趋化因子受体进行基因分型(Kostrikis等人Science 279：1228-1229(1998))。仅存在荧光素信号表明，该个体是野生型，仅存在若丹明信号表明，该个体是纯合的突变体。若丹明和荧光素信号都存在，是杂合子的特征。Tyagi等人，Nature Biotechnology 16：49-53(1998)已经描述了4种差别标记的分子指示标用于等位基因鉴别的同时应用，且Lee等人，BioTechniques 27：342-349(1999)已经描述了6种PCR产物的7色同源检测。
本发明的猝灭剂可以用于多路测定中，所述多路测定设计为检测和/或定量基本上任意的物质，包括，例如，全细胞、病毒、蛋白(例如，酶、抗体、受体)、糖蛋白、脂蛋白、亚细胞颗粒、生物体(例如，沙门菌属)、核酸(例如，DNA、RNA和它们的类似物)、多糖、脂多糖、脂类、脂肪酸、非生物聚合物和小分子(例如，毒素、药物、杀虫剂、代谢产物、激素、生物碱、甾类)。
核酸探针
本发明的固体载体和寡聚体是有用的核酸探针，它们可以用作多种DNA扩增/定量策略中的检测试剂的组分，所述策略包括，例如，5′-核酸酶测定、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、以及用于溶液相或固相(例如，阵列)测定中靶物的直接检测。此外，固体载体和寡聚体可以用于基本上任意形式的探针中，包括，例如，选自下述的形式：分子指示标、蝎子探针TM、日出探针TM、构象辅助的探针、照亮探针、侵略者检测探针和TaqManTM探针。参见，例如，Cardullo，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8790-8794(1988)；Dexter，D.L.，.J.Chem.Physics，21：836-850(1953)；Hochstrasser，R.A.，等人，Biophysical Chemistry，45：133-141(1992)；Selvin，P.，Methods in Enzymology，246：300-334(1995)；Steinberg，I.，Ann.Rev.Biochem.，40：83-114(1971)；Stryer，L.，Ann.Rev.Biochem.，47：819-846(1978)；Wang，G.，等人，Tetrahedron Letters，31：6493-6496(1990)；Wang，Y.，等人，Anal.Chem.，67：1197-1203(1995)；Debouck，C.，等人，nature genetics的增刊，21：48-50(1999)；Rehman，F.N.，等人，Nucleic Acids Research，27：649-655(1999)；Cooper，J.P.，等人，Biochemistry，29：9261-9268(1990)；Gibson，E.M.，等人，Genome Methods，6：995-1001(1996)；Hochstrasser，R.A.，等人，Biophysical Chemistry，45：133-141(1992)；Holland，P.M.，等人，Proc Natl.Acad.Sci USA，88：7276-7289(1991)；Lee，L.G.，等人，Nucleic Acids Rsch.，21：3761-3766(1993)；Livak，K.J.，等人，PCR Methods and Applications，Cold Spring Harbor Press(1995)；Vamosi，G.，等人，Biophysical Journal，71：972-994(1996)；Wittwer，C.T.，等人，Biotechniques，22：176-181(1997)；Wittwer，C.T.，等人，Biotechniques，22：130-38(1997)；Giesendorf，B.A.J.，等人，Clinical Chemistry，44：482-486(1998)；Kostrikis，L.G.，等人，Science，279：1228-1229(1998)；Matsuo，T.，Biochemica et Biophysica Acta，1379：178-184(1998)；Piatek，A.S.，等人，Nature Biotechnology，16：359-363(1998)；Schofield，P.，等人，Appl.Environ.Microbiology，63：1143-1147(1997)；Tyagi S.，等人，Nature Biotechnology，16：49-53(1998)；Tyagi，S.，等人，Nature Biotechnology，14：303-308(1996)；Nazarenko，I.A.，等人，Nucleic Acids Research，25：2516-2521(1997)；Uehara，H.，等人，Biotechniques，26：552-558(1999)；D.Whitcombe，等人，Nature Biotechnology，17：804-807(1999)；Lyamichev，V.，等人，Nature Biotechnology，17：292(1999)；Daubendiek，等人，Nature Biotechnology，15：273-277(1997)；Lizardi，P.M.，等人，Nature Genetics，19：225-232(1998)；Walker，G.，等人，Nucleic Acids Res.，20：1691-1696(1992)；Walker，G.T.，等人，Clinical Chemistry，42：9-13(1996)；和Compton，J.，Nature，350：91-92(1991)。
因而，本发明提供了检测核酸靶序列的方法。该方法包括：(a)使靶序列接触检测器核酸(例如，本发明的寡聚体)；(b)使靶物结合序列与靶序列杂交，从而改变检测器核酸的构象，造成荧光参数的变化；和(c)检测荧光参数的变化，从而检测核酸靶序列。
在本文所述的方法中，除非另有说明，优选的检测器核酸包括单链靶物结合序列。所述结合序列上已经连接：i)荧光团；和ii)猝灭剂；和iii)稳定化部分。此外，在它与互补序列杂交之前，检测器核酸优选地处于这样的构象，当激发荧光团时，其允许荧光团和猝灭剂之间的供体-受体能量转移。此外，在该部分所述的每个方法中，检测荧光的变化，作为存在靶序列的指征。优选地实时检测荧光的变化。
就探针起作用而言，目前优选的核酸探针不要求核酸采取二级结构。在该方法中，除非另有说明，在该部分所述的其它方法中，检测器核酸可以假定基本上任意的分子内结合的二级结构，但是该结构优选地选自下述的成员：发夹、茎-环结构、假结体，三重螺旋和构象辅助的结构。此外，分子内碱基配对的二级结构优选地包含靶物结合序列的一部分。
在另一个方面，本发明提供了检测靶序列的扩增的方法。该方法包括，使用包含下述步骤的扩增反应：(a)使靶序列和检测器核酸杂交。检测器核酸包括单链靶物结合序列和在靶物结合序列的5′的分子内结合的二级结构。检测器序列的至少一部分形成单链尾巴，其可用于与靶序列杂交；(b)用聚合酶延伸靶序列上的杂交的检测器核酸，以生成检测器核酸延伸产物，并从靶序列分离检测器核酸延伸产物；(c)使引物与检测器核酸延伸产物杂交，并用聚合酶延伸引物，从而使分子内结合的二级结构线性化，并造成荧光参数的变化；和(d)检测荧光参数的变化，从而检测靶序列。
在另一个方面，本发明提供了确定第一种核酸和第二种核酸是否杂交的方法。在该方法中，第一种核酸是根据本发明的寡聚体(在溶液中，或结合到固体载体上)。该方法包括：(a)使第一种核酸接触第二种核酸；(b)检测选自下述的成员的荧光性质的改变：第一种核酸、第二种核酸及其组合，从而确定是否发生杂交。
在不同的实施方案中，本发明提供了探针和用于检测核酸靶序列的多态现象的方法。多态现象是指两种或多种遗传上决定的备选序列或等位基因在群体中的出现。多态标志物或部位是发生趋异的基因座。优选的标志物具有至少2个等位基因，各自在选定的群体中的发生频率大于1％，更优选大于10％或20％。多态基因座可以小至一个碱基对。多态标志物包括限制片段长度多态性、串联重复序列可变数(VNTR′s)、高变区、小卫星序列、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、和插入元件例如Alu。将第一个鉴别出的等位基因形式人为地指定为参照形式，将其它等位基因形式指定为备选或变体等位基因。在选定的群体中最频繁出现的等位基因形式有时称作野生型形式。二倍体生物可以是等位基因形式纯合的或杂合的。双等位基因多态现象具有2种形式。三等位基因多态现象具有3种形式。
在一个示例性的实施方案中，本发明的探针用于检测单核苷酸多态现象。单核苷酸多态现象发生在被单个核苷酸占据的多态部位，它是等位基因序列之间的变化部位。该部位之前和之后通常是高度保守的等位基因序列(例如，在小于1/100或1/1000的群体成员中变化的序列)。单核苷酸多态现象通常起因于一个核苷酸置换在多态部位的另一个核苷酸。转变是一个嘌呤被另一个嘌呤替换，或一个嘧啶被另一个嘧啶替换。颠换是嘌呤被嘧啶替换，或反之亦然。单核苷酸多态现象也可以源自相对于参照等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入。
可以使用携带猝灭剂和荧光团的本发明的寡聚体，或者，可以用能量转移对的单个成员(例如猝灭剂或荧光团)个别地标记一种或多种核酸。当用猝灭剂个别地标记的核酸是探针时，通过观察猝灭剂和核酸之间的相互作用，或更优选地，猝灭剂对结合到第二种核酸上的荧光团的荧光的猝灭，可以检测第一种和第二种核酸之间的相互作用。
除了它们在用于研究核酸扩增、多态现象和检测和定量的探针中的一般用途以外，本发明的固体载体和寡聚体可以用于现在已知的或以后发现的基本上任意的核酸探针形式。例如，本发明的固体载体和寡聚体可以掺入探针基序，例如TaqmanTM探针(Held等人，Genome Res.6：986-994(1996)，Holland等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：7276-7280(1991)，Lee等人，Nucleic Acids Res.21：3761-3766(1993))，分子指示标(Tyagi等人，Nature Biotechnology 14：303-308(1996)，Jayasena等人，美国专利号5,989,823，1999年11月23日授权)，蝎子探针(Whitcomb等人，Nature Biotechnology 17：804-807(1999))，日出探针(Nazarenko等人，Nucleic Acids Res.25：2516-2521(1997))，构象辅助的探针(Cook，R.，共同未决的和共同指定的美国专利申请2007/0059752，1999年6月9日提交)，基于肽核酸(PNA)的照亮探针(Kubista等人，WO 97/45539，1997年12月)，双链特异性的DNA染料(Higuchi等人，Bio/Technology 10：413-417(1992)，Wittwer等人，BioTechniques 22：130-138(1997))等。在NONISOTOPIC DNA PROBE TECHNIQUES，Academic Press，Inc.1992中，综述了可以与本发明的猝灭剂一起使用的这些和其它探针基序。
用于本发明的探针中的寡聚体可以是任意合适的大小，且优选地是在约10至约100个核苷酸、更优选约10至约80个核苷酸、更优选约20至约40个核苷酸的范围内。在双标记的(荧光团-猝灭剂)探针中，供体部分优选地与猝灭剂相隔至少约6个、优选至少约8个、优选至少约10个核苷酸，更优选相隔至少约15个核苷酸。在不同的实施方案中，供体部分优选地结合至探针的3′-或5′-末端核苷酸。猝灭剂部分也优选地结合至探针的3′-或5′-末端核苷酸。更优选地，供体和受体部分分别结合至探针的3′-和5′-或5′-和3′-末端核苷酸，尽管内部放置也是有用的。
本发明的核酸探针的精确序列和长度部分取决于它结合的靶多核苷酸的性质。对于特定的实施方案，可以改变结合位置和长度，以实现适当的退火和解链性质。关于作出这样的设计选择的指导，可以参见许多本领域公知的参考文献。
在有些实施方案中，将核酸探针的3′-末端核苷酸封闭，或使其不能被核酸聚合酶延伸。通过使供体或受体部分结合至核酸探针的末端3′-位置(直接地或通过连接物部分)，可以方便地实现这样的封闭。
核酸可以包含DNA、RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰形式。探针和靶核酸都可以作为单链、双链体、三链体等而存在。此外，可以在碱基部分、糖部分、或磷酸酯主链处用其它基团(例如放射性标记、小沟结合剂、嵌入剂、酰基不饱和的烃、氟代烷基、供体和/或受体部分等)修饰核酸。
本发明的寡聚体可以用作是离散序列的引物或含有随机序列的引物。随机序列引物的长度通常是约6或7个核单体。这样的引物可以用于多种核酸扩增方法(PCR、连接酶链式反应，等)或克隆方法。本发明的5-取代通常不会干扰寡聚体的发挥引物作用的能力。本发明的寡聚体在3′末端残基以外的部位具有2′-修饰，使寡聚体成为RNA酶H非感受态或对核酸酶稳定的其它修饰，可以有利地用作细胞提取物或含有核酸酶的其它溶液中的RNA或DNA序列的探针或引物。因而，寡聚体可以用于扩增样品中的核酸的方法中，其中将寡聚体与含有靶核酸的样品相混合，随后使寡聚体与靶核酸杂交，并通过PCR、LCR或其它合适的方法扩增靶核酸。
用诸如EDTA、DTPA或1，2-二氨基环己烷醋酸类似物等螯合剂衍生化的寡聚体，可以用于所述的不同体外诊断测定中(美国专利号4,772,548、4,707,440和4,707,352)。或者，可以用诸如5-(3-碘乙酰胺基丙-1-基)-2′-脱氧尿苷或5-(3-(4-溴丁酰胺基)丙-1-基)-2′-脱氧尿苷等交联剂衍生化本发明的寡聚体，并用于所述的不同测定方法或试剂盒中(国际公开号WO 90/14353)。
除了前面的用途以外，通过以任意合适的方法测量受试者细胞或重组系统中的表达水平，可以在体外系统中验证寡聚体的抑制基因表达的能力(Graessmann，M.，等人，Nucleic Acids Res.(1991)19：53-59)。
有利于本发明的寡聚体和靶核酸分子之间的杂交的条件，可以由本领域技术人员根据经验确定，且可以包括最适温育温度、盐浓度、寡核苷酸类似物探针的长度和碱基组成、以及样品中寡聚体和核酸分子的浓度。优选地，在有至少1毫摩尔镁存在下，且在大于6.0的pH，进行杂交。在有些实施方案中，可能必须或希望在杂交之前处理样品，以使样品中的核酸分子成为单链。这样的处理的实例包括但不限于，用碱处理(优选地随后中和)、在高温温育或用核酸酶处理。
另外，因为与核酸杂交的盐依赖性主要由杂交寡核苷酸类似物的主链的电荷密度决定，增加本发明的HypNA-pPNA寡聚体或SerNA-pPNA寡聚体中的pPNA单体的比例，可以增加杂交的盐依赖性。这可以有利地用于这样的本发明的方法中，其中在有些方面希望能通过改变盐条件来增加杂交的严谨性，例如，或通过降低盐浓度来释放杂交的核酸。在本发明的其它方面，希望在非常低的盐浓度，本发明的寡核苷酸类似物与核酸具有高亲和力结合。在该情况下，使本发明的寡核苷酸类似物中的HypNA与pPNA单体维持在接近1∶1的比例是有利的。
本发明的寡聚体的结合靶核酸分子的高度特异性允许实践人员选择杂交条件，所述杂交条件有利于辨别包含与一种或多种寡聚体的至少一部分完全互补的一段序列的核酸序列和靶核酸分子，所述靶核酸分子包含一段序列，后者在基本上互补的序列内包含小量非互补碱基。例如，可以选择杂交或洗涤温度，其允许沿着一段序列完全互补的本发明的寡聚体和靶核酸分子之间的稳定杂合体，但是促进不是完全互补的本发明的寡聚体和靶核酸分子之间的杂合体(包括含有沿着一段互补序列的一个或两个碱基错配的那些)的解离。杂交和洗涤的温度的选择，可以至少部分取决于其它条件，例如盐浓度、寡聚体和靶核酸分子的浓度、寡聚体与靶核酸分子的相对比例、要杂交的寡聚体的长度、寡聚体和靶核酸分子的碱基组成、寡核苷酸类似物分子的单体组成等。另外，当选择有利于完全互补分子的稳定杂合体且不利于错配一个或多个碱基的寡聚体和靶核酸分子之间的稳定杂合体的条件时，可以考虑其它条件，且在需要时进行改变，包括但不限于，要杂交的寡核苷酸类似物的长度、寡聚体和靶核酸分子之间的互补序列区段的长度、互补序列区段内的非互补碱基的数目、错配的碱基的身份、错配的碱基附近的碱基的身份、和任意错配的碱基在互补区段上的相对位置(参见，例如，实施例20，27，28，和29)。在使用本发明寡聚体与靶核酸分子杂交时，核酸杂交领域的技术人员能根据特定用途确定有利的杂交和洗涤条件。″有利的条件″可以是有利于至少部分地基本上互补的寡聚体和靶核酸分子(包括含有一个或多个错配的那些)之间的稳定杂合体的那些条件。
″有利的条件″可以是有利于至少部分地完全互补的寡聚体和靶核酸分子之间的稳定杂合体且不利于不完全互补的分子之间的杂合体或使其不稳定的那些条件。
使用诸如本文公开的那些方法，可以确定与不同序列的靶核酸分子杂交的本发明寡聚体的解链温度，且可以用于确定对于特定用途有利的条件。也可以根据经验确定有利的杂交条件，例如，通过使靶核酸分子与结合在固体载体上的寡聚体杂交，并检测杂交的复合物。
通过使寡聚体探针直接或间接地结合到固体载体上，可以方便地且有效地使结合在本发明的固体载体或寡聚探针上的靶核酸分子与测量群体的未结合的核酸分子分离。可以在高严谨性下洗涤固体载体，以去除没有结合寡聚体探针的核酸分子。但是，寡聚体探针与固体载体的结合不是本发明的要求。例如，在有些应用中，结合的和未结合的核酸分子可以如下分离：通过离心，穿过基质，或通过相分离，或一些通过其它分离形式(例如，示差沉淀)，其可以任选地用掺入寡聚体探针中的化学基团进行辅助(参见，例如，2000年5月9日授权给Nie等人的美国专利号6,060,242)。
核酸捕获探针
在一个实施方案中，将固定化的包含猝灭剂和稳定化部分的核酸用作捕获探针。核酸探针可以直接结合固体载体，例如通过使探针的3′-或5′-末端核苷酸结合到固体载体上。但是，更优选地，通过连接物使探针结合到固体载体上(同上)。连接物用于使探针远离固体载体。连接物最优选的长度是约5至约30个原子、更优选约10至约50个原子。
在不同的实施方案中，固体载体也用作制备寡聚体(探针)的合成载体。固体载体和核酸的第一个3′-单元之间的连接物的长度和化学稳定性在载体结合的核酸的有效合成和杂交中起重要作用。连接臂优选地足够长，以便在自动化合成过程中可以达到高产率(＞97％)。需要的连接物长度取决于使用的特定固体载体。例如，当使用高交联的聚苯乙烯作为固体载体时，6个原子的连接物通常足以在核酸的自动化合成过程中达到＞97％产率。连接臂优选地是至少20个原子长度，以便在使用CPG作为固体载体时，在自动化合成过程中达到高产率(＞97％)。
固定化在固体载体上的探针的杂交，通常要求探针与固体载体隔开至少30个原子、更优选至少50个原子。为了实现该间隔，连接物通常包括位于连接物和3′-末端之间的隔离物。对于核酸合成，连接臂通常通过酯键连接至3′-末端的3′-OH，所述酯键可以被碱性试剂切割，以使核酸脱离固体载体。
许多种连接物是本领域已知的，它们可以用于将核酸探针连接至固体载体。连接物可以用任意的化合物制成，所述化合物不会显著干扰靶序列与结合到固体载体上的探针的杂交。连接物可以用例如均聚核酸制成，所述均聚核酸可以通过自动化合成容易地添加到连接物上。或者，可以将诸如官能化的聚乙二醇等聚合物用作连接物。这样的聚合物目前优于均聚核酸，因为它们不会显著干扰探针与靶核酸的杂交。聚乙二醇是特别优选的，因为它可商业上得到、可溶于有机和水性介质、易于官能化、且在核酸合成和合成后条件下十分稳定。
在合成或在高温在碱性条件下去除碱性保护基的过程中，固体载体、连接物和探针之间的连接片段优选地不被切割。但是，这些连接可以选自在多种条件下可切割的连接。目前优选的连接的实例包括氨甲酸酯、酯和酰胺键。
样品中核酸的检测
本发明的固体载体和寡聚体可以用于检测核酸。这样的检测方法包括：提供样品，在允许寡聚体与核酸分子杂交的条件下使至少一种本发明的寡核苷酸类似物接触样品，并检测已经与一种或多种本发明的寡聚体杂交的样品中的一种或多种核酸分子。
样品可以来自任意来源，且可以是生物样品，例如来自生物体或相同或不同物种的一组生物的样品。生物样品可以是体液样品，例如，血液样品、血清样品、淋巴液样品、骨髓样品、腹水、胸水、骨盆洗液、眼液、尿、精液、痰或唾液。生物样品也可以是来自皮肤、鼻、咽喉、或生殖器拭样的提取物，或排泄物的提取物。生物样品也可以是器官或组织(包括肿瘤)的样品。生物样品也可以是细胞培养物(包括原核和真核细胞的细胞系和原代培养物)的样品。
样品可以来自环境，例如来自水体或来自土壤，或来自食物、饮料或水源、工业源、工作场所、公众区域或生活场所。样品可以是提取物，例如土壤或食物样品的液体提取物。样品可以是洗涤或浸泡或悬浮拭子所制成的溶液，所述拭子来自诸如工具等物品、服装材料、人造物或其它材料。
样品可以是未处理的或处理过的样品；处理可以包含增加样品组分的纯度、浓度或可达性的步骤，以便利样品的分析。作为非限制性实例，处理可以包括这样的步骤，其减小样品的体积，去除或分离样品的组分，溶解样品或一种或多种样品组分，或破碎、修饰、暴露、释放或分离样品的组分。这样的操作的非限制性实例是离心、沉淀、过滤、匀浆化、细胞裂解、抗体结合、细胞分离等。例如，在本发明的有些优选的实施方案中，样品是至少部分地处理过的血液样品，例如，通过去除红细胞，通过浓缩，通过选择一种或多种细胞或病毒类型(例如，白细胞或病原细胞)，或通过裂解细胞等。
示例性的样品包括至少部分地纯化的核酸分子的溶液。核酸分子可以来自单个来源或多个来源，且可以包含DNA、RNA或二者。例如，核酸分子的溶液可以是进行了任意下述步骤的样品：细胞裂解、浓缩、提取、沉淀、核酸选择(例如，多聚腺核苷酸RNA选择或包含Alu元件的DNA序列的选择)，或用一种或多种酶处理。样品也可以是包含合成的核酸分子的溶液。
本发明的寡聚体或固体载体可以是本文公开的任意寡聚体形式，或包含本文公开的单体、二聚体或非核酸组分(例如，连接物、荧光团、猝灭剂、稳定化部分)的任意寡聚体。用于本发明的方法中的寡核苷酸类似物可以具有任意长度和任意碱基组成，且可以包含一种或多种核酸部分、肽、蛋白脂类、碳水化合物、甾类、和其它生化的和化学的部分。本发明的寡核苷酸类似物可以提供在溶液中，或结合到固体载体上。在本发明的有些优选的实施方案中，寡聚体包含HypNA和pPNA残基，且可以包含比例为约2∶1至约1∶3的HypNA和pPNA残基。更优选地，在本发明的方法中使用的寡聚体包含比例为约1∶1至约1∶2的HypNA和pPNA残基。
结合的核酸的检测方法是本领域熟知的，且可以包括使用可检测的标记，其结合到或掺入测量群体的核酸分子中，或变成结合到或掺入杂交的靶核酸分子或杂交的靶核酸分子复合物中。核酸分子的可检测的标记是本领域熟知的，且包含荧光分子例如荧光团(包括本文所述的那些)、放射性同位素、质量改变的化学基团、通过信号产生分子可以检测到的特异性结合成员例如生物素等。可检测的标记也可以掺入或结合本发明的寡聚体，例如，在下述情况下：将使用信号寡聚体的夹心杂交用于检测，或使用特异性的结合成员(例如识别寡聚体/靶核酸分子复合物的抗体)进行检测。可以对固体载体进行扫描、暴露于胶片、目检等，以确定可检测的标记的存在，从而确定靶核酸分子与固定化在固体载体(例如本发明的那些)上的寡聚体的结合。
试剂盒
本发明的一个方面是试剂盒的组成，所述试剂盒可以便利如上所述的使用本发明的固体载体的合成和使用本发明的寡聚体的测定的实践。本发明的试剂盒通常包含本发明的固体载体或寡聚体，其要么作为可用于制备缀合物的化学反应物质而存在，要么作为完成的寡聚体而存在，其中所述寡聚体是特异性的结合对成员。试剂盒任选地另外包含一种或多种缓冲剂，通常作为水溶液存在。本发明的试剂盒任选地另外包含其它检测剂、用于纯化得到的标记的物质的纯化介质、发光标准物、酶、酶抑制剂、有机溶剂或用于进行本发明测定的说明书。试剂盒的其它形式是本领域技术人员显而易见的，且在本发明的范围内。
作为总结，在示例性的实施方案中，本发明提供了：
具有根据式I的结构的化合物：
Figure BPA00001258097200621
其中Xa是选自下述的稳定化部分：氟代烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基。L1、L2、L3和L4是独立地选自下述的连接物：取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。Ya是选自CRa和N的成员，其中Ra是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。Za是选自下述的成员：固体载体、ORb和NRbRb′，其中Rb和Rb′独立地选自H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。Q是荧光能量的猝灭剂，其包括选自下述的成员：
(a)至少3个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基，其中第一个所述残基通过第一个环外重氮键共价连接至第二个所述残基，且选自所述第一个残基和所述第二个残基的一个成员通过第二个重氮键共价连接至第三个残基；和
(b)至少2个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基，其中所述残基中的至少2个通过环外重氮键共价连接，条件是，至少一个所述残基是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基；
Rc是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基和共价结合核酸的含有磷的连接物。
根据前段的化合物，其中Rb是氟代烷基，且Rc是共价结合核酸的含有磷的连接物。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式(II)的结构
Figure BPA00001258097200631
其中R1、R2和R3是独立地选自下述的成员：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基；符号x、Y和Y′是独立地选自下述的成员：反应官能团和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段，条件是，X、Y和Y′中的至少一个是所述连接片段；f是0-4的整数，使得当(f x s)大于1时，Y′基团是相同的或不同的；m是0-5的整数，使得当m大于1时，X基团是相同的或不同的；n是0-6的整数，使得当(n x t)大于1时，Y基团是相同的或不同的；s是0-6的整数，使得当s大于1时，R3基团是相同的或不同的；且t是1-6的整数，使得当t大于1时，R2基团是相同的或不同的，当t是1、且s是0时，选自R1、R2及其组合的成员是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式(III)的结构：
根据前面段落中的任一段的化合物，其中选自R1、R2和R3的成员包括根据式IV的结构：
Figure BPA00001258097200633
其中R4是选自下述的成员：烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式V的结构：
Figure BPA00001258097200641
其中v是1-10的整数。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式VI的结构：
Figure BPA00001258097200642
其中R5、R6和R7是独立地选自下述的成员：-NR′R”、取代的或未取代的芳基、硝基、取代的或未取代的C1-C6烷基、和取代的或未取代的C1-C6烷氧基。R′和R”独立地选自H和取代的或未取代的C1-C6烷基。指标n是0-1的整数。指标a是0-4的整数，使得当a大于1时，R5基团是相同的或不同的。指标b是0-4的整数，使得当(v x b)大于1时，R6基团是相同的或不同的。指标c是0-5的整数，使得当c大于1时，R7基团是相同的或不同的；，且指标v是1-10的整数，使得当v大于1时，每个b苯基环上的b值是相同的或不同的。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式VI的结构：
其中X1和X2是独立地选自下述的成员：C1-C6烷基或C1-C6取代的烷基、-OH、-COOH、-NR′R″、-SH、-OP(OX3)(NRgRh)和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段，条件是，R5、R6、X1和X2中的至少一个包含所述连接片段，其中Rg和Rh是独立地选自下述的成员：H、和取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述猝灭剂具有选自下述的结构：
Figure BPA00001258097200651
其中X5和X6是独立地选自下述的成员：H、反应官能团和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段，条件是，R5和R6中的至少一个是所述连接片段。
根据前面段落中的任一段的化合物，其具有根据式VII的结构：
Figure BPA00001258097200652
Xb是选自O和S的成员。Xc是选自OR8、SR8和NR8R8a的成员。R8和R8a是独立地选自下述的成员：H，和取代的或未取代的烷基，或OR8和SR8分别选自O-M+和S-M+。M+是金属离子。R9是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、和取代的或未取代的杂芳基，和任选地通过含有磷的连接物连接的核酸。
根据前面段落中的任一段的化合物，其具有根据式VIII的结构：
Figure BPA00001258097200661
其中Q1是所述猝灭剂的片段，所述片段包含选自下述的成员：
(c)2个选自下述的部分：取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基，所述2个部分通过环外重氮键连接；和
(d)选自下述的部分：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基，且每个R12是选自芳基取代基的成员。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中Za是固体载体，且L2-Za包含根据式IX的结构：
Figure BPA00001258097200662
SS是所述固体载体。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中Xa选自嵌入剂和小沟结合剂。
根据前面段落中的任一段的化合物，其中所述核酸包含具有选自下式的碱基：
Figure BPA00001258097200663
其中R10是选自下述的成员：炔基和氟代烷基部分。
核酸，其包含至少一个碱基，所述碱基具有选自下面的式：
其中R10是选自下述的成员：炔基和氟代烷基部分；和
荧光能量的猝灭剂，其包含至少3个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，取代的或未取代的杂芳基及其组合，其中所述残基中的至少2个通过环外重氮键共价连接。
下面的实施例进一步解释了本发明的材料和方法。这些实施例用于解释、而不是限制要求保护的发明。
实施例
实施例1：BHQ1-Plus CPG的合成
根据Nelson，等人，美国专利号5,942,910(1999)，但是在Fmoc添加步骤中，使用THF、水和Na2CO3的混合物(代替DMF)，制备1-O-DMT-2-(N-Fmoc-4-氨基丁酰基-1，3-丙烷二醇1(图1)，得到1。通过柱色谱法纯化后，用乙醇中的甲胺去除1的Fmoc基团，通过与吡啶共蒸发严格去除甲胺后，将BOP活化的9-吖啶羧酸加入DMF。通过去除溶剂和柱色谱法分离得到的1-O-DMT-2-(N-羧基吖啶-4-氨基丁酰基)-1，3-丙烷二醇，2。通过从干燥的吡啶共蒸发进一步干燥后，加入二甘醇酸酐，生成1-O-DMT-2-(N-羧基吖啶-4-氨基丁酰基)-3-O-二甘醇酸酯-1，3-丙烷二醇，3，在柱色谱法后作为它的三乙胺盐分离。将3加入氨基丙基CPG，用BOP和NMM活化后，得到DMT吖啶CPG 4。用醋酸酐和n-甲基咪唑在乙腈中的混合物给CPG上的未反应的胺基团加帽(乙酰化)。通过一定量的干燥载体的脱三苯甲基化(3％DCA/DCM)和比色分析，测得CPG 4的DMT负载是45-80微摩尔/克。
根据图2，将CPG 4脱三苯甲基化(3％DCA/DCM)，洗涤，并通过与吡啶共蒸发进行干燥(流程图2)。将BHQ1 DMT酰胺化物(Cook，等人美国专利7,109,312(2006))加入脱三苯甲基化的CPG，并用0.5M乙基硫代四唑活化。2分钟后，用MeCN洗涤CPG，并用碘、吡啶和水在THF中的溶液氧化。洗涤载体5，如上进行乙酰化，然后充分洗涤和干燥。最终的DMT负载是30-50微摩尔/克。
实施例2：5′-DMTdU-5-炔基(BHQ1)3′-二异丙基氰乙基亚磷酰 胺的合成
Figure BPA00001258097200681
从5-碘尿苷6开始，在5步合成中制备化合物9。首先，用DMF中的炔丙胺三氟乙酰胺、碘化亚铜和四三苯基膦钯(0)与三乙胺进行Sonogashir偶联(JACS 2005，127，15071)，得到5-炔丙基(三氟乙酰胺)核苷酸7，在二氧化硅色谱法后的产率是37％。将核苷充分干燥，通过使用干燥的吡啶中的DMT氯化物，添加5′DMT基团，得到8，在色谱法后的产率是87％。用乙醇中的甲胺去除TFA胺保护基，得到5-炔丙胺核苷。接着，用BOP和N-甲基吗啉，将BHQ1 C3羧酸添加至胺核苷，得到5′-DMTdU-5-炔基(BHQ1)核苷11。
Figure BPA00001258097200691
通过从吡啶蒸发干燥后，用干燥的乙腈和二氯甲烷混合物中的四异丙基氰乙基亚磷酰胺和四唑，将核苷11转化成5′-DMTdU-5-炔基(BHQ1)3′-二异丙基氰乙基亚磷酰胺12。使用二氯甲烷(含有2％吡啶)中的甲醇梯度在二氧化硅柱上纯化后，得到700mg 12。使用标准的亚磷酰胺化学方法，将亚磷酰胺偶联至固定化在CPG上的5′-TTTTTTTTTT-3′。通过ESMS分析产物，表明质量为3809.5原子质量单位(计算值3808.5)。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，并向本领域技术人员暗示它们的各种修改或变化，且包含在本申请的精神和范围内，也视作在所附权利要求的范围内。在本文中引用的所有出版物、专利和专利申请，都为所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (15)

1.具有根据式I的结构的化合物：
其中
Xa是选自下述的稳定化部分：氟代烷基、取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基；
L1、L2、L3和L4是独立地选自下述的连接物：取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基；
Ya是选自CRa和N的成员，
其中
Ra是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基；
Za是选自下述的成员：固体载体、ORb和NRbRb′，
其中
Rb和Rb′独立地选自H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基；
Q是荧光能量的猝灭剂，其包括选自下述的成员：
(a)至少3个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基，其中第一个所述残基通过第一个环外重氮键共价连接至第二个所述残基，且选自所述第一个残基和所述第二个残基的成员通过第二个重氮键共价连接至第三个残基；和
(b)至少2个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基，其中所述残基中的至少2个通过环外重氮键共价连接，条件是，至少一个所述残基是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基；
Rc是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基和共价结合核酸的含有磷的连接物。
2.根据权利要求1的化合物，其中Rb是氟代烷基，且Rc是共价结合核酸的含有磷的连接物。
3.根据权利要求1的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式(II)的结构
Figure FPA00001258097100021
其中
R1、R2和R3是独立地选自下述的成员：取代的或未取代的芳基，和取代的或未取代的杂芳基；
X、Y和Y′是独立地选自下述的成员：反应官能团和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段，条件是，X、Y和Y′中的至少一个是所述连接片段；
f是0-4的整数，使得当(f x s)大于1时，Y′基团是相同的或不同的；
m是0-5的整数，使得当m大于1时，X基团是相同的或不同的；
n是0-6的整数，使得当(n x t)大于1时，Y基团是相同的或不同的；
s是0-6的整数，使得当s大于1时，R3基团是相同的或不同的；且
t是1-6的整数，使得当t大于1时，R2基团是相同的或不同的，
且当t是1、且s是0时，选自R1、R2及其组合的成员是选自下述的成员：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基。
4.根据权利要求3的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式(III)的结构：
Figure FPA00001258097100031
5.根据权利要求3的化合物，其中选自R1、R2和R3的成员包括根据式IV的结构：
Figure FPA00001258097100032
其中
R4是选自下述的成员：烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
6.根据权利要求3的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式V的结构：
Figure FPA00001258097100033
其中
v是1-10的整数。
7.根据权利要求6的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式VI的结构：
其中
R5、R6和R7是独立地选自下述的成员：-NR′R”、取代的或未取代的芳基、硝基、取代的或未取代的C1-C6烷基、和取代的或未取代的C1-C6烷氧基；
其中R′和R”独立地选自H和取代的或未取代的C1-C6烷基；
n是0-1的整数；
a是0-4的整数，使得当a大于1时，R5基团是相同的或不同的；
b是0-4的整数，使得当(v x b)大于1时，R6基团是相同的或不同的；
c是0-5的整数，使得当c大于1时，R7基团是相同的或不同的；且
v是1-10的整数，使得当v大于1时，每个b苯基环上的b值是相同的或不同的。
8.根据权利要求7的化合物，其中所述猝灭剂具有根据式VI的结构：
Figure FPA00001258097100041
其中
X1和X2是独立地选自下述的成员：C1-C6烷基或C1-C6取代的烷基、-OH、-COOH、-NR′R″、-SH、-OP(OX3)(NRgRh)和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段，条件是，R5、R6、X1和X2中的至少一个包含所述连接片段，
其中
Rg和Rh是独立地选自下述的成员：H，和取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
9.根据权利要求3的化合物，其中所述猝灭剂具有选自下述的结构：
Figure FPA00001258097100051
其中
X5和X6是独立地选自下述的成员：H、反应官能团和使所述猝灭剂共价连接至L3的连接片段，条件是，X5和X6中的至少一个是所述连接片段。
10.根据权利要求1的化合物，其具有根据式VII的结构：
Figure FPA00001258097100052
其中
v、t和s独立地选自1-10的整数；
Xb是选自下述的成员：O和S；
Xc是选自下述的成员：OR8、SR8和NR8R8a
其中
R8和R8a是独立地选自下述的成员：H，和取代的或未取代的烷基，或OR8和SR8分别选自O-M+和S-M+，
其中
M+是金属离子；
R9是选自下述的成员：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的杂烷基、取代的或未取代的芳基、和取代的或未取代的杂芳基、和任选地通过含有磷的连接物连接的核酸。
11.根据权利要求10的化合物，其具有根据式VIII的结构：
Figure FPA00001258097100061
其中
Q1是所述猝灭剂的片段，所述片段包含选自下述的成员：
(e)2个选自下述的部分：取代的或未取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基，所述2个部分通过环外重氮键连接；和
(f)选自下述的部分：取代的或未取代的多环芳基和取代的或未取代的多环杂芳基，且
每个R12是选自芳基取代基的成员。
12.根据权利要求1的化合物，其中Za是固体载体，且L2-Za包含根据式IX的结构：
Figure FPA00001258097100062
其中
u和y独立地选自1-10的整数；且
SS是所述固体载体。
13.根据权利要求1的化合物，其中Xa选自嵌入剂和小沟结合剂。
14.根据权利要求1的化合物，其中所述核酸包含具有选自下式的碱基：
Figure FPA00001258097100063
其中
R10是选自下述的成员：炔基和氟代烷基部分。
15.核酸，其包含至少一个碱基，所述碱基具有选自如下的式：
Figure FPA00001258097100071
其中
R10是选自下述的成员：炔基和氟代烷基部分；和
荧光能量的猝灭剂，其包含至少3个残基，每个残基独立地选自：取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基及其组合，其中所述残基中的至少2个通过环外重氮键共价连接。
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