ES2633786T3 - Sondas de fluoróforo atenuadoras oscuras de ácido nucleico estabilizado - Google Patents

Abstract

Uso de una sonda para la detección de un polimorfismo en secuencias objetivo de ácido nucleico, comprendiendo la sonda un oligómero de ácido nucleico que comprende una base que tiene una fórmula seleccionada de:**Fórmula** en las que R10 es una fracción alquinilo seleccionada del grupo que consiste en: etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo, 1- pentinilo, 1,3-pentadiinilo, fenil-etinilo, piridin-etinilo, pirimidin-etinilo, triazin-etinilo, tiofen-etinilo, tiazol-etinilo e imidazoletinilo; y un atenuador de energía de fluorescencia que comprende: a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo está unido covalentemente al segundo residuo a través de un primer enlace diazo exocíclico y en donde el primer o el segundo residuo está unido covalentemente al tercer residuo a través de un segundo enlace diazo; o b) al menos dos residuos, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo está unido covalentemente al segundo residuo a través de un enlace diazo exocíclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado a partir de arilo policíclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo policíclicos sustituidos o no sustituidos; en donde los grupos arilo y heteroarilo tienen de 1 a 3 anillos; y en donde dicho atenuador está unido en el extremo 3' o en el extremo 5' de dicho oligómero de ácido nucleico; en donde el oligómero contiene de 8 a 30 nucleomonómeros.

Description

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DESCRIPCION

Sondas de fluoroforo atenuadoras oscuras de acido nucleico estabilizado Campo tecnico

La solicitud se refiere en general a materiales nuevos (por ejemplo, soportes solidos y fosforamiditas) para la smtesis de acido nucleico. Los ejemplos de materiales incluyen un soporte solido y una fosforamidita con adicion de una funcion con una fraccion estabilizante. A diversos materiales se les anade una funcion tanto con una fraccion estabilizante como con un agente atenuador. La solicitud tambien proporciona monomeros y oligomeros de acido nucleico, incluyendo sondas marcadas en forma fluorescentes usando estos materiales. Tambien se proporcionan metodos de analisis y diagnostico basados en oligomeros que utilizan sondas de oligomeros de la invencion que se unen a secuencias objetivo de acido nucleico.

Antecedentes de la invencion

Las sondas de oligonucleotidos fluorescentes son herramientas importantes para el analisis genetico, tanto en investigacion como en desarrollo genomico, y en medicina clmica. Una clase particularmente util de sondas fluorescentes son las sondas auto atenuadoras, tambien conocidas como sondas de transferencia de energfa de fluorescencia, o sondas FET. Aunque el diseno de diferentes sondas usando este motivo puede variar en los detalles, las sondas FET contienen tanto un fluoroforo como un atenuador unidos a un oligonucleotido. El fluoroforo y el atenuador estan configurados para producir una senal solo como resultado de la hibridacion con un objetivo deseado. A pesar de la limitada disponibilidad de sondas FET, las tecnicas que incorporan su uso estan desplazando rapidamente a los metodos competitivos.

Se han desarrollado sondas que contienen un par atenuador de fluoroforo para ensayos de hibridacion en los que la sonda forma una estructura en horquilla, es decir, donde la sonda se hibrida con ella misma para formar un bucle de tal manera que la molecula atenuadora se pone cerca a la molecula informadora en ausencia de una secuencia complementaria de acido nucleico para evitar la formacion de la estructura en horquilla (vease, por ejemplo, el documento WO 90/03446; solicitud de patente europea No. 0 601 889 A2). Cuando esta presente una secuencia complementaria objetivo, la hibridacion de la sonda con la secuencia complementaria objetivo interrumpe la estructura de horquilla y hace que la sonda adopte una conformacion en la que la molecula atenuadora ya no esta suficientemente cerca de la molecula informadora para inactivar la molecula informadora. Como resultado, las sondas proporcionan una senal fluorescente aumentada cuando se hibridan con una secuencia objetivo que cuando no se hibridan. Las sondas que incluyen una estructura de horquilla pueden ser diffciles de disenar y pueden interferir con la hibridacion de la sonda con la secuencia objetivo.

Tambien se han desarrollado ensayos para identificar la presencia de una estructura de horquilla usando dos sondas separadas, una que contiene una molecula informadora y la otra una molecula atenuadora (vease, Meringue et al., Nucleic Acids Research, 22: 920-928 (1994)). En estos ensayos, la senal de fluorescencia de la molecula informadora disminuye cuando se hibrida con la secuencia objetivo debido a que la molecula atenuadora se pone en proximidad con la molecula informadora.

Una aplicacion particularmente importante para sondas incluyendo un par de moleculas informadora-atenuadora es su uso en reacciones de amplificacion de acido nucleico, tales como reacciones en cadena de polimerasa (PCR), para detectar la presencia y amplificacion de una secuencia de acido nucleico objetivo. En general, las tecnicas de amplificacion de acido nucleico han abierto nuevos enfoques amplios para pruebas geneticas y analisis de ADN (vease, por ejemplo, Arnheim et al., Ann. Rev. Biochem., 61: 131-156 (1992)). La PCR, en particular, se ha convertido en una herramienta de investigacion de gran importancia con aplicaciones, por ejemplo, en clonacion, analisis de expresion genetica, secuenciacion de ADN, mapeo genetico y descubrimiento de farmacos (vease, Arnheim et al. citado anteriormente, Gilliland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 2725-2729 (1990), Bevan et al., PCR Methods and Applications, 1: 222-228 (1992), Green et al., PCR Methods and Applications, 1: 77-90 (1991), Blackwell et al., Science, 250: 1104-1110 (1990)).

Los metodos comunmente utilizados para detectar productos de amplificacion de acido nucleico requieren que el producto amplificado se separe de los cebadores no reaccionados. Esto se logra tfpicamente ya sea mediante el uso de electroforesis en gel, que separa el producto de amplificacion de los cebadores sobre la base de un diferencial de tamano, o mediante la inmovilizacion del producto, permitiendo que el cebador libre sea eliminado por lavado. Sin embargo, se han descrito tres metodos para supervisar el proceso de amplificacion sin separacion previa de cebador. Todos ellos estan basados en FRET, y ninguno de ellos detecta el producto amplificado directamente. En su lugar, los tres metodos detectan algun evento relacionado con la amplificacion. Por esa razon, estan acompanados de problemas de alto nivel y no son cuantitativos, como se discute a continuacion.

Un metodo, descrito en Wang et al. (patente estadounidense No. 5.348.853, Wang et al., Anal. Chem., 67: 1197-1203 (1995)), utiliza un sistema de transferencia de energfa en el que se produce transferencia de energfa entre dos fluoroforos en la sonda. En este metodo, la deteccion de la molecula amplificada tiene lugar en el recipiente de reaccion de amplificacion, sin necesidad de una etapa de separacion. Este metodo, sin embargo, no detecta el producto amplificado, sino que detecta la disociacion del cebador del oligonucleotido "absorbente de energfa". Por lo tanto, este

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metodo depende de la deteccion de una disminucion de las emisiones; se debe utilizar una parte significativa del cebador marcado con el fin de lograr una diferencia confiable entre las senales antes y despues de la reaccion. El documento WO0186001 describe atenuadores oscuros para la transferencia de energfa donante-aceptor.

Un segundo metodo que detecta un producto de amplificacion sin separacion previa del cebador y del producto es el ensayo de PCR de 5'-nucleasa (tambien denominado ensayo TaqManMR) (Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7276-7280 (1991), Lee et al., Nucleic Acids Res., 21: 3761-3766 (1993)). Este ensayo detecta la acumulacion de un producto de PCR espedfico por hibridacion y escision de una sonda fluorogenica doblemente marcada (la sonda "TaqMan") durante la reaccion de amplificacion. La sonda fluorogenica consiste en un oligonucleotido marcado tanto con un colorante indicador fluorescente como con un colorante de atenuacion. Durante la PCR, esta sonda se escinde por la actividad 5'-exonucleasa de la ADN polimerasa si, y solo si, hibrida con el segmento que se esta amplificando. La escision de la sonda genera un aumento en la intensidad de fluorescencia del colorante indicador.

En el ensayo TaqMan, el donante y el atenuador estan preferiblemente situados en los extremos 3' y 5' de la sonda, debido a que el requisito de que la hidrolisis 5'-3' se lleva a cabo entre el fluoroforo y el atenuador puede cumplirse solo cuando estas dos fracciones no estan demasiado proximas entre sf (Lyamichev et al., Science, 260: 778-783 (1993). Este requisito es un serio inconveniente del ensayo ya que la eficiencia de la transferencia de energfa disminuye con la sexta potencia inversa de la distancia entre en informador y el atenuador. Por lo tanto, si el atenuador no esta lo suficientemente cerca del informador para lograr la atenuacion mas eficiente, las emisiones de fondo de la sonda no hibrida pueden ser bastante altas.

Todavfa otro metodo para detectar productos de amplificacion que se basa en el uso de transferencia de energfa es el metodo de "sonda baliza" descrito por Tyagi et al. (Nature Biotech., 14: 303-309 (1996)) que es tambien el tema de las patentes estadounidenses Nos. 5.119.801 y 5.312.728 de Lizardi et al. Este metodo emplea sondas de hibridacion de oligonucleotidos que pueden formar estructuras de horquilla. En un extremo de la sonda de hibridacion (ya sea el extremo 5' o 3') hay un fluoroforo donante, y en el otro extremo, una fraccion aceptora. En este metodo, la fraccion aceptora es un atenuador, que absorbe energfa del donante. Por lo tanto, cuando la baliza esta en conformacion abierta, la fluorescencia del fluoroforo donante es detectable, mientras que cuando la baliza esta en conformacion de horquilla (cerrada), la fluorescencia del fluoroforo donante se atenua. Cuando se emplea en PCR, la sonda de baliza molecular, que hibrida con una de las cadenas del producto de PCR, esta en "conformacion abierta" y se detecta fluorescencia, mientras que la que permanece sin hibridar no fluoresce. Como resultado, la cantidad de fluorescencia aumentara a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR y, por lo tanto, se puede usar como una medida del progreso de la PCR.

Debido a que este metodo se basa en la hibridacion de la sonda con una region plantilla entre las secuencias de cebadores, tiene una serie de problemas asociados con ella. Por ejemplo, es improbable que las sondas de baliza hibriden cuantitativamente con una cadena del producto de PCR bicatenario, especialmente cuando el producto de amplificacion es mucho mas largo que la sonda de baliza.

Limitaciones adicionales han impedido tambien la aplicacion y el uso de sondas FET. En primer lugar, los disenos de sonda actualmente disponibles tienen un fondo de ruido fluorescente superior al deseado. En algunos casos esto se debe a la dificultad de purificar la sonda que debe purgarse rigurosamente de cualquier subproducto fluorescente espurio. Como resultado, las sondas deben someterse a al menos 2 niveles de purificacion antes de que sean aceptables. Este factor de trabajo trae como resultado un costo de sonda muy alto, aproximadamente $ 300- $ 600 por sonda. Una segunda limitacion fundamental es el ruido inherente de la propia sonda, que es el resultado de la geometna ffsica de la sonda, que impone restricciones a la interaccion fluoroforo y atenuador.

Mas recientemente, se ha mostrado que los oligonucleotidos se unen de una manera espedfica de la secuencia al ADN duplex para formar triplex. El acido nucleico monocatenario, principalmente el ARN, es la molecula objetivo para los oligonucleotidos que se usan para inhibir la expresion genica mediante un mecanismo "antisentido" (Uhlmann, E., et al., Chem Reviews (1990) 90: 543-584; van Der Krol, AR, et al., Biotechniques (1988) 6: 958-976). Los oligonucleotidos antisentido se postulan para ejercer un efecto sobre la expresion genica objetivo mediante la hibridacion con una secuencia de ARN complementaria. En este modelo, el duplex tubrido de ARN-oligonucleotido interfiere con uno o mas aspectos del metabolismo de ARN incluyendo procesamiento, traduccion y rotacion metabolica. Se han utilizado oligonucleotidos modificados qmmicamente para mejorar su estabilidad a una nucleasa.

El ADN duplex puede ser reconocido espedficamente por oligomeros basados en una secuencia nucleomonomera reconocible. Los ejemplos de reglas de reconocimiento son descritos por Maher III, L. J. et al., Science (1989) 245: 725730; Moser, H. E., et al., Science (1987) 238: 645-650; Beal, P. A., et al., Science (1992) 251: 1360-1363; Cooney, M., et al., Science (1988) 241: 456-459; y Hogan, M. E., et al., publicacion EP No. 375408.

El direccionamiento espedfico de secuencias de ambas secuencias objetivo monocatenarias y duplex tiene aplicaciones en diagnostico, analisis y terapia. Bajo algunas circunstancias en las que se ha de efectuar dicha union, es ventajoso estabilizar el duplex o triplex resultante durante largos penodos de tiempo.

El uso de complejos de triple helice (o triplex) como un medio para la inhibicion de la expresion de la expresion genica objetivo se presento previamente (solicitud internacional No. PCT/LTS89/05769). Se ha demostrado que las estructuras

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de triple helice interfieren con la expresion genica objetivo (solicitud internacional No. PCT/US91/09321, Young, SL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88: 10023-10026), demostrando la factibilidad de este enfoque.

La solicitud de patente europea No. 92103712.3, Rahim, SG, et al (Antiviral Chem. Chem. (1992) 3: 293-297) y la solicitud internacional No. PCT/SE91/00653 describen nucleomonomeros de pirimidina que tienen un grupo insaturado en la posicion 5. Entre los derivados descritos estan los grupos 5-propinilo y 5-etinilo.

Se ha descrito la smtesis de nucleomonomeros que tienen grupos alquilo insaturados en la posicion 5 de uracilo (DeClercq, E., et al., J. Med. Chem. (1983) 26: 661-666; Goodchild, J., et al., J. Med. Chem. (1983) 26: 1252-1257). Se han descrito oligomeros que contienen pirimidinas modificadas con 5-propinilo (Froehler, B.C., et al., Tetrahedron Letters (1992) 33: 5307-5310).

Se ha descrito la conversion de 5-propinil-2'-desoxiuridina, 5-butinil-2'-desoxiuridina y compuestos relacionados al 5'- trifosfato seguida de la incorporacion del monomero en oligomeros mediante la polimerasa de E. coli (Valko, K. et al., J. Liquid Chromatog (1989) 12: 2103-2116, Valko, K. et al., J. Chromatog. (1990) 506: 35-44). Estos estudios se llevaron a cabo como una estructura para el analisis de actividad de analogos de nucleotidos que tienen una serie de sustituciones en la posicion 5 del uracilo. La actividad de los analogos de nucleotidos como sustratos para la polimerasa de E. coli se examino y correlaciono con caracteristicas tales como la hidrofobicidad del monomero. No se presento informacion sobre las propiedades de los oligomeros que contienen los analogos.

Los oligomeros que tienen mayor afinidad por secuencias de acido nucleico objetivo complementarias tendrian propiedades mejoradas para aplicaciones de diagnostico, aplicaciones terapeuticas y reactivos de investigacion. Ademas, existe en la tecnica la necesidad de sondas mejoradas para detectar acidos nucleicos (por ejemplo, productos de amplificacion) en forma rapida, sensible, confiable y cuantitativa. Las sondas ideales darian lugar a una minima senal de fondo y serian preparadas facil y economicamente. De manera bastante sorprendente, la presente invencion proporciona tales sondas. Las sondas FET y FRET oligomericas de la presente invencion tienen afinidad de union mejorada para secuencias objetivo bicatenarias y/o monocatenarias.

Breve descripcion de las figuras

La FIGURA 1 es un esquema que muestra un ejemplo de preparacion de un soporte solido de la invencion con la inclusion de una fraccion estabilizante.

La FIGURA 2 es un esquema que muestra un ejemplo de preparacion de un soporte solido de la invencion sometido a derivacion con fracciones funcionales.

Sumario de la invencion

De acuerdo con un primer aspecto, la invencion proporciona el uso de una sonda para la deteccion de un polimorfismo en secuencias objetivo de acido nucleico, comprendiendo la sonda un oligomero de acido nucleico que comprende una base que tiene una formula seleccionada entre:

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en donde R10 es una fraccion alquinilo seleccionada del grupo que consiste en: etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo, 1-pentinilo,

1,3-pentadiinilo, fenil-etinilo, piridin-etinilo, pirimidin-etinilo, triazina-etinilo, tiofen-etinilo, tiazol-etinilo e imidazol-etinilo; y

un atenuador de energia de fluorescencia que comprende:

a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un primer enlace diazo exodclico y en donde el primer o el segundo residuo esta unido covalentemente al tercer residuo a traves de un segundo enlace diazo; o

b) al menos dos fracciones, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un enlace diazo exodclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado a partir de arilo polidclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo polidclicos sustituidos o no sustituidos; en donde los grupos arilo y heteroarilo tienen de 1 a 3 anillos; y

en donde dicho atenuador esta unido en el extremo 3' o en el extremo 5' de dicho oligomero de acido nucleico; en donde el oligomero contiene de 8 a 30 nucleomonomeros.

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En la presente memoria se describe una nueva clase de fosforamiditas y soportes solidos para la smtesis de oligomeros de acido nucleico modificados y sondas de acidos nucleicos (por ejemplo, oligomeros, por ejemplo, oligonucleotidos) de un formato convenientemente sintetizado usando las fosforamiditas o sobre los nuevos soportes. Ejemplos de soportes solidos incluyen al menos un atenuador unido a traves de en enlazador al soporte solido. Aqu se describe un soporte solido o una fraccion con inclusion de fosforamidita que estabiliza un agregado duplex, triplex o de orden superior (por ejemplo, hibridacion) del oligomero con un acido nucleico objetivo. Los ejemplos de componentes del soporte solido (y los oligomeros) incluyen fracciones que estabilizan la hibridacion de acidos nucleicos, por ejemplo, intercaladores, fracciones de union al surco menor, bases modificadas con una fraccion estabilizante (por ejemplo, fracciones alquinilo y fracciones fluoroalquilo), y fracciones estabilizantes conformacionales, tales como las descritas en la publication de la solicitud de patente estadounidense No. 2007/0059752. Los ejemplos de oligomeros sintetizados sobre los soportes solidos o usando las fosforamiditas incluyen un agente atenuador y una fraccion estabilizante. Varios oligomeros tambien incluyen un fluoroforo y, opcionalmente, uno o mas fracciones detectables adicionales, una fraccion estabilizadora o atenuadora.

En la presente invention se describe un atenuador unido al soporte solido, la fosforamidita o el oligomero es un miembro de una clase de atenuadores en los que un primer arilo sustituido o no sustituido o la primera fraccion heteroarilo sustituida o no sustituida esta unida a un segundo arilo sustituido o no sustituido o a una segunda fraccion heteroarilo sustituida o no sustituida a traves de un enlace diazo exoticlico. En un ejemplo de realization, los atenuadores son esencialmente no fluorescentes ("atenuadores oscuros") y son opcionalmente miembros de una clase de compuestos denominados "Black Hole QuenchersMR" ("BHQ"), que se describen en la patente estadounidense No. 7.109.301, de propiedad comun. Los soportes solidos, fosforamiditas y oligomeros con inclusion de estos atenuadores tambien pueden unirse a uno o mas componentes conjugados, generalmente conjugados covalentemente con la base o azucar de la fosforamidita de acido nucleico, soporte solido u oligomero a traves de un enlazador. Un ejemplo de componente conjugado es un ligante de surco menor, un intercalador, una fraccion de estabilizacion de hibridacion de fluorocarbono, una fraccion estabilizadora de hibridacion de alquinilo (colectivamente, "fracciones estabilizadoras"), un fluoroforo y un atenuador de energia fluorescente.

En la presente memoria se describen soportes solidos y fosforamiditas apropiados para sintetizar sondas oligomericas de acido nucleico que incluyen una fraccion estabilizante, un atenuador y/o un fluoroforo. Tambien se proporcionan sondas de un formato fabricado convenientemente sobre tal soporte solido o usando tal fosforamidita. Los ejemplos de sondas de acido nucleico oligomericas de la invencion se caracterizan por la interaction entre un atenuador y un fluoroforo, conjugados cada uno con el oligomero con el fin de minimizar la fluorescencia de la sonda en ausencia de su interaccion con un objetivo (por ejemplo, hibridacion con un acido nucleico al menos parcialmente complementario a la secuencia objetivo).

En muchas sondas de acido nucleico marcadas doblemente, la interaccion entre el fluoroforo y el atenuador se produce utilizando una secuencia de sonda de acido nucleico que forma una estructura secundaria (por ejemplo, horquilla, bucle, etc.). Se requiere que una sonda adopte una estructura secundaria que complica significativamente el diseno de la sonda y restringe en gran medida las secuencias de acido nucleico que pueden usarse como componentes de las sondas. Por el contrario, los ejemplos de sondas oligomericas de acido nucleico de la invencion facilitan la interaccion entre el atenuador y el fluoroforo sin requerir la formation concomitante de una estructura secundaria de acido nucleico, permitiendo asi que se use una mayor diversidad de secuencias de acido nucleico como componentes de sondas fluorescentes. En diversas realizaciones, estas sondas incluyen uno o mas atenuadores oscuros (por ejemplo, Black Hole Quencher) como se define aqui.

Ademas, al variar el numero y la identidad de los miembros del sistema diazo-(hetero)arilo conjugado de los atenuadores usados en la presente invencion, las propiedades espectrales (por ejemplo, la absorbancia) del atenuador pueden "ajustarse" para que coincidan las caracteristicas espectrales (por ejemplo, la emision) de uno o mas fluoroforos. Esta caracteristica proporciona sondas oligomericas de la invencion seleccionables para tener una amplia gama de maximos de absorbancia. Por consiguiente, las sondas oligomericas de la invencion son adecuadas para su uso en aplicaciones de multiplexacion. Ademas, en la presente memoria se describen soportes solidos y sondas utiles en aplicaciones de multiplexacion que utilizan uno o mas fluoroforos distintos en combination con uno o mas atenuadores, ampliando de este modo las opciones de pares donador-aceptor que pueden incorporarse en las sondas oligomericas. Por consiguiente, al menos 2, al menos 3, al menos 4 sondas oligomericas, cada una de las cuales esta incluye un atenuador que tiene una propiedad espectral diferenciable de la misma propiedad del atenuador en las otras sondas (por ejemplo, longitud de onda de emision).

En la presente invencion se describe un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Formula I:

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L3—Q ORc

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en donde Xa es una fraccion estabilizante seleccionada de fluoroalquilo, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo

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sustituido o no sustituido. En diversas realizaciones, Xa es un aglutinante del surco menor o un agente de intercalacion.

Los s^bolos L1, L2, L3 y L4 representan enlazadores. Los enlazadores se seleccionan independientemente entre un enlace covalente sencillo, alquilo sustituido o no sustituido y fracciones heteroalquilo sustituidas o no sustituidas. Ya es un miembro seleccionado de CRa, y N en el que Ra es un miembro seleccionado de H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido. Ra es opcionalmente un enlazador de un componente funcional.

El sfmbolo Za representa un soporte solido, ORb o NRbRb' en el que Rb y Rb' son miembros seleccionados independientemente de H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido. El sfmbolo Rc representa un miembro seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido y un enlazador que contiene fosforo unido covalentemente a un acido nucleico. En un ejemplo de realizacion, Rc es un grupo protector de acido nucleico, por ejemplo, dimetoxitritilo ("DMT"). En otra realizacion, Rc es un enlazador de fosfodiester a otra fraccion de acido nucleico, que opcionalmente se somete a derivacion con uno o mas componentes funcionales.

Los compuestos descritos aqrn incluyen un atenuador de energfa de fluorescencia. El atenuador esta representado por el sfmbolo Q y, en ejemplos de realizaciones, incluye una o mas de las siguientes caractensticas estructurales:

(a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un primer enlace diazo exodclico. El primer o el segundo residuo esta unido covalentemente a un tercer residuo a traves de un segundo enlace diazo; y

(b) al menos dos residuos, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido. El primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un enlace diazo exodclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado entre arilo polidclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo polidclicos sustituidos o no sustituidos.

Los atenuadores estan unidos al resto del compuesto a traves de en enlazador. El atenuador y el enlazador se acoplan por reaccion de un grupo funcional reactivo sobre un atenuador precursor y un grupo funcional reactivo sobre el enlazador. Los dos grupos funcionales reactivos son de reactividad complementaria y despues de la reaccion forman un fragmento de enlace tal como se define en la presente memoria.

Otros objetos, ventajas y aspectos de la presente invencion seran evidentes a partir de la descripcion detallada a continuacion.

Descripcion detallada de la invencion Abreviaturas

"BHQ", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere generalmente a atenuadores oscuros que incluyen uno o mas enlaces diazo y espedficamente a "Black Hole QuenchersMR". Los ejemplos de BHQ de uso en la presente invencion se describen en la patente de Estados Unidos No. "FET", como se usa en la presente memoria, se refiere a "transferencia de energfa de fluorescencia". "FRET", como se usa en la presente invencion, se refiere a "transferencia de energfa de resonancia de florescencia". Estos terminos se usan aqrn para referirse tanto a procesos de transferencia de energfa radiactiva como no radiactiva. Por ejemplo, los procesos en los que se emite un foton y los que implican transferencia de electrones de largo alcance estan incluidos dentro de estos terminos. A lo largo de esta memoria descriptiva, ambos fenomenos se resumen bajo el termino general "transferencia de energfa donador-aceptor". "SNP" se refiere a "polimorfismo de nucleotido unico".

Definiciones

Las siguientes definiciones son ampliamente aplicables a cada una de las realizaciones de la presente invencion expuestas a continuacion. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria general tienen generalmente el mismo significado que comunmente entiende un experto en la tecnica al que pertenece esta invencion. Generalmente, la nomenclatura utilizada aqrn y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genetica molecular, qmmica organica y qmmica de acidos nucleicos e hibridacion descritos a continuacion son los bien conocidos y comunmente empleados en la tecnica. Se usan tecnicas estandar para smtesis de acidos nucleicos y peptidos. Las tecnicas y procedimientos biologicos moleculares se llevan a cabo generalmente de acuerdo con metodos convencionales en la tecnica y varias referencias generales (vease generalmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, que se incorpora aqrn como referencia). La nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio en qmmica analttica y smtesis organica son bien conocidos y comunmente empleados en la tecnica. Las tecnicas estandar, o modificaciones de las mismas, se utilizan para smtesis qmmicas y analisis qmmicos.

El termino "alquilo", por sf mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada, o dclico, o combinacion de los mismos, que puede ser completamente saturado, mono o poliinsaturado y pueden incluir radicales mono, di, tri y tetravalentes, teniendo el

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numero de atomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa uno a diez carbonos). Ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homologos e isomeros de, por ejemplo, n- pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o mas dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2- isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homologos e isomeros superiores. El termino "alquilo", a menos que se indique lo contrario, tambien incluye opcionalmente los derivados de alquilo definidos mas detalladamente a continuacion, tales como "heteroalquilo". Los grupos alquilo que estan limitados a grupos hidrocarbonados se denominan "homoalquilo". El termino "alquilo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a fracciones alquilo, alquenilo y alquinilo, cada una de los cuales pueden ser especies mono, di o polivalentes segun sea apropiado para satisfacer los requisitos de Valencia. Los grupos alquilo estan opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con uno o mas grupos denominados aqrn como un "sustituyente del grupo alquilo".

El termino "alquileno" por sf mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de una fraccion alquilo, como se ejemplifica, pero no se limita, por -CH2CH2CH2CH2-, e incluye ademas los grupos descritos a continuacion como "heteroalquileno". Tfpicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendra de 1 a 24 atomos de carbono, siendo preferidos en la presente invencion aquellos grupos que tienen 10 o menos atomos de carbono. Para los grupos enlazantes alquileno y heteroalquileno, es opcional que no este implicada ninguna orientacion del grupo enlazador por la direccion en la que se escribe la formula del grupo enlazador. Por ejemplo, la formula -C(O)2R' representa -C(O)2R'- y, opcionalmente, -R'C(O)2-. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena mas corta, que generalmente tiene ocho, siete, seis, cinco o menos atomos de carbono.

Los terminos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molecula a traves de un atomo de oxfgeno, un grupo amino o un atomo de azufre, respectivamente.

El termino "heteroalquilo", por sf mismo o en combinacion con otro termino, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical alquilo de cadena lineal o ramificada estable o dclico que consiste en el numero indicado de atomos de carbono y al menos un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en B, O, N, Si y S, donde el heteroatomo puede estar opcionalmente oxidado y el atomo de nitrogeno puede estar opcionalmente cuaternizado. El o los heteroatomos pueden colocarse en cualquier posicion interna del grupo heteroalquilo o en un extremo de la cadena, por ejemplo, la posicion a traves de la cual el grupo alquilo esta unido al resto de la molecula. Ejemplos de grupos "heteroalquilo" incluyen, pero sin limitacion, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2- CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N(CH3)- CH3. Dos o mas heteroatomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. De forma similar, el termino "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente se refiere a un radical heteroalquilo divalente sustituido o no sustituido, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2- S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroatomos tambien pueden ocupar uno o ambos de los extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, y similares).

Los terminos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por si solos o en combinacion con otros terminos, representan, a menos que se indique lo contrario, versiones dclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroatomo puede ocupar la posicion en la que el heterociclo esta unido al resto de la molecula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3- ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1-(1,2,5,6- tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo,

tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares.

Los terminos "halo" o "halogeno", por si mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un atomo de fluor, cloro, bromo o yodo. Adicionalmente, terminos tales como "haloalquilo", significa que incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el termino "halo-alquilo (C1-C4)" pretende incluir, pero no se limita a, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.

El termino "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente poliinsaturado, aromatico, que puede ser un solo anillo o multiples anillos (preferiblemente de 1 a 3 anillos, uno o mas de los cuales es opcionalmente un cicloalquilo o heterocicloalquilo), que estan fusionados entre si o enlazados covalentemente. El termino "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroatomos seleccionados entre N, O y S, en donde los atomos de nitrogeno y azufre estan opcionalmente oxidados y el atomo o atomos de nitrogeno estan opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede estar unido al resto de la molecula a traves de un heteroatomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3- pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4- isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4- piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2 - quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos arilo y heteroarilo anotados anteriormente se seleccionan del grupo de "sustituyentes del grupo arilo" que se describen a continuacion.

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Por brevedad, el termino "arilo" cuando se usa en combinacion con otros terminos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye opcionalmente anillos homoarilo y heteroarilo como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, el termino arilalquilo incluye opcionalmente aquellos radicales en los que un grupo arilo esta unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares) incluyendo aquellos grupos alquilo en los que un atomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) ha sido sustituido, por ejemplo, por un atomo de oxfgeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2- piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo y similares).

Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos aquellos grupos a los que se hace referencia frecuentemente como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) se denominan genericamente como "sustituyentes del grupo alquilo" y pueden ser uno o mas de una variedad de grupos seleccionados entre, pero sin limitarse a: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', - halogeno, -SiR'R"Rm, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"Rm)=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 en un numero que va de cero a (2m' + 1), donde m' es el numero total de atomos de carbono en tal radical. R', R'', R''' y R"" preferiblemente cada uno independientemente se refieren a hidrogeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halogenos, alquilo, alcoxi o alquilo sustituido o no sustituido, grupos tioalcoxi o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invencion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como grupos R', R'', R''' y R'''' cuando esta presente mas de uno de estos grupos. Cuando R' y R'' estan unidos al mismo atomo de nitrogeno, pueden combinarse con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, se pretende que NR'R" incluya, pero no se limite a, 1- pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusion anterior de sustituyentes, el experto en la tecnica comprendera que el termino "alquilo" incluye grupos con atomos de carbono unidos a grupos distintos de hidrogeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares). Los ejemplos de sustituyentes del grupo alquilo incluyen aquellos grupos denominados aqrn como "grupos funcionales reactivos" y "fragmentos de enlace". En diversas realizaciones, el sustituyente del grupo alquilo es una fraccion que contiene fosforo, por ejemplo, un fosfodiester o una modificacion de fosfodiester tal como las descritas en la presente memoria.

Similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se denominan genericamente como "sustituyentes del grupo arilo". Los ejemplos de sustituyentes se seleccionan de la lista de sustituyentes del grupo alquilo y otros, por ejemplo: halogeno, -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R''', - OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R''', -NR"C(O)2R', -NR-

C(NR'R"R''')=NR'''', -NR-C(NR'R")=NR'', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro-alcoxi(Ci-C4), y fluoroalquilo C1-C4, en un numero que va desde cero hasta el numero total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromaticos; y donde R', R'', R''' y R'''' se seleccionan preferiblemente independientemente entre hidrogeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la invencion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada uno de R', R'', R''' y R'''' cuando mas de uno de estos grupos esta presente.

Dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente con un sustituyente de la formula -TC(O)-(CRR')q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace sencillo, y q es un numero entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente de la formula -A-(CH2)r-B-, donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- o un enlace sencillo, y r es un numero entero de 1 a 4. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo asf formado puede ser sustituido opcionalmente por un doble enlace. Alternativamente, dos de los sustituyentes en los atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente con un sustituyente de la formula -(CRR')s-X-(CR'R''')d-, donde s y d son independientemente enteros de 0 a 3 y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R'' y R''' se seleccionan preferiblemente independientemente entre hidrogeno o alquilo (C1-C16) sustituido o no sustituido. Ejemplos de sustituyentes de grupos arilo incluyen aquellos grupos denominados aqrn como "grupos funcionales reactivos" y "fragmentos de enlace".

Tal como se usa en la presente memoria, el termino "heteroatomo" incluye oxfgeno (O), nitrogeno (N), azufre (S) y silicio (Si).

El sfmbolo "R" es una abreviatura general que representa un grupo sustituyente que se selecciona de H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido y grupos heterociclilo sustituidos o no sustituidos. R tambien puede referirse a sustituyentes del grupo alquilo y sustituyentes del grupo arilo.

El termino "sal(es)" incluye sales de los compuestos que se preparan con acidos o bases relativamente no toxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en el presente documento. Cuando los compuestos de la presente invencion contienen funciones relativamente acidas, se pueden obtener sales de adicion de bases poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, bien sea pura o en un disolvente inerte adecuado. Ejemplos de sales de adicion de bases incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino organico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos de la presente invencion contienen funciones relativamente basicas, se pueden obtener sales de adicion de acido poniendo en

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contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del acido deseado, ya sea puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adicion de acido incluyen los derivados de acidos inorganicos tales como los acidos clorlddrico, bromlddrico, nftrico, carbonico, monohidrogenocarbonico, fosforico, monohidrogenofosforico, dihidrogenofosforico, sulfurico, monohidrogenosulfurico, hidndrico o fosforoso y similares, as^ como las sales derivadas de acidos organicos relativamente no toxicos tales como acetico, propionico, isobutrnco, butmco, maleico, malico, malonico, benzoico, sucdnico, suberico, fumarico, lactico, mandelico, ftalico, bencenosulfonico, p-tolilsulfonico, dtrico, tartarico, metanosulfonico y similares. Tambien se incluyen sales de aminoacidos tales como arginato y similares y sales de acidos organicos tales como los acidos glucuronico o galacturomco y similares (vease, por ejemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66: 1-19 (1977)). Ciertos compuestos espedficos de la presente invencion contienen tanto funciones basicas como acidas que permiten que los compuestos sean convertidos tanto en sales de adicion basica como acida. Tambien se incluyen los hidratos de las sales.

Tal como se usa en la presente memoria, "acido nucleico" significa nucleosidos, nucleotidos y oligonucleotidos, por ejemplo, ADN, ARN, ya sea monocatenario, bicatenario, o en motivos de hibridacion mas altamente agregados, y cualquier modificacion qrnmica de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas que proporcionan grupos qmmicos que incorporan carga adicional, capacidad de polarizacion, enlace de hidrogeno, interaccion electrostatica y fluxionalidad a las bases de ligando de acido nucleico o al ligando de acido nucleico en conjunto. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acidos peptidonucleicos (PNA), modificaciones del grupo fosfodiester (por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos), modificaciones de azucar, modificaciones de pirimidina en posicion 5, modificaciones de purina en posicion 8, modificaciones en aminas exodclicas, sustitucion de 4-tiouridina, sustitucion de 5-bromo o 5-yodo-uracilo; modificaciones en la cadena principal, metilaciones (por ejemplo, 5' y/o 3'), combinaciones inusuales de apareamiento de bases tales como las isobases, isocitidina e isoguanidina y similares. Los acidos nucleicos tambien pueden incluir bases no naturales. Un "nucleomonomero" se refiere a una unidad unica de acido nucleico, que puede ser un nucleosido, un nucleotido o una modificacion de los mismos.

"Base", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye las fracciones que contienen no solo los heterociclos de purina y pirimidina conocidos y las pirimidinas de la invencion, sino tambien analogos de heterociclo y tautomeros de los mismos. Las purinas incluyen adenina, guanina y xantina y ejemplos de analogos de purina incluyen 8-oxo-N6- metiladenina y 7-deazaxantina. Las pirimidinas incluyen uracilo y citosina y sus analogos tales como 5-metilcitosina, 5- metiluracilo y 4,4-etanocitosina. Este termino tambien abarca bases no naturales. Las bases no naturales representativas incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4- acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo,

dihidrouracilo beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-

dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5- metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, acido uracil-5-oxiacetico (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico del acido uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, nitroindol y 2,6- diaminopurina.

En diversas realizaciones, los compuestos de la invencion incluyen pirimidinas que forman un derivado en la posicion 5. Los derivados son modificaciones de 1-alquenil-, 1-alquinil-, y 1-alquinil-heteroaromatico. "1-Alquenil" significa un grupo adclico olefrnicamente insaturado (que contiene doble enlace). "1-Alquinil" significa un grupo adlico acetilenicamente insaturado (que contiene un triple enlace)

Como se usa en la presente memoria, "nucleosido" significa un subconjunto de acido nucleico en el que una base esta unida covalentemente a un azucar o analogo de azucar y que opcionalmente incluye un fosfito, fosforamidita o fosfina. El termino nucleosido incluye ribonucleosidos, desoxirribonucleosidos, o cualquier otro nucleosido que sea un N- glicosido o C-glicosido de una base. La estereoqmmica de los carbonos del azucar puede ser distinta de aquella de la D-ribosa. Los nucleosidos tambien incluyen aquellas especies que contienen modificaciones de la fraccion azucar, por ejemplo, en las que se reemplazan uno o mas de los grupos hidroxilo por un halogeno, un heteroatomo, un grupo alifatico, o son incluyen funciones tales como eteres, aminas, tioles y similares. La fraccion pentosa puede ser reemplazada por una hexosa o una estructura alternativa tal como un anillo ciclopentano, un anillo morfolino de 6 miembros y similares. Los nucleosidos como se definen aqrn tambien incluyen una base unida a un aminoacido y/o un analogo de aminoacido que tiene un grupo carboxilo libre y/o un grupo amino libre y/o formas protegidas de los mismos. Los nucleosidos tambien incluyen opcionalmente una o mas modificaciones de bases, por ejemplo, modificadas con una fraccion fluorocarbilo, alquenilo o alquinilo. Un nucleosido que incluye un fosfodiester o una modificacion fosfodiester, se denomina aqrn nucleotido.

"Modificacion de azucar", tal como se utiliza en la presente memoria, significa cualquier fraccion pentosa o hexosa diferente de 2'-desoxirribosa. Los azucares modificados incluyen, por ejemplo, pentosas que incluyen las funciones D- ribosa, 2'-O-alquilo, 2'-amino, 2'-halo, hexosas y similares. Los ejemplos de modificaciones del azucar incluyen aquellos azucares en los que uno o mas de los grupos hidroxilo se reemplaza con un halogeno, un heteroatomo, una fraccion alquilo, o incluyen funciones tales como eteres, esteres y similares. La fraccion pentosa se puede reemplazar por una hexosa o una estructura alternativa tal como un anillo ciclopentano, un anillo morfolino de 6 miembros y similares. Tambien se pretende que los nucleosidos como se definen en la presente invencion incluyan una base unida a un

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aminoacido y/o un analogo de aminoacido que tenga un grupo carboxilo libre y/o un grupo amino libre y/o formas protegidas de los mismos. Tambien se incluyen los azucares que tienen una estereoqmmica distinta a la de una D- ribosa.

"Modificacion del grupo fosfodiester" significa cualquier analogo del grupo fosfodiester nativo que se acopla covalentemente a nucleomonomeros adyacentes. Los enlaces sustitutos incluyen analogos de fosfodiester, por ejemplo, tales como fosforotioato y metilfosfonato, y enlaces que no contienen fosforo, por ejemplo, tales como acetales y amidas.

La modificacion de acido nucleico tambien incluye modificaciones 3' y 5', tales como una proteccion con un atenuador (por ejemplo, un BHQ), un fluoroforo, un intercalador, un aglutinante del surco menor, un fluorocarbono, un grupo estabilizante conformacionalmente asistido u otra fraccion. En diversas realizaciones, el grupo protector se conjuga covalentemente con el oligomero a traves de un grupo enlazador.

Los oligomeros se definen aqu como dos o mas nucleomonomeros acoplados covalentemente entre sf mediante un fosfodiester o una fraccion fosfodiester modificada. Por lo tanto, un oligomero puede tener tan solo dos nucleomonomeros (un dfmero), y no tiene esencialmente ningun lfmite superior de nucleomonomeros. Los oligomeros pueden ser de union competente y, por lo tanto, pueden aparear bases con secuencias similares de acido nucleico de monocatenarias o bicatenarias (o agregacion de orden superior). Los oligomeros son tambien utiles como sintones para oligomeros mas largos como se describe en la presente memoria. Los oligomeros tambien pueden contener sitios con una sola base y pseudonucleosidos. En diversas realizaciones, los oligomeros de la invencion incluyen otras funciones. Las fracciones que anaden otras funciones a los oligomeros se discuten a continuacion. En la descripcion de ciertas realizaciones, el termino "oligomero" se usa indistintamente para referirse a la secuencia de acido nucleico del oligomero, proporcionando la secuencia de acido nucleico modificada una sonda o proporcionando la secuencia de acido nucleico modificada un soporte solido de la invencion.

"Peptido" se refiere a un oligomero en el que los monomeros son aminoacidos y se unen entre sf a traves de enlaces amida, denominados alternativamente polipeptido. Cuando los aminoacidos son a-aminoacidos, se puede usar tanto el isomero optico L como el isomero optico D. Adicionalmente, tambien se pueden incluir aminoacidos no naturales, por ejemplo, p-alanina, fenilglicina y homoarginina. Tambien se pueden usar aminoacidos comunmente encontrados que no estan codificados por genes en la presente invencion. Todos los aminoacidos usados en la presente invencion pueden ser el isomero D o L. Se prefieren generalmente los isomeros L. Ademas, otros peptidomimeticos tambien son utiles en la presente invencion. Para una revision general, vease, Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINES, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983).

Un "soporte solido" es un material solido que tiene una superficie para la fijacion de moleculas, compuestos, celulas u otras entidades, o a cuya superficie se unen tales especies. La superficie de un soporte solido puede ser plana o bien configurada. Un soporte solido puede ser poroso o no poroso. Un soporte solido puede ser un chip o un arreglo que comprende una superficie, y que puede comprender vidrio, silicio, nailon, polfmeros, plasticos, ceramicas o metales. Un soporte solido puede ser tambien una membrana, tal como una membrana de nailon, nitrocelulosa o polimerica, o una placa o plato y puede estar constituida por vidrio, ceramica, metales o plasticos, tales como, por ejemplo, una placa de 96 pozos elaborada, por ejemplo, poliestireno, polipropileno, policarbonato o polialomero. Un soporte solido tambien puede ser una perla o partmula de cualquier forma, y es preferiblemente esferico o casi esferico, y preferiblemente un perla o partmula tiene un diametro o anchura maxima de 1 milfmetro o menos, mas preferiblemente entre 0,1 a 100 micras. Estas partmulas o perlas pueden estar constituidas por cualquier material adecuado, por ejemplo, vidrio o ceramica, y/o uno o mas polfmeros, tales como, por ejemplo, nailon, politetrafluoroetileno, TEFLON®, poliestireno, poliacrilamida, sefarosa, agarosa, celulosa, derivados de celulosa o dextrano, y/o pueden comprender metales, particularmente metales paramagneticos, tales como hierro.

Los soportes para la smtesis en fase solida son conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, poliestireno altamente entrecruzado (McCollum, et al., Tetrahedron Lett. 32: 4069-4072 (1991), copolfmero de poliestireno/PEG (Gao, et al., Tetrahedron Lett., 32: 5477-5480 (1991), (Chow, et al., Nucl. Acids Res. 9: 2807-2817 (1981)) gel de sflice unida a poliamida (Gait, et al., Nucl. Acids Res. 10: 6243-6254 (1982)), celulosa (Crea et al., Nucl. Acids Res. 8: 23312348 (1980)) (y vidrio de poro controlado (CPG) (Koster, et al., Tetrahedron Lett., 24: 747-750 (1983)). Un ejemplo de soporte solido son perlas de CPG. Las perlas de CPG pueden someterse a derivacion para la union de un nucleomonomero u oligomero en una variedad de formas. Por ejemplo, las perlas se pueden tratar con 3- aminopropiltrietoxisilano para anadir un mango enlazador de aminopropilo para la union de monomeros o dfmeros analogos de oligonucleotidos (Koster, et al., Tetrahedron Lett. 24: 747-750 (1983), o, preferiblemente, un grupo alquilamina de cadena larga, mas preferiblemente que incluye un nucleosido terminal, se pueden unir a CPG (Adams, et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 661-663 (1983)). Los soportes para smtesis de oligonucleotidos o smtesis de peptidos, por ejemplo, dT-LCAA-CPG (Applied Biosystems), estan comercialmente disponibles.

Un "intercalador" se refiere a una fraccion aromatica o heteroaromatica plana que es capaz de insercion y apilamiento parcial entre nucleobases adyacentes. Estas fracciones pueden ser moleculas pequenas o parte de una entidad mayor, tal como una protema. Ejemplos no limitativos de intercaladores incluyen acridinas, antracenos, antraciclinas, antraciclinona, azul de metileno, indol, antraquinona, quinolina, isoquinolina, dihidroquinonas, tetraciclinas, psoralenos, cumarinas, haluros de etidio, homodfmeros de etidio, amarillo de oxazol homodimerico (YOYO), naranja de tiazol

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(TOTO), dinemicinas, 1,10-fenantrolina-cobre, calicheamicina, porfirinas, distamicinas, netropsinas y viologenos.

Un "aglutinante del surco menor" se refiere a una fraccion que tipicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 2000 Daltons. La fraccion se une de una manera no intercalada a la surco menor del ADN, ARN o sus tnbridos bicatenarios (o agregacion de orden superior), preferiblemente, con una constante de asociacion mayor a aproximadamente 103 M-1. Los compuestos de union a la surco menor tienen estructuras qmmicas muy diversas, sin embargo, los ejemplos de ligandos de la surco menor tienen una estructura tridimensional de forma de media luna. Los ejemplos incluyen ciertos compuestos naturales tales como netropsina, distamicina y lexitropsina, mitramicina, cromomicina A3, olivomicina, antramicina, sibirromicina, asf como otros antibioticos y derivados sinteticos relacionados. Ciertos compuestos heterodclicos de amonio bisquarternario, diarilamidinas tales como pentamidina, estilbamidina y berenilo, CC-1065 y polipeptidos de pirroloindol e indol relacionados, Hoechst 33258, 4'-6- diamidino-2-fenilindol (DAPI) asf como una serie de oligopeptidos que consisten en aminoacidos naturales o sinteticos son compuestos del aglutinante del surco menor. Los ejemplos de aglutinante del surco menor se describen en la patente estadounidense No. 6.084.102. Este tipo de union se puede detectar por metodos espectrofotometricos bien establecidos, tales como espectroscopia ultravioleta (UV) y resonancia magnetica nuclear (RMN) y tambien por electroforesis en gel. Los cambios en los espectros UV tras la union de una molecula aglutinante del surco menor, y espectroscopia RMN que utilizan el efecto "Overhauser nuclear" (NOSEY) son tecnicas particularmente bien conocidas y utiles para este proposito. La electroforesis en gel detecta la union de un aglutinante del surco menor al ADN bicatenario o fragmento del mismo, debido a que despues de dicha union, cambia la movilidad del ADN bicatenario.

El aglutinante del surco menor se une tfpicamente al oligomero o soporte solido a traves de un enlazador que comprende una cadena de aproximadamente 20, aproximadamente 15 atomos, aproximadamente 10 o aproximadamente 5 atomos.

Las fracciones o agentes de intercalacion se distinguen facilmente de los ligandos de surco menor sobre la base de que los agentes de intercalacion son moleculas aromaticas planas (preferiblemente polidclicas) frente a la "forma de media luna" o geometna analoga de los ligandos de surco menor. Una distincion experimental tambien puede hacerse por espectroscopia de RMN utilizando el efecto de Overhauser Nuclear.

El termino "enlazador" o "L", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un enlace covalente sencillo ("orden cero") o a una serie de enlaces covalentes estables que incorporan 1-30 atomos distintos de hidrogeno seleccionados del grupo que consiste en C , N, O, S, Si y P que se unen covalentemente a los componentes de los compuestos de la invencion, por ejemplo, enlazando un soporte solido con un agente estabilizante, un atenuador, un nucleomonomero u oligomero de la invencion; o enlazando un agente atenuador o fraccion estabilizante con una base en un amidita de la invencion. Los ejemplos de enlazadores incluyen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 atomos distintos de hidrogeno. A menos que se especifique lo contrario, los terminos "enlazamiento", "enlazado", "ligado", "conjugacion" "conjugado" y terminos analogos relacionados con la union se refieren a tecnicas que utilizan las especies que incorporan enlazadores. Los ejemplos de enlazadores incluyen un fragmento de enlace tal como se define aqrn. Ademas, un enlazador se usa para unir un oligomero u oligomero naciente (durante la smtesis de oligomeros) al soporte solido de la invencion. De este modo, la invencion proporciona tambien un oligomero de la invencion unido covalentemente a un soporte solido (por ejemplo, un soporte solido de la invencion) a traves de un enlazador. Los soportes solidos y oligomeros de la invencion incluyen opcionalmente un enlazador escindible entre dos componentes del soporte solido y el oligomero (por ejemplo, entre el oligomero y el soporte solido, entre el fluoroforo y el oligomero, entre el atenuador y el oligomero, entre el fluoroforo y el atenuador, etc.). En varias realizaciones, el enlazador que une el soporte solido al oligomero es un enlazador escindible.

Un "enlazador escindible" es un enlazador que tiene uno o mas grupos escindibles que pueden romperse como resultado de una reaccion o condicion. Un ejemplo de enlazador escindible esta situado dentro de L2 de la Formula I, que sirve para permitir la separacion conveniente de un oligomero sintetizado de la invencion del soporte solido sobre el cual se sintetizo. El termino "grupo escindible" se refiere a una fraccion que permite la liberacion de un componente del soporte solido u oligomero de la invencion mediante la escision de un enlazador de union de la fraccion liberada al resto del conjugado. Los ejemplos de mecanismos de escision de uso tanto en la preparacion como en el uso de los oligomeros y soportes solidos de la invencion estan mediados enzimaticamente o bien qmmicamente.

Ademas de los grupos enzimaticamente escindibles, esta dentro del alcance de la presente invencion incluir uno o mas sitios que se escinden por la accion de un agente distinto de una enzima. Ejemplos de agentes de escision no enzimaticos incluyen, pero no se limitan a, acidos, bases, luz (por ejemplo, derivados de nitrobencilo, grupos fenacilo, esteres de ortohidroxicinamato, esteres de benzoma) y calor. En la tecnica se conocen muchos grupos escindibles. Vease, por ejemplo, Jung, et al., Biochem. Biophys. Acta, 761: 152-162 (1983); Joshi, et al., J. Biol. Chem., 265: 1451814525 (1990); Zarling, et al., J. Immunol., 124: 913-920 (1980); Bouizar, et al., Eur. J. Biochem., 155: 141-147 (1986); Park, et al., J. Biol. Chem., 261: 205-210 (1986); Browning et al., J. Immunol., 143: 1859-1867 (1989). Ademas, se dispone comercialmente de una amplia gama de brazos espaciadores bifuncionales escindibles (tanto homo- como hetero-bifuncionales).

Un ejemplo de un grupo escindible es uno escindible por un reactivo, por ejemplo, hidroxido de sodio, amomaco u otra amina. En varias realizaciones, el enlazador escindible se escinde facilmente a temperatura ambiente o bajo condiciones de microondas. En una realizacion, el enlazador escindible es L2 y se escinde por tratamiento con una

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amina, por ejemplo, amoniaco o una amina esencialmente anhidra en un disolvente organico.

Un "fragmento de enlace", es una fraccion que se enlaza a dos o mas componentes (por ejemplo, un componente funcional, un soporte solido o un enlazador). Este termino se refiere a un enlace covalente que se forma por reaccion de companeros de reaccion complementarios, cada uno de los cuales tiene un grupo funcional reactivo de reactividad complementario a la reactividad de su companero. Los fragmentos de enlace en el soporte solido y los oligomeros de la invencion se seleccionan independientemente. Los ejemplos de fragmentos de enlace incluyen, pero no se limitan a, S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH y NHC(O)O, y OC(O)NH, CH2S, (CH2P, CH2CH2O, CH2CH2S, (CH2)oO, (CH2)oS o (CH2)oYx-PEG en donde, Yx es S, NH, NHC(O), C(O)NH, NHC(O)O, OC(O)NH, u O y o es un numero entero de 1 a 50. En cada uno de estos ejemplos de fragmentos de enlace, NH puede ser NR* en donde R* es alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido. Un fragmento de union puede ser tambien un fosfodiester o una modificacion de fosfodiester. En diversas realizaciones, el fragmento de enlace esta entre un enlazador y un fluoroforo, un enlazador y un atenuador, un enlazador y una fraccion estabilizante o un enlazador y un soporte solido. En un ejemplo de realizacion ejemplar del soporte solido y oligomeros de la invencion, cada fragmento de enlace es un fragmento de enlace diferente.

El termino "fluoroforo", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una fraccion que es inherentemente fluorescente o que demuestra un cambio en fluorescencia tras la union a un compuesto biologico o un ion metalico o metabolismo mediante una enzima, es decir, fluorogenico. Los fluoroforos pueden estar sustituidos para alterar la solubilidad, las propiedades espectrales o las propiedades ffsicas del fluoroforo. Numerosos fluoroforos son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a cumarinas, acridinas, furanos, dansilos, cianinas, pirenos, naftalenos, benzofuranos, quinolinas, quinazolinonas, indoles, benzazoles, borapoliazaindacenos, oxazinas y xantenos. Incluyendo estas ultimas fluorescemas, rodaminas, rosaminas y rodoles. Estos y otros fluoroforos de uso en la invencion se describen en Haugland, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS. Otros fluoroforos utiles se describen en la publicacion de las solicitudes de patente estadounidenses Nos. 2005/0214833 y 2005/0170363 de propiedad comun y aqrn a continuacion.

Tal como se usa en la presente memoria, "atenuador" se refiere a cualquier fraccion modificadora de la fluorescencia de la invencion que puede atenuar al menos parcialmente la luz emitida por un fluoroforo. Esta atenuacion se denomina aqrn "atenuacion". Por lo tanto, en diversas realizaciones, la excitacion del fluoroforo en presencia del grupo de atenuacion conduce a una senal de emision que es menos intensa de lo esperado, o incluso esta completamente ausente. La atenuacion se produce tfpicamente a traves de transferencia de energfa entre el fluoroforo excitado y el grupo de atenuacion.

El fluoroforo o atenuador puede incluir sustituyentes que mejoran una propiedad deseable, por ejemplo, solubilidad en agua, permeabilidad celular y absorcion y emision espectral, con relacion al compuesto "original" en ausencia de tal sustituyente. Como tal, el fluoroforo o atenuador de uso en la invencion incluye sustituyentes que mejoran una propiedad deseable con relacion a un compuesto original identico en ausencia del sustituyente mejorador.

Un "componente funcional" es un termino generico para una fraccion en un compuesto de la invencion que tiene una estructura seleccionada entre un atenuador, un fluoroforo y una fraccion estabilizante (incluyendo, pero sin limitarse a, intercaladores, fracciones de union a la surco menor, bases modificadas con una fraccion estabilizante (por ejemplo, fracciones alquinilo y fracciones fluoroalquilo), y fracciones estabilizantes conformacionales, tales como las descritas en la publicacion de solicitud de patente estadounidense No. 2007/0059752 de propiedad comun).

La expresion "amplificacion de polinucleotidos" incluye, pero no se limita a, metodos tales como reaccion en cadena de polimerasa (PCR), amplificacion de ligacion (o reaccion en cadena de ligasa, LCR) y metodos de amplificacion basados en el uso de replicasa Q-beta. Estos metodos son bien conocidos y ampliamente practicados en la tecnica. Vease, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos 4.683.195 y 4.683.202 e Innis et al., 1990 (para PCR); y Wu et al., 1989a (para LCR). Los reactivos y el hardware para llevar a cabo la PCR estan disponibles comercialmente. Los cebadores utiles para amplificar secuencias de una region genica particular son preferiblemente complementarios e hibridan espedficamente con secuencias en la region objetivo o en sus regiones flanqueantes. Las secuencias de acidos nucleicos generadas por amplificacion pueden secuenciarse directamente. Alternativamente, la secuencia o secuencias amplificadas pueden clonarse antes del analisis de secuencia. Un metodo para la clonacion directa y analisis de secuencias de segmentos genomicos amplificados enzimaticamente ha sido descrito por Scharf (1986). La presente invencion proporciona cebadores oligomericos de uso en procesos de amplificacion. Ademas, se proporciona un soporte solido de uso en la smtesis de tales cebadores. Ademas de cebadores, la invencion proporciona sondas, y metodos de uso de tales sondas, para detectar, caracterizar y/o cuantificar los productos de amplificacion: tambien se proporcionan soportes solidos de uso para sintetizar estas sondas oligomericas.

El termino "perturbaciones de apilamiento de bases" se refiere a cualquier evento que provoque una perturbacion en el apilamiento de bases tal como, por ejemplo, un desajuste de pares de bases, una protema que se une a su sitio de reconocimiento, o cualquier otra entidad que forme aductos oligonucleotidos. Varias sondas de la invencion son capaces de detectar, caracterizar y/o cuantificar tales perturbaciones de apilamiento de bases. Ademas, la invencion proporciona soportes solidos de uso para sintetizar sondas capaces de detectar, caracterizar y/o cuantificar tales perturbaciones de apilamiento de bases.

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El termino "hibridado" se refiere a dos cadenas de acido nucleico asociadas entre sf que pueden estar o no totalmente emparejadas en la base: generalmente, este termino se refiere a una asociacion que incluye un oligomero de la invencion, ya sea unido a un soporte solido o en solucion.

El termino "desnaturalizacion" se refiere al proceso mediante el cual las cadenas de duplex de acido nucleico (o agregacion superior) ya no son mas bases apareadas por enlaces de hidrogeno y se separan en moleculas de cadena sencilla. Los metodos de desnaturalizacion son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen desnaturalizacion termica y desnaturalizacion alcalina. Este termino se refiere generalmente a la disociacion de una sonda de la invencion de su acido nucleico objetivo.

El termino "desajustes" se refiere a bases de acido nucleico dentro de duplex de acido nucleico hibridado (o agregacion superior) que no son complementarias al 100%. Un desajuste incluye cualquier emparejamiento incorrecto entre las bases de dos bases situadas en cadenas complementarias de acido nucleico que no son las parejas de bases de Watson-Crick, por ejemplo, A:T o G:C. La falta de homologfa total puede deberse a supresiones, inserciones, inversiones, sustituciones o mutaciones de cambio de marco. En diversas realizaciones, el oligomero de la invencion incluye una falta de coincidencia con respecto a su acido nucleico objetivo, preferiblemente permitiendo la deteccion y/o caracterizacion y/o cuantificacion de la desadaptacion correspondiente en su objetivo. En ciertas realizaciones, el desajuste es un desajuste de un solo nucleotido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "polimorfismo" se refiere a una variacion de secuencia en un gen, y "mutacion" se refiere a una variacion de secuencia en un gen que esta asociado o se cree que esta asociado con un fenotipo. El termino "gen" se refiere a un segmento del genoma que codifica para una region de control de la protema del producto funcional. Los marcadores polimorficos usados de acuerdo con la presente invencion para la identificacion del sujeto pueden estar localizados en regiones codificantes o no codificantes del genoma y diversas sondas de la invencion estan disenadas para hibridar con regiones de acido nucleico que incluyen estos marcadores. El termino "sujeto", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un sujeto que proporciona una muestra de ensayo a partir de la cual se obtienen acidos nucleicos objetivo con el proposito de realizar pruebas geneticas. Los oligomeros de la invencion son utiles para detectar y/o caracterizar y/o cuantificar polimorfismos y mutaciones. Ademas, los soportes solidos de la invencion son utiles para sintetizar oligomeros de uso para detectar y/o caracterizar y/o cuantificar polimorfismos y mutaciones.

El termino "sonda" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a oligomeros de acido nucleico preparados usando un soporte solido o amidita de la invencion. En diversas realizaciones, las sondas producen una respuesta detectable tras la interaccion con un companero de union. Las sondas incluyen al menos una fraccion detectable, o un par de fracciones que forman un par de transferencia de energfa detectable tras algun cambio de estado de la sonda en respuesta a su interaccion con un companero de union. La presente invencion proporciona sondas y amiditas y soportes solidos de uso para sintetizar sondas. Los ejemplos de sondas de la invencion son utiles para detectar un polimorfismo. En diversas realizaciones, el polimorfismo es un polimorfismo de un solo acido nucleico (SNP).

El termino "respuesta detectable" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un cambio o una ocurrencia de una senal que es directa o indirectamente detectable ya sea por observacion o por instrumentacion y la presencia de, o preferiblemente, la magnitud de la cual es una funcion de la presencia de un companero de union objetivo para una sonda en la muestra de ensayo. Tfpicamente, la respuesta detectable es una respuesta optica de un fluoroforo que da como resultado un cambio en los patrones de distribucion de longitud de onda o intensidad de absorbancia o fluorescencia o un cambio en dispersion de luz, rendimiento cuantico de fluorescencia, vida de la fluorescencia, polarizacion de fluorescencia, un cambio en la longitud de onda de excitacion o emision o una combinacion de los parametros anteriores. El cambio detectable en una propiedad espectral dada es generalmente un aumento o una disminucion. Sin embargo, tambien son utiles los cambios espectrales que resultan en un aumento de la intensidad de fluorescencia y/o un cambio en la longitud de onda de emision o excitacion de fluorescencia. El cambio en la fluorescencia en la union a iones suele ser debido a cambios conformacionales o electronicos en el indicador que pueden ocurrir en el estado excitado o en el estado basal del fluoroforo, debido a cambios en la densidad de electrones en el sitio de union a iones debido a la atenuacion de la fluorescencia por el ion metalico objetivo unido, o debido a cualquier combinacion de estos u otros efectos. Alternativamente, la respuesta detectable es una ocurrencia de una senal en la que el fluoroforo es inherentemente fluorescente y no produce un cambio en la senal al unirse a un ion metalico o compuesto biologico. La presente invencion proporciona sondas que proporcionan una respuesta detectable y soportes solidos de uso para sintetizar dichas sondas.

Introduccion

La presente invencion proporciona el uso de una sonda para la deteccion de un polimorfismo en secuencias objetivo de acido nucleico, comprendiendo la sonda un oligomero de acido nucleico que comprende una base que tiene una formula seleccionada entre:

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en donde R10 es una fraccion alquinilo seleccionado del grupo que consiste en: etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo, 1 -pentinilo,

1,3-pentadiinilo, fenil-etinilo, piridin-etinilo, pirimidin-etinilo, triazin-etinilo, tiofen-etinilo, tiazol-etinilo e imidazol-etinilo; y un atenuador de energia de fluorescencia que comprende ya sea:

a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en el que el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un primer enlace diazo exociclico y en el que el primer o el segundo residuo esta unido covalentemente al tercer residuo a traves de un segundo enlace diazo; o

b) al menos dos residuos, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en el que el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un enlace diazo exociclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado a partir de arilo policiclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo policiclicos sustituidos o no sustituidos; en donde los grupos arilo y heteroarilo tienen de 1 a 3 anillos; y

en donde dicho atenuador esta unido en el extremo 3' o en el extremo 5' de dicho oligomero de acido nucleico;

en donde el oligomero contiene de 8 a 30 nucleomonomeros. En la presente memoria se describen fosforamiditas, soportes solidos y oligomeros de un formato facilmente preparado sobre estos soportes solidos. Se estabilizan ejemplos de oligomeros con respecto a su capacidad para hibridarse con secuencias de acido nucleico objetivo, formando duplex o triplex. Varios oligomeros de la invencion son adecuados para unirse a secuencias objetivo duplex de ADN a traves de un motivo de union de triple helice CT o GT.

En diversas realizaciones, los oligomeros aqui descritos son resistentes a la degradation por nucleasa en relation con un oligodesoxinucleotido que no tiene modificaciones. Los oligomeros resistentes a la nucleasa se utilizan ventajosamente bajo condiciones en las que estan presentes nucleasas. Para ciertas aplicaciones, tales como la modulation de la expresion genica mediante un mecanismo antisentido, la estabilidad de la nucleasa por oligomeros es un aspecto funcional importante del oligomero.

En la presente memoria se describen metodos para detectar la presencia, ausencia o cantidad de un ADN o ARN monocatenario particular o un duplex objetivo particular en una muestra biologica (u otra) utilizando los oligomeros para detectar secuencias seleccionadas de acido nucleico. Tales secuencias pueden estar asociadas con la presencia de crecimiento neoplasico, virus o condiciones de enfermedad.

Ejemplos de oligomeros tienen propiedades de union mejoradas con respecto a las secuencias de acidos nucleicos monocatenarias y bicatenarias complementarias en comparacion con los oligomeros no modificados que no tienen el componente de la fraccion estabilizante de los oligomeros de la invencion. En diversas realizaciones, pueden formarse estructuras de triple helice a niveles de pH fisiologico de 7,0 y superiores. Tambien se proporciona una formation duplex mejorada, en ejemplos de realizaciones.

En este documento se describen oligomeros utiles para, en ejemplos de realizaciones, (1) modular la expresion genica en celulas in vitro, incluyendo celulas cultivadas en cultivo de tejido (por ejemplo, para tratar una condition, por ejemplo, cancer, infection, etc.) y (2) detectar y/o cuantificar secuencias de acido nucleico objetivo.

En la presente memoria se describen reactivos y kits que comprenden las fosforamiditas, soportes solidos y/o oligomeros de la invencion.

Las formas de realization

En el presente documento se describe un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Formula I:

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L3—Q ORc

(I)

en la que Xa es una fraccion estabilizante seleccionada de fluoroalquilo, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. En diversas realizaciones, Xa es un aglutinante del surco menor o un agente de intercalation.

Los simbolos L1, L2, L3 y L4 representan enlazadores. Los enlazadores se seleccionan independientemente entre un solo enlace covalente, alquilo sustituido o no sustituido y fracciones heteroalquilo sustituidas o no sustituidas. Ya es un

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miembro seleccionado de CRa, y N en el que Ra es un miembro seleccionado de H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido. Ra es opcionalmente un enlazador para un componente funcional.

El sfmbolo Za representa un soporte solido, ORb o NRbRb' en el que Rb y Rb' son miembros seleccionados independientemente de H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido. El sfmbolo Rc representa un miembro seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido y un enlazador que contiene fosforo unido covalentemente a un acido nucleico. En un ejemplo de realizacion, Rc es un grupo protector de acido nucleico, por ejemplo, dimetoxitritilo ("DMT"). En otra realizacion, Rc es un enlace de fosfodiester a otra fraccion de acido nucleico, que opcionalmente forma derivado con uno o mas componentes funcionales.

Los compuestos descritos en la presente invencion incluyen un atenuador de energfa de fluorescencia. El atenuador esta representado por el sfmbolo Q y, en ejemplos de realizaciones, incluye una o mas de las siguientes caracterfsticas estructurales:

(a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en el que el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un primer enlace diazo exocfclico. El primero o el segundo residuo esta unido covalentemente a un tercer residuo a traves de un segundo enlace diazo; y

(b) al menos dos residuos, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido, y heteroarilo sustituido o no sustituido. El primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un enlace diazo exocfclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado de arilo policfclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo policfclico sustituidos o no sustituidos.

Los atenuadores estan unidos al resto del compuesto a traves de un enlazador. El atenuador y el enlazador se acoplan por reaccion de un grupo funcional reactivo sobre un atenuador precursor y un grupo funcional reactivo sobre el enlazador. Los dos grupos funcionales reactivos son de reactividad complementaria y despues de la reaccion forman un fragmento de enlace tal como se define en la presente memoria.

Ejemplos de enlazadores en la Formula I incluyen:

Para L1,

por ejemplo

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en la que z es un numero entero de 1 a 20, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Para L2,

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por ejemplo

Ya

en la que y, w y u son numeros enteros independientemente seleccionados de 1 y 20, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.

Para L3,

por ejemplo

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en la que v, t y s son numeros enteros seleccionados independientemente de 1 a 20, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19 o 20. El slmbolo Xb representa un miembro seleccionado de O y S. Xc es un miembro seleccionado entre OR8, SR8 y NR8 R8a, en la que R8 y R8a son miembros seleccionados independientemente de H y alquilo sustituido o no sustituido, o el compuesto es una sal y OR8 y SR8 se seleccionan de O-M+ y S-M+. M+ es cualquier cation capaz de formar una sal con el ion cargado negativamente, incluyendo un ion metalico o un ion amonio. R9 es un miembro seleccionado de H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido y un acido nucleico opcionalmente conectado a traves de un enlazador que contiene fosforo.

Para L1-Ya-L3,

por ejemplo

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en las que los Indices y los radicales variables son como se ha indicado anteriormente. Para L1-Ya-L2,

por ejemplo

en las que los Indices y radicales variables son como se ha indicado anteriormente.

Para L1-Ya-L3,

por ejemplo

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s

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en las que los Indices y radicales variables son como se ha indicado anteriormente.

En el presente documento se describe un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Formula VII:

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(CH2)v----O----P----O----(CH2)t----N----Q

Xc (CH2)s—ORc

(VII)

en la que los indices y los radicales variables son como se ha indicado anteriormente.

En la presente memoria se describe un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la Formula VIII:

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en la que Q1 es un fragmento del atenuador. El fragmento comprende un miembro seleccionado de:

(a) dos fracciones seleccionadas de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, estando conectadas dichas dos fracciones a traves de un enlace diazo exodclico; y

(b) una fraccion seleccionada de arilo polidclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo polidclicos sustituidos o no sustituidos.

Cada R12 es un miembro independientemente seleccionado del grupo de sustituyentes arilo como se define en la presente memoria; y el numero entero p es 0, 1, 2, 3 o 4. Los restantes indices y radicales son como se han indicado anteriormente.

Con respecto a los enlazadores de uso en los compuestos, se proporciona un ejemplo de realizacion en la que Za es un soporte solido y L2-Za comprende una estructura de acuerdo con la Formula IX:

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en la cual los indices son como se ha indicado anteriormente; y SS es el soporte solido.

En ciertas realizaciones se incluye en el soporte solido o en una fosforamidita o en un oligomero sintetizado en el soporte solido una fraccion estabilizante. Un ejemplo de compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente es aquel en el que Xa se selecciona entre agentes de intercalacion y ligandos de surco menor.

En diversas realizaciones, el soporte solido o fosforamidita u oligomero de la invencion incluye una base que tiene una formula seleccionada de

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en la que R10 es un miembro seleccionado entre una fraccion alquinilo y una fraccion fluoroalquilo.

Por "alquinilo" se entiende un grupo acilo acetilenicamente insaturado, tal como etinilo, 1-propinilo, 1 -butinilo, 1-pentinilo,

1,3-pentadiinilo, fenil-etinilo, piridin-etinilo, pirimidin-etinilo, triazina-etinilo, tiofen-etinilo, tiazol-etinilo e imidazol-etinilo. Ejemplos de grupos sustituidos incluyen grupos alquinilo C1-C10 sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, alquinilo C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 o C10, sustituido con 2-, 3- y 4-piridinilo (por ejemplo, 2-, 3- y 4-pirimidin-etinilo), triazina (por ejemplo, triazinil-etinilo), 2-, 4- y 5-pirimidinilo, 2-, 4- y 5-tiazolilo, 1-metil-2-imidazolilo, 2- y 4-imidazolilo, 2-, 4- y 5- oxazolilo, 3-piridinilo, 4-piridinilo, 2-piridinilo, 2- y 3-furani-etinilo, 2- y 3-tienil-etinilo, 2- y 4-imidazolil-etinilo, 2-, 4- y 5- tiazolil-etinilo, 2-, 4- y 5-oxazolil-etinilo, 2- y 3-pirrolil-etinilo, 2- y 3-tienilo, 2- y 3-furanilo, 2- y 3-pirrolilo, propenilo (-CH = CH-CH3), vinilo y -C=C-Z' donde Z' es hidrogeno (H) o alquilo C1-C10, haloalquilo (C1-C10 con 1 a 6 atomos de halogeno o heteroalquilo (C1-C10 con 1 a 3 heteroatomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S). La fraccion alquinilo tambien puede ser el componente de un enlazador o un fragmento de enlace.

Ejemplos de grupos fluoroalquilo incluyen fracciones lineales (por ejemplo, C1-C20, C2-C16, C3-C10, C4-C8) y cicloalquilo (por ejemplo, C3-C8) sustituidos con una o mas fracciones fluor. Ejemplos de grupos fluoroalquilo incluyen 1, 2, 3, 4, 5,

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6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 atomos de carbono. Los compuestos perfluorados son utiles en los compuestos.

Monomeros

En la presente memoria se describen acidos nucleicos monomericos de uso en la smtesis de oligomeros. En una realization representativa, el acido nucleico monomerico es una fosforamidita que porta una fraction estabilizante. Un ejemplo de acido nucleico monomerico de acuerdo con esta realizacion tiene la formula:

En diversas realizaciones, la fraccion estabilizante es un residuo alquino, que proporciona un acido nucleico monomerico que tiene la formula:

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en la que Q es un atenuador, y L4 es un enlazador. Los ejemplos de enlazadores incluyen alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido de orden cero. Rd es H, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido. En un ejemplo de realizacion, Rd es un grupo protector de acido nucleico, por ejemplo, DMT. Rc es H o es un componente de una fosforamidita, por ejemplo, -OPN(i-Pr)2(OCNE). El anillo marcado B representa una base como se define aqm. Los ejemplos de bases incluyen:

imagen19

en las que R10 representa L4-Q.

En diversas realizaciones, Q-L4 tiene la formula:

Rq O

en la que Rq es H, alquilo sustituido o no sustituido o heteroalquilo sustituido o no sustituido y el mdice e representa un numero entero de 1 a 20, es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20.

Tambien se proporciona un oligomero de acido nucleico, por ejemplo, una sonda, preparada usando un monomero e incluyendo los componentes del monomero a partir del cual es sintetizado.

Oligomeros

Ejemplos de oligomeros incluyen oligonucleotidos, oligonucleosidos, oligodesoxirribonucleotidos (que contienen 2'- desoxi-D-ribosa o sus formas modificadas), es decir, ADN, oligorribonucleotidos (que contienen D-ribosa o sus formas modificadas), es decir, ARN, y cualquier otro tipo de polinucleotido que es un N-glicosido o C-glicosido de una base purina o pirimidina, o una base purina o pirimidina modificada. Oligomero, tal como se usa en el presente documento, tambien incluye compuestos en los que los nucleomonomeros adyacentes estan unidos mediante enlaces amida como se ha descrito anteriormente (Nielsenet et al., Science (1991) 254: 1497-1500). Se cree que la competencia reforzada de union por oligomeros que contienen las bases es principalmente una funcion de la base sola. Debido a esto, los elementos habitualmente encontrados en oligomeros, tales como el anillo de furanosa y/o el enlace fosfodiester pueden reemplazarse por cualquier elemento funcionalmente equivalente adecuado. Por lo tanto, se pretende que "oligomero" incluya cualquier estructura que sirva como estructura o soporte para las bases en las que la estructura permite la union con acidos nucleicos objetivo de una manera dependiente de la secuencia.

Ejemplos de grupos que unen nucleomonomeros en un oligomero incluyen (i) un fosfodiester y modificaciones de fosfodiester (fosforotioato, fosfonato de metilo, etc.), (ii) enlaces sustitutivos que contienen un isostato diferente de fosforo (formacetal, riboacetal, carbamato, etc.) (iii) residuos de morfolino, residuos carboticlicos u otros azucares de furanosa tales como arabinosa o hexosa en lugar de ribosa o desoxirribosa y (iv) nucleomonomeros enlazados por enlaces amida o nucleomonomeros aticlicos enlazados por cualquier enlace sustitutivo adecuado.

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Los oligomeros se pueden formar usando nucleomonomeros modificados y convencionales y sintetizados usando tecnicas de smtesis de oligomeros estandar en fase solida (o en fase de disolucion), las cuales estan ahora disponibles comercialmente. En general, los oligomeros se pueden sintetizar por un metodo que comprende las etapas de: sintetizar un nucleomonomero u sinton oligomero que tiene un grupo protector y una base y un grupo de acoplamiento capaz de acoplarse a un nucleomonomero u oligomero; acoplar el nucleomonomero o sinton de oligomero a un nucleomonomero aceptor o un oligomero aceptor; eliminacion del grupo protector; y repetir el ciclo segun sea necesario hasta que se sintetice el oligomero deseado.

Los oligomeros pueden ser de cualquier longitud incluyendo aquellos de mas de 40, 50 o 100 nucleomonomeros. En diversas realizaciones, los oligomeros contienen 2-30 nucleomonomeros. Las longitudes mayores o iguales a aproximadamente 8 a 20 nucleomonomeros son utiles para aplicaciones terapeuticas o diagnosticas. Se incluyen espedficamente oligomeros cortos que contienen 2, 3, 4 o 5 nucleomonomeros y son utiles, por ejemplo, como sintones.

Los oligomeros que tienen una secuencia aleatoria y que contienen menos de 20, menos de 15 o menos de 10 nucleomonomeros son utiles para cebadores, por ejemplo, en protocolos de clonacion o amplificacion que utilizan cebadores de secuencia aleatoria, siempre que el oligomero contenga residuos que puedan servir como un cebador para polimerasas o transcriptasas inversas.

Los oligomeros pueden contener enlaces fosfodiester convencionales o pueden contener modificacion de fosfodiester tales como enlaces fosforamidato. Estos enlaces sustituidos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que una fraccion de la formula -OP(O)(S)-O- ("fosforotioato"), -O-P(S)(S)-O- ("fosforoditioato"), -O-P(O)-(NRo2)-X-, -O-P(O)(Ro)- O-O-P-(S)(R°)-O- ("tionoalquilfosfonato"), -P(O)(ORp)-X-, -OC(O)-X-, o -OC(O)(NRp2)-X-, donde Ro es H (o una sal) o alquilo (1-12C) y Rp es alquilo (1-9C) y el enlace se une a nucleomonomeros adyacentes a traves de un -O- o -S- unido al carbono del nucleomonomero. En diversas realizaciones, los enlaces sustitutivos para uso en los oligomeros de la presente invencion incluyen enlaces fosfodiester, fosforotioato, metilfosfonato y tionometilfosfonato. Los enlaces fosforotioato y metilfosfonato confieren estabilidad adicional al oligomero en entornos fisiologicos. Aunque no todos estos enlaces en el mismo oligomero necesitan ser identicos, los oligomeros particularmente preferidos de la invencion contienen enlaces uniformemente fosforotioato o enlaces uniformemente metilfosfonato.

Los oligomeros o sus segmentos se sintetizan convencionalmente, y se pueden preparar usando un soporte solido y/o fosforamidita. Los metodos sinteticos conocidos en la tecnica y descritos aqrn pueden usarse para sintetizar oligomeros que contienen bases, asf como otras bases conocidas en la tecnica, usando nucleomonomeros adecuadamente protegidos. Los metodos para la smtesis de oligomeros se encuentran, por ejemplo, en Froehler, B., et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14: 5399-5467; Nucleic Acids Res. (1988) 16: 4831-4839; Nucleosides and Nucleotides (1987) 6: 287-291; Froehler, B., Tetrahedron Lett. (1986) 27: 5575-5578; Caruthers, M.H. en Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression (1989), J. S. Cohen, editor, CRC Press, Boca Raton, p7-24; Reese, C. B. et al., Tetrahedron Lett. (1985) 26: 2245-2248. Tambien se ha descrito la smtesis de los oligomeros unidos a metilfosfonato por medio de la qrnmica de la metilfosfonamidita (Agrawal, S. et al., Tetrahedron Lett., (1987) 28: 3539-3542, Klem, RE et al., publicacion internacional No. WO 92/07864).

Tal como se describe en la presente memoria, son "conjugados" de oligomeros. Por ejemplo, los oligomeros pueden estar unidos covalentemente a diversos componentes funcionales tales como fracciones estabilizantes (Xa), fluoroforos, agentes de atenuacion, intercaladores y sustancias que interactuan espedficamente con el surco menor de la doble helice de ADN (ligandos de surco menor, "MGB"). Otras fracciones conjugadas elegidas, pueden ser etiquetas tales como radioactivas, fluorescentes, enzimas o fracciones que facilitan la asociacion de celulas usando enlazadores de escision y similares. Las etiquetas radioactivas adecuadas incluyen 32P, 35S, 3H y 14C; y las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen fluorescema, resorufina, rodamina, BODlpY (Molecular Probes) y rojo Texas; las enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa de rabano picante. Los fluoroforos adicionales se exponen aqrn y se reconocen generalmente en la tecnica. Otras fracciones unidas covalentemente incluyen biotina, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y protemas, por ejemplo, transferrina y la protema Tat del VIH.

Como se discute aqrn y se reconoce en la tecnica, los oligomeros pueden formar derivados a traves de cualquier enlace conveniente. Por ejemplo, pueden ligarse a los oligomeros aglutinantes del surco menor, fluoroforos, atenuadores e intercaladores, tales como acridina o psoraleno, a traves de cualquier -OH o -SH disponible, por ejemplo, en la posicion 5' terminal del oligomero, en las posiciones 2' de ARN, o un OH, NH2, COOH o SH incorporados en la posicion 5 de pirimidinas. Una forma derivada que contiene, por ejemplo, -CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2OH o -CH2CH2CH2SH en la posicion 5 es de uso como se describe en la presente memoria. Los conjugados que incluyen polilisina o lisina se pueden sintetizar como se ha descrito y pueden mejorar adicionalmente la afinidad de union de un oligomero a su secuencia de acido nucleico objetivo (Lemaitre, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1987) 84: 648-652; Lemaitre, M. et al., Nucleosides and Nucleotides (1987) 6: 311-315).

Se puede unir una amplia variedad de sustituyentes, incluyendo aquellos enlazados a traves de enlaces o enlaces sustitutivos. Los fracciones -OH en los enlaces fosfodiester de los oligomeros pueden sustituirse por grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estandar, o grupos de acoplamiento para preparar enlaces adicionales a otros nucleomonomeros o pueden unirse al sustituyente conjugado. El OH del terminal 5' puede ser fosforilado; los sustituyentes 2'-OH u OH en el terminal 3' tambien pueden ser fosforilados. Los hidroxilos tambien pueden formar

derivados con grupos protectores estandar.

Los oligomeros pueden formar derivados covalentemente con fracciones que facilitan la asociacion con celulas usando enlazadores escindibles. Los enlazadores usados para tales conjugados pueden incluir enlaces disulfuro que se reducen despues de que el conjugado de oligomero-agente de transporte haya entrado en una celula. Los enlazadores 5 que contienen disulfuro de este tipo tienen una semivida controlable. Dichos enlazadores son estables en condiciones extracelulares con respecto a las condiciones intracelulares debido al potencial redox del enlace disulfuro.

Fracciones donantes y aceptoras

Atenuadores

Ejemplos de soportes solidos y oligomeros incluyen un atenuador unido covalentemente a los mismos, opcionalmente a 10 traves de un enlazador. En diversas realizaciones, el atenuador es una fraccion que tiene una estructura de acuerdo con la Formula (II)

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en la que R1, R2 y R3 son miembros seleccionados independientemente entre arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Los simbolos X, Y y Y' son miembros seleccionados independientemente de grupos funcionales reactivos y fragmentos de enlace que unen covalentemente dicho agente atenuador a L3. El mdice f es un numero seleccionado de 0 a 4 (es decir, 0, 1, 2, 3, o 4), inclusive, de manera que cuando (f x s) es mayor que 1, los grupos Y' son iguales o diferentes. El mdice m es un numero seleccionado de 0 a 5 (es decir, 0, 1,2, 3, 4, o 5), inclusive, de manera que cuando m es mayor que 1, los grupos X son iguales o diferentes. El mdice n es un numero de 0 a 6 (es decir, 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6), inclusive, de manera que cuando (n x t) es mayor que 1, los grupos Y son iguales o diferentes. El mdice s es un numero de 0 a 6 (es decir, 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6), inclusive, de manera que cuando s es mayor que 1 los grupos R3 son iguales o diferentes. El mdice t es un numero de 1 a 6 (es decir, 1,2, 3, 4, 5 o 6), inclusive, de manera que cuando t es mayor que 1 los grupos R2 son iguales o diferentes, y cuando t es 1 y s es 0, un miembro seleccionado de R1, R2 y sus combinaciones son un miembro seleccionado de arilo polidclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo polidclicos sustituidos o no sustituidos.

En diversas realizaciones, el atenuador tiene una estructura de acuerdo con la Formula (IN):

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El soporte solido y los oligomeros tambien pueden incluir un atenuador de acuerdo con la Formula III en la que un miembro seleccionado entre R1, R2 y R3 incluye una estructura de acuerdo con la Formula IV:

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30 en la que R4 es un miembro seleccionado entre alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido.

Los atenuadores de uso en diversas realizaciones tienen una estructura de acuerdo con la Formula V:

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en la que v es un numero entero de 1 a 10 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).

35 En los ejemplos de realizaciones, el atenuador tiene una estructura de acuerdo con la Formula VI:

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en la que los simbolos R5, R6 y R7 son miembros seleccionados independientemente entre -NR'R'', arilo sustituido o no sustituido, nitro, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido y alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido R' y R'' se seleccionan independientemente entre H y alquilo (C1-C6) sustituido o no sustituido. El mdice n es un numero entero de 0 a 1. El mdice a es un numero entero de 0 a 4 (es decir, 0, 1,2, 3 o 4), de manera que cuando a es mayor que 1, los grupos R5 son iguales o diferentes. El mdice b es un numero entero de 0 a 4 (es decir, 0, 1,2, 3, o 4), de manera que cuando (v x b) es mayor que 1, los grupos R6 son iguales o diferentes. El mdice c es un numero entero de 0 a 5 (es decir, 0, 1,2, 3, 4 o 5), de manera que cuando c es mayor que 1, los grupos R7 son iguales o diferentes; y v es un numero entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), de manera que cuando v es mayor que 1, el valor de b en cada uno de los anillos fenilos b es igual o diferente.

Varias realizaciones utilizan un atenuador que tiene una estructura de acuerdo con la Formula VII:

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en la que R5, R6 y R7 son miembros seleccionados independientemente de amina, alquilamina, arilo sustituido o no sustituido, nitro, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido. Los simbolos X1 y X2 representan miembros seleccionados independientemente de alquilo C1-C6 o alquilo sustituido C1-C6, -OH, -COOH, - NR'R'', -SH, -OP(OX3)(NR'R'') y un fragmento de enlace que une covalentemente dicho agente atenuador a L3. R' y R" son miembros seleccionados independientemente del grupo que consiste en H, y alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido.

En ciertas realizaciones, los compuestos utilizan un atenuador que tiene una estructura que es un miembro seleccionado entre:

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en las que X5 y X6 son miembros seleccionados independientemente de H, un grupo funcional reactivo y un fragmento de enlace que une covalentemente dicho agente atenuador (Q) a L3, con la condicion de que al menos uno de X5 y X6 sea un fragmento de enlace de este tipo.

En la presente memoria se describen compuestos de acuerdo con la Formula I, incluyendo el componente seleccionado entre:

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y

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Como apreciara un experto en la tecnica, L3 en las estructuras anteriores se puede reemplazar por L4 y su union a una base modificada propino.

Una de las ventajas de los compuestos es que se puede usar una amplia gama de moleculas dadoras de ene^a junto con los soportes solidos y oligomeros que incluyen la funcion atenuadora. Una amplia gama de fluoroforos es conocida por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. of Chemical Physics 21: 836-850 (1953); Hochstrasser et al., Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992); Selvin, P., Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995); Steinberg, I. Ann. Rev. Biochem., 40: 83-114 (1971); Stryer, L. Ann. Rev. Biochem., 47: 819-846 (1978); Wang et al., Tetrahedron Letters 31: 6493-6449 (1990); Wang et al., Anal. Chem. 67: 1197-1203 (1995).

En la Tabla 1 se proporciona una lista no limitativa de ejemplos de donantes que pueden usarse conjuntamente con los atenuadores.

TABLA 1

Fracciones adecuadas que pueden ser seleccionadas como donantes o aceptoras en pares de transferencia de energfa

donante-aceptor

Acid^ acridina y derivados: acridina

isotiocianato de acridina

Acido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfonico (EDANS)

4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5-disulfonato

N-(4-anilino-1-naftil)maleimida

antranilamida

BODIPY

Amarillo Brillante cumarina y derivados: cumarina

7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120)

7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151) colorantes de cianina

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cianosina

4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)

5',5''-dibromopirogalol-sulfonaftalema (Rojo de bromopirogalol) 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina penta-acetato de dietilentriamina

acido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulf6nico acido 4,4'-diisotiocianatostilbeno-2,2'-disulf6nico

cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo) acido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL)

4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC) eosina y derivados: eosina

isotiocianato de eosina eritrosina y derivados: eritrosina B

isotiocianato de eritrosina

etidio

fluorescema y derivados:

5-carboxifluorescema (FAM)

5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluorescema (DTAF) 2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE) fluorescema

isotiocianato de fluorescema QFITC (XRITC) fluorescamina IR144 IR1446

Isotiocianato verde de malaquita

4-metilumbeliferona

orto cresolftalema

nitrotirosina

pararosanilina

Rojo Fenol

B-ficoeritrina

o-ftaldialdelmdo

pireno y derivados:

pireno

butirato de pireno succinimidil butirato de 1-pireno puntos cuanticos

5 Rojo Reactivo 4 (CibacronMR Rojo Brillante 3B-A) rodamina y derivados:

6-carboxi-X-rodamina (ROX)

6-carboxirodamina (R6G)

cloruro sulfonilo de lissamina rodamina B rodamina (Rhod)

10 rodamina B

rodamina 123

isotiocianato de rodamina X sulforrodamina B sulforrodamina 101

15 derivado de cloruro de sulforrodamina 101 (Rojo Texas)

N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA) tetrametil rodamina

isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) riboflavina

20 acido rosolico

quelatos de metal, por ejemplo, quelatos de lantanidos (por ejemplo, quelatos de europio y terbio), quelatos de rutenio

Existe una gran cantidad de orientacion practica disponible en la literatura para seleccionar pares apropiados donador- aceptor para sondas particulares, como se ejemplifica mediante las siguientes referencias: Pesce et al., Eds., SPECTROSCOPY FLUORESCENCE (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A 25 PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); y similares. La literatura tambien incluye referencias que proporcionan listas exhaustivas de moleculas fluorescentes y cromogenicas y sus propiedades opticas relevantes para la eleccion de pares de informador-atenuador (vease, por ejemplo, Berlman, HANDBOOK Of FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2a Edicion (Academic Press, New York, 1971). Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, Ed., INDICATORS

30 (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH

CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); y similares. Ademas, existe una grna extensa en la literatura para formar derivados de moleculas de informador y atenuador para una union covalente a traves de grupos reactivos comunes que se pueden anadir a un acido nucleico, tal como se ejemplifica mediante las siguientes referencias: Haugland (citado 35 anteriormente), Ullman et al., patente de Estados Unidos No. 3.996.345, Khanna et al., patente de Estados Unidos

4.351.760. Por lo tanto, esta dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica elegir un par de intercambio de energfa para una aplicacion particular y conjugar los miembros de este par con una molecula de sonda, tal como, por ejemplo, un acido nucleico, peptido u otro polfmero.

En general, se prefiere que una banda de absorbancia de la BHQ se solape sustancialmente la banda de emision de 40 fluorescencia del donante. Cuando el donador (fluoroforo) es un componente de una sonda que utiliza la transferencia de energfa donador-aceptor, la fraccion fluorescente donante y el atenuador (aceptor) de la invencion se seleccionan preferiblemente de modo que los fragmentos donador y aceptor exhiban transferencia de energfa donador-aceptor cuando se excita la fraccion donadora. Un factor a tener en cuenta al elegir que el par fluoroforo-atenuador sea la eficiencia de la transferencia de energfa donador-aceptor entre ellos. Preferiblemente, la eficiencia de FRET entre las 45 fracciones donador y aceptor es al menos del 10%, mas preferiblemente al menos del 50% e incluso mas preferiblemente al menos del 80%. La eficacia de FRET se puede probar empmcamente facilmente utilizando los metodos descritos en la presente memoria y conocidos en la tecnica.

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La eficiencia de transferencia de ene^a entre el par donador-aceptor tambien puede ajustarse cambiando la capacidad de los grupos donador y aceptor para dimerizar o asociarse estrechamente. Si las fracciones donante y aceptora son conocidas o se determina que se asocian estrechamente, se puede promover un aumento o disminucion en la asociacion ajustando la longitud de una fraccion enlazadora, o de la propia sonda, entre el donante y el aceptor. La capacidad del par donador-aceptor para asociarse puede aumentarse o disminuirse ajustando las interacciones hidrofobas o ionicas, o las repulsiones estericas en el constructo de la sonda. De este modo, las interacciones intramoleculares responsables de la asociacion del par donador-aceptor pueden ser mejoradas o atenuadas. De este modo, por ejemplo, la asociacion entre el par donador-aceptor puede aumentarse, por ejemplo, utilizando un donante que porta una carga negativa total y un aceptor con una carga positiva total.

Ademas de los fluoroforos que se unen directamente a una sonda, los fluoroforos pueden unirse tambien por medios indirectos. En esta realizacion, una molecula de ligando (por ejemplo, biotina) se une generalmente covalentemente a la especie de sonda. El ligando se une entonces a otra molecula (por ejemplo, estreptavidina), que es inherentemente detectable o covalentemente unida a un sistema de senal, tal como un compuesto fluorescente, o una enzima que produce un compuesto fluorescente mediante la conversion de un compuesto no fluorescente. Las enzimas utiles de interes como marcadores incluyen, por ejemplo, hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, hidrolasas, peptidasas u oxidasas, particularmente peroxidasas, y los compuestos fluorescentes incluyen fluorescema y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc., como se ha discutido anteriormente. Para una revision de varios sistemas de etiquetado o produccion de senales que pueden usarse, vease, la patente estadounidense No. 4.391.904.

Los donantes actualmente preferidos de uso junto con BHQ, incluyen, por ejemplo, colorantes de xanteno, incluyendo fluorescemas, colorantes de cianina y colorantes de rodamina. Muchas formas adecuadas de estos compuestos estan ampliamente disponibles comercialmente con sustituyentes en sus fracciones fenilo, que pueden usarse como el sitio para la union o como la funcion de union para unir un acido nucleico. Otro grupo de compuestos fluorescentes preferidos son las naftilaminas, que tienen un grupo amino en la posicion alfa o beta. Incluidos entre estos compuestos naftilamino se encuentran 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftalensulfonato y 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato. Otros donantes incluyen 3-fenil-7-isocianatocumarina, acridinas, tales como 9-isotiocianatoacridina y naranja de acridina; N-(p-(2-benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazoles, estilbenos, pirenos, y similares.

Para mayor claridad de la ilustracion, la discusion se centra a continuacion en la union de BHQ y fluoroforos a acidos nucleicos. El enfoque en las sondas de acido nucleico no pretende limitar el alcance de las moleculas sonda a las que se pueden unir los BHQ. Los expertos en la tecnica apreciaran que los BHQ tambien pueden estar unidos a moleculas pequenas, protemas, peptidos, polfmeros sinteticos, soportes solidos y similares usando qmmica sintetica estandar.

En una realizacion actualmente preferida, en la que la sonda es una sonda de acido nucleico, la molecula informadora es un colorante de fluorescema (FAM). La fraccion de fluorescema esta unida preferiblemente al extremo 3' o 5' del acido nucleico, aunque los sitios internos tambien son accesibles y tienen utilidad para propositos seleccionados. Sea cual sea el terminal al que este unido el derivado de FAM, el bHq se unira generalmente a su antfpoda, o en una posicion interna a la cadena de acido nucleico. El donador de FAM se introduce preferiblemente usando una amidita 6- FAM. Tambien se introducen preferiblemente diferentes grupos donantes utilizando un derivado de amidita del donante. Alternativamente, los grupos donantes que comprenden grupos funcionales reactivos (por ejemplo, isotiocianatos, esteres activos, etc.) pueden introducirse por reaccion con un grupo funcional reactivo sobre un brazo de union o enlazador unido al acido nucleico (por ejemplo, hexilamina).

En otra realizacion preferida, la fraccion donante puede unirse en el extremo 3' de un acido nucleico mediante el uso de un soporte de smtesis sometido a derivacion. Por ejemplo, TAMRA (acido tetrametilrodamina carboxflico) esta unido a un extremo 3' de acido nucleico usando un soporte solido que forma un derivado con un analogo de este fluoroforo (Biosearch Technologies, Inc.).

En vista del cuerpo bien desarrollado de la literatura referente a la conjugacion de moleculas pequenas a acidos nucleicos, muchos otros metodos de fijacion de pares donador/aceptor a acidos nucleicos seran evidentes para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los colorantes de rodamina y fluorescema se unen convenientemente al 5'-hidroxilo de un acido nucleico al concluir la smtesis en fase solida por medio de colorantes que forman derivados con una fraccion de fosforamidita (vease, por ejemplo, Woo et al., patente estadounidense No. 5.231.191 y Hobbs, Jr., patente estadounidense No. 4.997.928).

Mas espedficamente, hay muchos fracciones enlazadoras y metodologfas para unir grupos a los terminales 5' o 3' de acidos nucleicos, como se ejemplifica mediante las siguientes referencias: Eckstein, editor, Nucleic acids and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acids Research, 15: 5305-5321 (1987) (grupo 3'-tiol sobre acido nucleico); Sharma et al., Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3'-sulfhidrilo); Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2: 223-227 (1993) y Fung et al., patente estadounidense No. 4.757.141 (grupo 5'- fosfoamino a traves de Aminolink TM II disponible a traves de P.E. Biosystems, CA); Stabinsky, patente estadounidense No. 4.739.044 (grupo 3-aminoalquilfosforilo); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (union mediante enlaces fosforamidato); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (grupo 5-mercapto); Nelson et al., Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (grupo 3'-amino), y similares.

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Los medios para detectar marcadores fluorescentes son bien conocidos por los expertos en la tecnica. As^ por ejemplo, se pueden detectar marcadores fluorescentes por excitacion del fluoroforo con la longitud de onda apropiada de luz y deteccion de la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede detectarse visualmente, por medio de una pelfcula fotografica, mediante el uso de detectores electronicos tales como dispositivos de acoplamiento de carga (CCD) o fotomultiplicadores y similares. De forma similar, los marcadores enzimaticos pueden detectarse proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reaccion resultante.

Grupos funcionales reactivos

Los componentes de los soportes solidos y oligomeros de la invencion (por ejemplo, enlazadores, fluoroforo, atenuadores, fraccion estabilizante estan unidos a traves de fragmentos de enlace formados por reaccion de un primer y un segundo grupo funcional reactivo. Los grupos funcionales reactivos son de reactividad complementaria y reaccionan para formar un enlace covalente entre dos componentes de los oligomeros a los que se hace referencia en la presente memoria como un fragmento de enlace. Con referencia al soporte solido de Formula I, el grupo funcional reactivo se encuentra en precursores de L1, L2 y L3, asf como en precursores de Q, Za y Xa. En varios ejemplos, Xa y L1 estan unidos covalentemente a traves de un fragmento de enlace; L2 y Za estan unidos por un fragmento de enlace; L3 y Q estan unidos por un fragmento de enlace, cada fragmento de enlace formado por reaccion de grupos funcionales reactivos sobre los precursores de los componentes nombrados de los oligomeros. Los fragmentos de enlace estan presentes en grupos similares de los oligomeros de Formulas VII y VIII.

Con respecto a los precursores de los componentes de soportes solidos, fosforamiditas y oligomeros, los grupos funcionales reactivos pueden situarse en cualquier posicion sobre estos precursores, por ejemplo, un alquilo o heteroalquilo, un nucleo arilo o heteroarilo o un sustituyente en un nucleo arilo o heteroarilo. De manera similar, un grupo funcional reactivo esta situado en cualquier posicion de una cadena de alquilo o heteroalquilo. En varias realizaciones, cuando el grupo reactivo esta unido a una cadena de alquilo (o heteroalquilo) o cadena de alquilo sustituida (o heteroalquilo), el grupo reactivo se situa preferiblemente en una posicion terminal de la cadena.

Los grupos reactivos y clases de reacciones utiles en la practica de la presente invencion son generalmente aquellos que son bien conocidos en la tecnica de la qrnmica de bioconjugados. Las clases de reacciones actualmente favorecidas disponibles con precursores reactivos de los oligomeros son aquellas que se desarrollan en condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofflicas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, esteres activos), sustituciones electrofflicas (por ejemplo, reacciones de enamina) y adiciones a enlaces multiples carbono-carbono y carbono-heteroatomo (por ejemplo, reaccion Michael, adicion de Diels-Alder). Estas y otras reacciones utiles se discuten, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3a Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

A modo de ejemplo, los grupos funcionales reactivos de uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a olefinas, acetilenos, alcoholes, fenoles, eteres, oxidos, haluros, aldehfdos, cetonas, acidos carboxflicos, esteres, amidas, cianatos, isocianatos, tiocianatos, isotiocianatos, aminas, hidrazinas, hidrazonas, hidrazidas, diazo, diazonio, nitro, nitrilos, mercaptanos, sulfuros, disulfuros, sulfoxidos, sulfonas, acidos sulfonicos, acidos sulfmicos, acetales, cetales, anhfdridos, sulfatos, acidos sulfenicos, isonitrilos, amidinas, imidas, imidatos, nitronas, hidroxilaminas, oximas, acidos hidroxamicos, acidos tiohidroxamicos, alenos, ortoesteres, sulfitos, enaminas, inaminas, ureas, pseudoureas, semicarbazidas, carbodiimidas, carbamatos, iminas, azidas, compuestos azo, compuestos azoxi, y compuestos nitroso. Los grupos funcionales reactivos tambien incluyen los utilizados para preparar bioconjugados, por ejemplo, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas y similares. Los metodos para preparar cada uno de estos grupos funcionales son bien conocidos en la tecnica y su aplicacion o modificacion para un proposito particular esta dentro de la capacidad de un experto en la tecnica (vease, por ejemplo, Sandler and Karo, editores ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989).

Las conversiones de grupos funcionales reactivos utiles incluyen, por ejemplo:

(a) grupos carboxilo que se convierten facilmente en diversos derivados incluyendo, pero sin limitarse a, esteres activos (por ejemplo, esteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de N-hidroxibenzotriazol, tioesteres, esteres de p-nitrofenilo), haluros de acido, imidazoles de acilo, alquilo alquenilo, alquinilo y esteres aromaticos;

(b) grupos hidroxilo, que pueden convertirse en esteres, eteres, haluros, aldehfdos, etc.

(c) grupos haloalquilo, en donde el haluro puede desplazarse posteriormente con un grupo nucleofflico tal como, por ejemplo, una amina, un anion carboxilato, un anion tiol, un carbanion o un ion alcoxido, resultando de este modo en la union covalente de un nuevo grupo en el sitio del atomo de halogeno;

(d) grupos dienofilos, que son capaces de participar en reacciones de Diels-Alder tales como, por ejemplo, grupos maleimido;

(e) grupos aldehfdo o cetona, de tal manera que es posible la posterior formacion de derivados mediante la formacion de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o a traves de

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mecanismos tales como adicion de Grignard o adicion de alquil-litio;

(f) grupos haluro de sulfonilo para reaccion posterior con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas;

(g) grupos tiol, que pueden ser, por ejemplo, convertidos en disulfuros o reaccionar con haluros de acilo;

(h) grupos amina o sulfhidrilo, que pueden ser, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados;

(i) alquenos, que pueden experimental por ejemplo, cicloadiciones, acilacion, adicion de Michael, etc.;

(j) epoxidos, que pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxilo; y

(k) fosforamiditas y otros grupos funcionales estandar utiles en la smtesis de acidos nucleicos.

Los grupos funcionales reactivos pueden elegirse de tal manera que no participan ni interfieran en las reacciones necesarias para ensamblar el oligomero. Alternativamente, un grupo funcional reactivo puede estar protegido de participar en la reaccion por la presencia de un grupo protector. Los expertos en la tecnica entienden como proteger un grupo funcional particular de tal manera que no interfiera con un conjunto elegido de condiciones de reaccion. Para ejemplos de grupos protectores utiles, vease, por ejemplo, Greene et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991.

Fraccion de union covalente

Incluido en algunos de los oligomeros esta una fraccion de grupo funcional reactivo que es capaz de efectuar al menos un enlace covalente entre el oligomero y una secuencia objetivo. Pueden formarse tambien multiples enlaces covalentes proporcionando una multiplicidad de tales fracciones. El enlace covalente es preferiblemente un residuo de base en la cadena objetivo, pero tambien puede hacerse con otras porciones del objetivo, incluyendo el azucar o fosfodiester. La naturaleza de la reaccion de la fraccion que efectua el entrelazador determina la naturaleza del objetivo en el duplex. Las fracciones entrelazadoras preferidas incluyen agentes acilantes y alquilantes, y en particular, aquellos situados en relacion con la porcion que confiere especificidad de secuencia, de manera que permitan la reaccion con la posicion objetivo en la cadena.

La fraccion entrelazadora puede colocarse convenientemente como un residuo de pirimidina o purina analogo en la secuencia del oligomero. La colocacion puede estar en los extremos 5' y/o 3', las porciones internas de la secuencia, o combinaciones de las anteriores. Se prefiere la colocacion en los terminales para permitir una mayor flexibilidad. Tambien se pueden unir fracciones analogas a las cadenas principales del peptido.

Ejemplos de fracciones alquilantes que son utiles incluyen N4,N4-etanocitosina y N6,N6-etanoadenina.

Es evidente que la base no necesita ser una purina o pirimidina; en realidad la fraccion a la cual esta unida la funcion reactiva no necesita ser una base en absoluto y puede ser un azucar, un enlazador, un atenuador, una fraccion estabilizante, un fluoroforo o alguna combinacion de estos componentes de los oligomeros de la invencion. Cualquier medio de fijacion del grupo reactivo es satisfactorio siempre y cuando el posicionamiento sea correcto.

Smtesis

Los soportes solidos, monomeros (por ejemplo, fosforamiditas) y oligomeros o sus segmentos son generalmente sintetizados convencionalmente. Los metodos sinteticos conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria pueden usarse para sintetizar oligomeros que contienen bases de la invencion, asf como otras bases conocidas en la tecnica, usando nucleomonomeros adecuadamente protegidos. Los metodos para la smtesis de oligomeros se encuentran, por ejemplo, en Froehler, B., et al., Nucleic Acids Res. (1986) 14: 5399-5467; Nucleic Acids Res. (1988) 16: 4831-4839; Nucleosides and Nucleotides (1987) 6: 287-291; Froehler, B., Tetrahedron Letters (1986) 27: 5575-5578; Caruthers, M.H. en Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression (1989), J. S. Cohen, editor, CRC Press, Boca Raton, paginas 7-24; Reese, C. B. et al., Tetrahedron Letters (1985) 28: 2245-2248. Tambien se ha descrito la smtesis de los oligomeros unidos a metilfosfonatos a traves de la qmmica del metilfosfonamidita (Agrawal, S. et al., Tetrahedron Letters (1987) 28: 3539-3542, Klem, RE, et al., publicacion internacional Numero WO 92/07864).

Un ejemplo de smtesis de un soporte solido se expone en la Figura 1, la Figura 2 y los ejemplos adjuntos.

En un ejemplo de realizacion, los nucleomonomeros son incorporados directamente en oligomeros o un fragmento conveniente de los mismos usando condiciones y reactivos de smtesis estandar. Los ejemplos de enlaces realizados por este metodo incluyen fosfodiester, fosforotioato, fosforoamidato, metilfosfonato, fosforoditioato, carbonato, morfolino carbamato y sulfonato.

En varias realizaciones, la smtesis implica la smtesis de sintones cortos (dfmeros, tnmeros, etc.) partiendo de un precursor apropiado. Este enfoque es adecuado para la smtesis de enlaces incluyendo N-metilhidroxilamina, dimetilhidrazo, sulfamato, carbamato, sulfonato, sulfonamida, formacetal, tioformacetal y carbonato.

Los oligomeros se pueden sintetizar por cualquier qmmica adecuada que incluya metodos y condiciones de

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acoplamiento de amidita, triester o fosfonato de hidrogeno. Los oligomeros se sintetizan preferiblemente a partir de sintones de partida apropiados que estan preferiblemente protegidos en la posicion 5' con DMT, MMT, FMOC (9- fluorenilmetoxicarbonilo), PACO (fenoxiacetilo), un silil eter tal como TBDMS (t-butildifenilsililo) o TMS (trimetilsililo) y activado en la posicion 3' es un ester, H-fosfonato, una amidita tal como p-cianoetilfosforamidita, un silil eter tal como TBDMS o TMS o t-butildifenilo. Alternativamente, los precursores apropiados de uridina o citidina tales como 5-yodo-2'- desoxiuridina, 5-yodo-2'-O-alquiluridina, 5-bromo-2'-desoxiuridina, 5-trifluorometanosulfonato-2'-desoxiuridina, 5- bromo- 2'-O-alquiluridina bloqueadas o 5-yodo-2'-desoxicitidina, 5-bromo-2'-desoxicitidina, 5-trifluorometanosulfonato-2'- desoxicitidina, 5-yodo-2'-O-alquilcitidina, 5-bromo-2'-O-alquilcitidina bloqueadas y protegidas pueden incorporarse convenientemente en oligomeros cortos tales como sintones dfmeros, tnmeros, tetrameros, pentameros o sintones mas largos que posteriormente forman derivados para producir sintones adecuados y oligomeros mas largos.

Los ejemplos de smtesis de oligomeros que contienen aproximadamente 4 o mas residuos de nucleomonomero se llevan a cabo usando sintones tales como monomeros, dfmeros o tnmeros que portan un grupo de acoplamiento adecuado para su uso con qmmicas de amidita, H-fosfonato o trigliceridos. El sinton puede usarse para unir los componentes del oligomero a traves de un fosfodiester o un enlace que contiene fosforo distinto del fosfodiester (por ejemplo, fosforotioato, metilfosfonato, tionometilfosfonato, fosforamidato y similares).

La smtesis de otros enlaces sustituidos que no contienen fosforo puede llevarse a cabo usando precursores apropiados como se conoce en la tecnica.

Una vez que se sintetiza el acido nucleico deseado, se escinde preferiblemente del soporte solido sobre el cual fue sintetizado y tratado, por metodos conocidos en la tecnica, para eliminar cualquier grupo protector presente (por ejemplo, 60°C, 5 h, amomaco concentrado). En aquellas realizaciones en las que un grupo sensible a la base esta unido a los acidos nucleicos (por ejemplo, TAMRA), la desproteccion utilizara preferiblemente condiciones mas suaves (por ejemplo, butilamina:agua 1:3, 8 horas, 70°C). La desproteccion bajo estas condiciones se facilita mediante el uso de amiditas de desproteccion rapida (por ejemplo, dC-acetilo, dG-dmf).

Despues de la escision del soporte y de la desproteccion, el acido nucleico se purifica por cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo cromatograffa, extraccion y purificacion en gel. En una realizacion preferida, el acido nucleico se purifica usando HPLC. La concentracion y pureza del acido nucleico aislado se determina preferiblemente midiendo la densidad optica a 260 nm en un espectrofotometro.

Ensayos y sondas oligomericas de la invencion

En este documento se describe un oligomero de uso en uno o mas formatos de ensayo. En realizaciones seleccionadas, el oligomero participa en la generacion de una senal detectable al asociarse o disociarse de su objetivo. Las sondas oligomericas de la invencion no estan limitadas en su uso a ningun formato de ensayo particular. Por consiguiente, la siguiente descripcion pretende ilustrar ejemplos de formatos de ensayo en los que los oligomeros de la invencion encuentran uso, y no pretenden ser limitativos de los formatos de ensayo en los que los oligomeros son utiles.

Ensayos

La discusion siguiente es generalmente relevante para los ensayos descritos en la presente memoria. Esta exposicion pretende ilustrar la invencion haciendo referencia a ciertas realizaciones preferidas y no debe ser interpretada como limitante del alcance de las sondas y tipos de ensayo en los que los compuestos encuentran uso. Otros formatos de ensayo que utilizan los compuestos seran evidentes para los expertos en la tecnica.

En general, para determinar la concentracion de una molecula objetivo, tal como, por ejemplo, un acido nucleico, es preferible obtener primero datos de referencia en los que se ponen en contacto cantidades constantes de sonda y ligando de acido nucleico con cantidades variables del objetivo. La emision de fluorescencia de cada una de las mezclas de referencia se utiliza para derivar un grafico o tabla en el que la concentracion objetivo se compara con la emision de fluorescencia. Por ejemplo, una sonda que: a) se hibrida con un ligando de acido nucleico exento de objetivo; y b) tiene una arquitectura de tallo-bucle siendo los terminales 5' y 3' los sitios del grupo fluorescente y el etiquetado de BHQ, puede usarse para obtener tales datos de referencia. Dicha sonda proporciona un perfil de emision caractenstico en el que la emision de fluorescencia disminuye a medida que la concentracion objetivo aumenta en presencia de una cantidad constante de sonda y ligando de acido nucleico. A continuacion, se pone en contacto una mezcla de ensayo con una cantidad desconocida del objetivo con la misma cantidad del primer ligando de acido nucleico y la segunda sonda, y se determina la emision de fluorescencia. El valor de la emision de fluorescencia se compara entonces con los datos de referencia para obtener la concentracion del objetivo en la mezcla de ensayo.

Analisis de multiplex

En otra realizacion, los soportes solidos y oligomeros se utilizan como una sonda o un componente de una o mas sondas utilizadas en un ensayo de multiplex para detectar una o mas especies en una mezcla.

Las sondas basadas en los soportes solidos u oligomeros son particularmente utiles en la realizacion de analisis y ensayos de tipo multiplex. En un analisis tfpico de multiplex, se detectan dos o mas especies distintas (o regiones de una o mas especies) usando dos o mas sondas, en donde cada una de las sondas esta marcada con un fluoroforo

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diferente. Las especies preferidas utilizadas en los analisis de multiplex que dependen de la transferencia de ene^a donador-aceptor cumplen al menos dos criterios: la especie fluorescente es brillante y espectralmente bien resuelta; y la transferencia de energfa entre las especies fluorescentes y el atenuador es eficiente.

Los soportes solidos y oligomeros permiten el diseno de ensayos de multiplex en los que se utiliza mas de una estructura de atenuacion en el ensayo. Un numero de diferentes ensayos de multiplex utilizando los soportes solidos u oligomeros sera evidente para un experto en la tecnica. En un ejemplo de ensayo, cada uno de al menos dos atenuadores distintos se utiliza para atenuar la energfa derivada de uno o mas fluoroforos identicos. Alternativamente, se puede practicar un ensayo en el que cada atenuador distinto atenua la energfa derivada de un fluoroforo distinto al cual se "ajusta" el atenuador. Los fluoroforos pueden unirse a la misma molecula que el atenuador o a una molecula diferente. Ademas, de forma similar al agente atenuador y los fluoroforos, las moleculas portadoras de uso en un sistema de ensayo particular pueden ser iguales o diferentes.

Ademas de las mezclas descritas anteriormente, en la presente invencion se describe un metodo para detectar o cuantificar una especie molecular particular. El metodo incluye: (a) poner en contacto la especie con una mezcla que contiene un soporte solido u oligomero; y (b) detectar un cambio en una propiedad fluorescente de uno o mas componentes de la mezcla resultante, detectando o cuantificando asf las especies moleculares.

El uso simultaneo de dos o mas sondas utilizando transferencia de energfa donador-aceptor es conocido en la tecnica. Por ejemplo, se han descrito ensayos de multiplex utilizando sondas de acido nucleico con diferentes especificidades de secuencias. Se han utilizado sondas fluorescentes para determinar si un individuo es homocigotico de tipo silvestre, mutante homocigotico o heterocigotico para una mutacion particular. Por ejemplo, usando una baliza molecular atenuada de fluorescema que reconoce la secuencia de tipo silvestre y otra baliza molecular atenuada con rodamina que reconoce un alelo mutante, es posible determinar el genotipo de individuos para el receptor de la quimioquina p (Kostrikis et al., Science 279: 1228-1229 (1998)). La presencia de solo una senal de fluorescema indica que el individuo es de tipo silvestre, y la presencia de la senal de rodamina solo indica que el individuo es un mutante homocigotico. La presencia de la senal de rodamina y fluorescema es el diagnostico de un heterocigoto. Tyagi et al. Nature Biotechnology 16: 49-53 (1998)) han descrito el uso simultaneo de cuatro balizas moleculares marcadas de forma diferente para la discriminacion de alelos, y Lee et al., BioTechniques 27: 342-349 (1999) han descrito la deteccion homogenea de siete colores de seis productos de la PCR.

Los atenuadores se pueden utilizar en ensayos de multiplex disenados para detectar y/o cuantificar sustancialmente cualquier especie, incluyendo, por ejemplo, celulas enteras, virus, protemas (por ejemplo, enzimas, anticuerpos, receptores), glicoprotemas, lipoprotemas, partmulas subcelulares, organismos (por ejemplo, Salmonella), acidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN y analogos de los mismos), polisacaridos, lipopolisacaridos, lfpidos, acidos grasos, polfmeros no biologicos y moleculas pequenas (por ejemplo toxinas, farmacos, pesticidas, metabolitos, hormonas, alcaloides, esteroides).

Sondas de acido nucleico

Los soportes solidos y oligomeros son sondas utiles de acidos nucleicos y se pueden usar como componentes de agentes de deteccion en una variedad de estrategias de amplificacion/cuantificacion de ADN que incluyen, por ejemplo, el ensayo de 5'-nucleasa, la amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos (NASBA), amplificacion de drculos rodantes (RCA), asf como para la deteccion directa de objetivos en ensayos en fase de disolucion o fase solida (por ejemplo, una matriz). Ademas, los soportes solidos y oligomeros pueden utilizarse en sondas de practicamente cualquier formato, incluyendo, por ejemplo, un formato seleccionado de balizas moleculares, sondas ScorpionMR, sondas SunriseMR, sondas conformacionalmente asistidas, sondas LightUp, sondas de deteccion de invasores y sondas TaqManMR. Vease, por ejemplo, Cardullo, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. Chem. Physics, 21: 836-850 (1953); Hochstrasser, R.A., et al., Biophysical Chemistry, 45: 133-141 (1992); Selvin, P., Methods in Enzymology, 246: 300-334 (1995); Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem., 40: 83-114 (1971); Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47: 819-846 (1978); Wang, G., et al., Tetrahedron Letters, 31: 6493-6494 (1990); Wang, Y., et al., Anal. Chem., 67: 1197-1203 (1995); Debouck, C., et al., en Supplement to Nature Genetics, 21: 48-50 (1999); Rehman, F.N., et al., Nucleic Acids Research, 27: 649-655 (1999); Cooper, J.P., et al., Biochemistry, 29: 9261-9286 (1990); Gibson, E.M., et al., Genome Methods, 6: 995-1101 (1996); Hochstrasser, R.A., et al., Biophysical Chemistry, 45: 133-141 (1992); Holland, P.M., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA, 88: 7276-7289 (1991); Lee, L.G., et al., Nucleic Acids Rsch., 21: 3761-3766 (1993); Livak, K.J., et al., PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Press (1995); Vamosi, G., et al., Biophysical Journal, 71: 972-994 (1996); Wittwer, C.T., et al., Biotechniques, 22: 176-181 (1997); Wittwer, C.T., et al., Biotechniques, 22: 130-38 (1997); Giesendorf, B.A.J., et al., Clinical Chemistry, 44: 482-486 (1998); Kostrikis, L.G., et al., Science, 279: 1228-1229 (1998); Matsuo, T., Biochemica y Biophysica Acta, 1379: 178-184 (1998); Piatek, A.S., et al., Nature Biotechnology, 16: 359-363 (1998); Schofield, P., et al., Appl. Environ. Microbiology, 63: 1143-1147 (1997); Tyagi S., et al., Nature Biotechnology, 16: 49-53 (1998); Tyagi, S., et al., Nature Biotechnology, 14: 303-308 (1996); Nazarenko, I.A., et al., Nucleic Acids Research, 25: 2516-2521 (1997); Uehara, H., et al., Biotechniques, 26: 552-558 (1999); D. Whitcombe, et al., Nature Biotechnology, 17: 804-807 (1999); Lyamichev, V., et al., Nature Biotechnology, 17: 292 (1999); Daubendiek, et al., Nature Biotechnology, 15: 273277 (1997); Lizardi, P.M., et al., Nature Genetics, 19: 225-232 (1998); Walker, G., et al., Nucleic Acids Res., 20: 1691169 6 (1992); Walker, G.T., et al., Clinical Chemistry, 42: 9-13 (1996); y Compton, J., Nature, 350: 91-92 (1991).

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Por lo tanto, en la presente memoria se describe un metodo para detectar una secuencia objetivo de acido nucleico. El metodo incluye: (a) poner en contacto la secuencia objetivo con un acido nucleico detector (por ejemplo, un oligomero de la invencion); (b) hibridar la secuencia de union objetivo con la secuencia objetivo, alterando con ello la conformacion del acido nucleico detector, provocando un cambio en un parametro de fluorescencia; y (c) detectar el cambio en el parametro de fluorescencia, detectando de este modo la secuencia objetivo de acido nucleico.

En los metodos descritos en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, un acido nucleico detector preferido incluye una secuencia de union al objetivo monocatenario. La secuencia de union se ha unido a los mismos: i) un fluoroforo; y ii) un atenuador; y iii) una fraccion estabilizante. Ademas, antes de su hibridacion con una secuencia complementaria, el acido nucleico detector esta preferiblemente en una conformacion que permite la transferencia de energfa donador-aceptor entre el fluoroforo y el atenuador cuando se excita el fluoroforo. Ademas, en cada uno de los metodos descritos en esta seccion, se detecta un cambio en la fluorescencia como una indicacion de la presencia de la secuencia objetivo. El cambio en la fluorescencia se detecta preferiblemente en tiempo real.

Las sondas de acido nucleico actualmente preferidas no requieren que el acido nucleico adopte una estructura secundaria para que funcione la sonda. En este metodo, y a menos que se indique otra cosa, los otros metodos descritos en esta seccion, el acido nucleico detector puede asumir sustancialmente cualquier estructura secundaria asociada en forma intramolecular, pero esta estructura es preferiblemente un miembro seleccionado de horquillas, estructuras tallo-bucle, pseudo-nudos, helices triples y estructuras conformacionalmente asistidas. Ademas, la estructura secundaria emparejada en forma intramolecular preferiblemente comprende una porcion de la secuencia de union objetivo.

En otro aspecto, se describe aqrn un metodo para detectar la amplificacion de una secuencia objetivo. El metodo incluye el uso de una reaccion de amplificacion que incluye las siguientes etapas: (a) hibridacion de la secuencia objetivo y un acido nucleico detector. El acido nucleico detector incluye una secuencia de union objetivo monocatenaria y una estructura secundaria 5' asociada en forma intramolecular a la secuencia de union objetivo. Al menos una porcion de la secuencia detectora forma una cola de cadena sencilla que esta disponible para hibridacion con la secuencia objetivo; (b) extender el acido nucleico detector hibridado sobre la secuencia objetivo con una polimerasa para producir un producto de extension de acido nucleico detector y separar el producto de extension de acido nucleico detector de la secuencia objetivo; (c) hibridar un cebador con el producto de extension de acido nucleico detector y extender el cebador con la polimerasa, linealizando de este modo la estructura secundaria asociada en forma intramolecular y produciendo un cambio en un parametro de fluorescencia; y (d) detectar el cambio en el parametro de fluorescencia, detectando de este modo la secuencia objetivo.

En aun otro aspecto, se describe aqrn un metodo para determinar si un primer acido nucleico y un segundo acido nucleico se hibridan. En este metodo, el primer acido nucleico es un oligomero (en solucion o unido a un soporte solido). El metodo incluye: (a) poner en contacto el primer acido nucleico con el segundo acido nucleico; (b) detectar una alteracion en una propiedad fluorescente de un miembro seleccionado entre el primer acido nucleico, el segundo acido nucleico y una combinacion de los mismos, comprobando asf si tiene lugar la hibridacion.

En diversas realizaciones, la presente invencion proporciona sondas y metodos de uso para detectar un polimorfismo en secuencias objetivo de acido nucleico. Polimorfismo se refiere a la aparicion de dos o mas secuencias alternativas o alelos geneticamente determinados en una poblacion. Un marcador o sitio polimorfico es el lugar en el que se produce la divergencia. Los marcadores preferidos tienen al menos dos alelos, cada uno de los cuales se presenta con una frecuencia mayor al 1%, y mas preferiblemente mayor al 10% o 20% de una poblacion seleccionada. Un locus polimorfico puede ser tan pequeno como un par de bases. Los marcadores polimorficos incluyen polimorfismos de longitud del fragmento de restriccion, un numero variable de repeticiones en tandem (VNTR), regiones hipervariables, minisatelites, repeticiones de dinucleotidos, repeticiones de trinucleotidos, repeticiones de tetranucleotidos, repeticiones de secuencia simple y elementos de insercion tales como Alu. La primera forma alelica identificada se designa arbitrariamente como la forma de referencia y las otras formas alelicas se designan como alelos alternativos o variantes. La forma alelica que se presenta con mas frecuencia en una poblacion seleccionada se conoce a veces como la forma de tipo silvestre. Los organismos diploides pueden ser homocigoticos o heterocigotos para las formas alelicas. Un polimorfismo dialelico tiene dos formas. Un polimorfismo trialelico tiene tres formas.

En un ejemplo de realizacion, se utiliza una sonda de la invencion para detectar un polimorfismo de un solo nucleotido. Un polimorfismo de un solo nucleotido se produce en un sitio polimorfico ocupado por un solo nucleotido, que es el sitio de variacion entre las secuencias alelicas. El sitio esta usualmente precedido por y seguido por secuencias altamente conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que vanan en menos de 1/100 o 1/1000 miembros de las poblaciones). Normalmente, un polimorfismo de un solo nucleotido surge debido a la sustitucion de un nucleotido por otro en el sitio polimorfico. Una transicion es la sustitucion de una purina por otra purina o una pirimidina por otra pirimidina. Una transversion es la sustitucion de una purina por una pirimidina o viceversa. Los polimorfismos de un solo nucleotido tambien pueden surgir de una supresion de un nucleotido o de una insercion de un nucleotido con respecto a un alelo de referencia.

Se puede usar un oligomero que porta tanto un atenuador como un fluoroforo o, alternativamente, uno o mas de los acidos nucleicos pueden marcarse individualmente con un unico miembro de un par de transferencia de energfa (por ejemplo, un atenuador o fluoroforo). Cuando un acido nucleico marcado individualmente con un atenuador es la sonda,

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la interaccion entre el primer y el segundo acidos nucleicos puede detectarse observando la interaccion entre el atenuador y el acido nucleico o, mas preferiblemente, la atenuacion por el atenuador de la fluorescencia de un fluoroforo unido al segundo acido nucleico.

Ademas de su utilidad general en sondas disenadas para investigar la amplificacion, polimorfismo y deteccion y cuantificacion de acido nucleico, los presentes soportes solidos y oligomeros pueden usarse en practicamente cualquier formato de sonda de acido nucleico actualmente conocido o descubierto posteriormente. Por ejemplo, los soportes solidos y oligomeros de la invencion se pueden incorporar en motivos de sonda, tales como sondas TaqManMR (Held et al., Genome Res. 6: 986-994 (1996), Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991), Lee et al., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993)), balizas moleculares (Tyagi et al., Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996), Jayasena et al., patente estadounidense No. 5.989.823, publicada el 23 de noviembre de 1999)), sondas Scorpion (Whitcomb et al., Nature Biotechnology 17: 804-807 (1999)), sondas Sunrise (Nazarenko et al., Nucleic Acids Res. 25: 2516-2521 (1997)), sondas asistidas por conformacion (Cook, R., solicitud de patente estadounidense en tramite y asignada en forma comun US 2007/0059752, presentada el 9 de junio de 1999), sondas LightUp basadas en acido peptidonucleico (Kubista et al., WO 97/45539, diciembre de 1997), colorantes de ADN espedficos bicatenarios (Higuchi et al., Bio/Technology 10: 413-417 (1992), Wittwer et al., BioTechniques 22: 130-138 (1997)) y similares. Estos y otros motivos de sonda con los cuales se pueden usar los presentes atenuadores se revisan en NONISOTOPIC DNA PROBE TECHNIQUES, Academic Press, Inc. 1992.

Los oligomeros para uso en las sondas de la invencion pueden tener cualquier tamano adecuado y estan preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleotidos, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 nucleotidos y mas preferiblemente todavfa, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleotidos. En las sondas etiquetadas doblemente (fluoroforo-atenuador), la fraccion donante se separa preferiblemente del atenuador por al menos aproximadamente 6, preferiblemente por lo menos aproximadamente 8, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10 nucleotidos, y mas preferiblemente por al menos aproximadamente 15 nucleotidos. En diversas realizaciones, la fraccion donante esta unida preferiblemente a los nucleotidos terminales 3' o 5' de la sonda. La fraccion atenuadora tambien esta unida preferiblemente a los nucleotidos terminales 3' o 5' de la sonda. Mas preferiblemente, los fracciones donante y aceptora se unen a los nucleotidos de los terminales 3' y 5' o 5' y 3' de la sonda, respectivamente, aunque tambien es util la colocacion interna.

La secuencia y longitud precisas de una sonda de acido nucleico de la invencion depende en parte de la naturaleza del polinucleotido objetivo al que se une. La posicion y la longitud de union pueden variarse para conseguir las propiedades adecuadas de hibridacion y de fusion para una realizacion particular. En muchas de las referencias reconocidas en la tecnica se pueden encontrar grnas para tomar tales decisiones de diseno.

En algunas realizaciones, el nucleotido del terminal 3' de la sonda de acido nucleico se bloquea o se hace incapaz de extension por una polimerasa de acido nucleico. Dicho bloqueo se lleva a cabo convenientemente mediante la union de una fraccion donadora o aceptora a la posicion del terminal 3' de la sonda de acido nucleico, ya sea directamente o mediante una fraccion enlazadora.

El acido nucleico puede comprender ADN, ARN o mezclas quimericas o derivados o versiones modificadas de los mismos. Tanto la sonda como el acido nucleico objetivo pueden estar presentes como una cadena simple, duplex, triplex, etc. Ademas, el acido nucleico puede modificarse en la fraccion de la base, la fraccion de azucar o la cadena principal de fosfato con otros grupos tales como etiquetas radioactivas, aglutinantes del surco menor, agentes de intercalacion, hidrocarburos acetilenicamente insaturados, grupos fluoroalquilo, fracciones donantes y/o aceptoras y similares.

Los oligomeros son utiles como cebadores que son secuencias discretas o como cebadores con una secuencia aleatoria. Los cebadores de secuencia aleatoria tienen generalmente aproximadamente 6 o 7 nucleomonomeros de longitud. Dichos cebadores pueden usarse en diversos protocolos de amplificacion de acidos nucleicos (PCR, reaccion en cadena de ligasa, etc.) o en protocolos de clonacion. Las sustituciones en posicion 5 de la invencion generalmente no interfieren con la capacidad del oligomero para funcionar como cebador. Los oligomeros de la invencion que tienen modificaciones 2' en sitios distintos del residuo terminal 3', otras modificaciones que hacen que el oligomero RNasa H sea incompetente o bien estable a la nucleasa puede usarse ventajosamente como sondas o cebadores para secuencias de ARN o ADN en extractos celulares u otras soluciones que contienen nucleasas. De este modo, se pueden usar los oligomeros en protocolos para amplificar el acido nucleico en una muestra mezclando el oligomero con una muestra que contiene acido nucleico objetivo, seguido por hibridacion del oligomero con el acido nucleico objetivo y amplificacion del acido nucleico objetivo por PCR, LCR u otros metodos adecuados.

Los oligomeros sometidos a derivacion con agentes quelantes tales como EDTA, DTPA o analogos de acido 1,2- diaminociclohexano-acetico pueden utilizarse en diversos ensayos de diagnostico in vitro como se describe (patentes estadounidenses Nos. 4.772.548, 4.707.440 y 4.707.352). Alternativamente, los oligomeros pueden someterse a derivacion con agentes entrelazadores tales como 5-(3-yodoacetamidoprop-1-il)-2'-desoxiuridina o 5-(3-(4- bromobutiramido)prop-1-il)-2'-desoxiuridina y utilizado en diversos metodos o kits de ensayo como se describe (publicacion internacional No. WO 90/14353).

Ademas de los usos anteriores, la capacidad de los oligomeros para inhibir la expresion genica puede verificarse en

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sistemas in vitro midiendo los niveles de expresion en celulas objetivo o en sistemas recombinantes, mediante cualquier metodo adecuado (Graessmann, M. et al., Nucleic Acids Res. (1991) 19: 53-59).

Las condiciones que favorecen la hibridacion entre el oligomero y moleculas de acido nucleico objetivo pueden determinarse empmcamente por los expertos en la tecnica y pueden incluir temperatures optimas de incubacion, concentraciones de sales, composiciones de duracion y base de sondas de analogos de oligonucleotidos y concentraciones de moleculas de oligomeros y acidos nucleotidos de la muestra. Preferiblemente, la hibridacion se realiza en presencia de al menos magnesio 1 milimolar y a un pH que esta por encima de 6,0. En algunas realizaciones, puede ser necesario o deseable tratar una muestra para hacer que las moleculas de acido nucleico en la muestra sean monocatenarias antes de la hibridacion. Ejemplos de tales tratamientos incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con base (preferiblemente seguido de neutralizacion), incubacion a alta temperatura o tratamiento con nucleasas.

Ademas, debido a que la dependencia de la sal de la hibridacion con los acidos nucleicos esta determinada en gran medida por la densidad de carga de la cadena principal de un analogo de oligonucleotido de hibridacion, aumentando la relacion de los monomeros de pPNA en un oligomero de HypNA-pPNA o un oligomero de SerNA-pPNA puede aumentar la dependencia de sal de la hibridacion. Esto puede usarse ventajosamente en los metodos aqrn descritos en los que puede ser deseable en algunos aspectos poder aumentar la rigurosidad de la hibridacion cambiando las condiciones de salinidad, por ejemplo, o liberar un acido nucleico hibridado reduciendo la concentracion de sal. En aun otros aspectos de la presente invencion, puede ser deseable tener una union de alta afinidad de un analogo de oligonucleotido de la presente invencion con un acido nucleico en condiciones de baja salinidad. En este caso, es ventajoso mantener una proporcion cercana a 1:1 de monomeros de HypNA con respecto a pPNA en un analogo de oligonucleotido de la presente invencion.

El alto grado de especificidad de oligomeros en la union a moleculas de acido nucleico objetivo le permite al especialista seleccionar condiciones de hibridacion que pueden favorecer la discriminacion entre secuencias de acido nucleico que comprenden un tramo de secuencia que es completamente complementaria a al menos una porcion de uno o mas oligomeros y moleculas de acido nucleico objetivo que comprenden un tramo de secuencia que comprende un numero pequeno de bases no complementarias dentro de una secuencia sustancialmente complementaria. Por ejemplo, se pueden seleccionar temperaturas de hibridacion o de lavado que permitan tubridos estables entre moleculas de oligomero y acido nucleico objetivo que son completamente complementarias a lo largo de un tramo de secuencia, pero promueven la disociacion de hfbridos entre moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo que no son completamente complementarias, incluyendo aquellas que comprenden uno o dos faltas de correspondencia de las bases a lo largo de un tramo de secuencia complementaria. La seleccion de una temperatura para la hibridacion y los lavados puede depender, al menos en parte, de otras condiciones, tales como la concentracion de sal, la concentracion de moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo, las proporciones relativas de moleculas de oligomero con respecto a las de acido nucleico, la longitud de los oligomeros a hibridar, la composicion base de las moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo, la composicion monomerica de las moleculas analogas de oligonucleotidos, etc. Ademas, al seleccionar condiciones que favorezcan hfbridos estables de moleculas completamente complementarias y desfavorecen hfbridos estables entre moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo que no estan emparejadas por una o mas bases, pueden tenerse en cuenta condiciones adicionales y, cuando se desee, alteradas, incluyendo pero sin limitarse a, la longitud del analogo de oligonucleotido a hibridar, la longitud del tramo de secuencia de complementariedad entre moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo, el numero de las bases no complementarias dentro de un tramo de secuencia de complementariedad, la identidad de bases no coincidentes, la identidad de bases en la proximidad de las bases no emparejadas, y la posicion relativa de cualesquiera bases no coincidentes a lo largo de un tramo de complementariedad. (Veanse, por ejemplo, los Ejemplos 20, 27, 28 y 29). Los expertos en la tecnica de la hibridacion de acidos nucleicos podnan determinar condiciones de hibridacion y de lavado favorables en el uso de un oligomero para la hibridacion con moleculas de acido nucleico objetivo, dependiendo de la aplicacion particular. "Condiciones favorables" pueden ser aquellas que favorecen los hfbridos estables entre moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo que son, al menos en parte, sustancialmente complementarias, incluyendo aquellas que comprenden una o mas faltas de correspondencia.

"Condiciones favorables" pueden ser aquellas que favorecen hfbridos estables entre moleculas de oligomero y de acido nucleico objetivo que son, al menos en parte, completamente complementarias y desfavorecen o desestabilizan hfbridos entre moleculas que no son completamente complementarias.

Usando metodos tales como los descritos aqrn, se puede determinar la temperatura de fusion del oligomero hibridado con moleculas de acido nucleico objetivo de diferentes secuencias y se puede usar para determinar condiciones favorables para una aplicacion dada. Tambien es posible determinar empmcamente condiciones de hibridacion favorables, por ejemplo, hibridando moleculas de acido nucleico objetivo con oligomero que estan unidas a un soporte solido y detectar los complejos hibridados.

Las moleculas de acido nucleico objetivo que estan unidas a soportes solidos o sondas oligomericas de la presente invencion pueden separarse conveniente y eficientemente de moleculas de acido nucleico no unidas de la poblacion en estudio mediante la union directa o indirecta de sondas de oligomeros a un soporte solido. Un soporte solido puede lavarse con alta rigurosidad para eliminar moleculas de acido nucleico que no estan unidas a sondas de oligomeros. Sin embargo, la union de sondas de oligomeros a un soporte solido no es un requisito de la presente invencion. Por ejemplo, en algunas aplicaciones se pueden separar las moleculas de acido nucleico unidas o no unidas por

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centrifugacion a traves de una matriz o por separacion de fases o algunas por otras formas de separacion (por ejemplo, por precipitacion diferencial) que pueden opcionalmente ser ayudadas por grupos qmmicos incorporados en el oligomero (vease, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.060.242 concedida el 9 de mayo de 2000 a Nie et al.).

Sondas de captura de acidos nucleicos

En una realizacion, se usa un acido nucleico inmovilizado que comprende un atenuador y una fraccion estabilizante como sonda de captura. La sonda de acido nucleico puede unirse directamente a un soporte solido, por ejemplo, por union del nucleotido del terminal 3' o 5' de la sonda al soporte solido. Mas preferiblemente, sin embargo, la sonda esta unida al soporte solido por en enlazador (ver mas arriba). El enlazador sirve para distanciar la sonda del soporte solido. El enlazador es lo mas preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 atomos de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 atomos de longitud.

En diversas realizaciones, el soporte solido se usa tambien como soporte de smtesis en la preparacion del oligomero (sonda). La longitud y la estabilidad qmmica del enlazador entre el soporte solido y la primera unidad 3' de acido nucleico desempenan un papel importante en la smtesis eficiente y la hibridacion de acidos nucleicos unidos a un soporte. El brazo enlazador es preferiblemente suficientemente largo para que se pueda conseguir un alto rendimiento (> 97%) durante la smtesis automatizada. La longitud requerida del enlazador dependera del soporte solido particular utilizado. Por ejemplo, un enlazador de seis atomos es generalmente suficiente para conseguir un rendimiento > 97% durante la smtesis automatizada de acidos nucleicos cuando se usa poliestireno altamente entrelazado como soporte solido. El brazo enlazador tiene preferiblemente al menos 20 atomos de longitud para alcanzar un alto rendimiento (> 97%) durante la smtesis automatizada cuando se usa CPG como soporte solido.

La hibridacion de una sonda inmovilizada sobre un soporte solido requiere generalmente que la sonda se separe del soporte solido por al menos 30 atomos, mas preferiblemente por lo menos 50 atomos. Con el fin de conseguir esta separacion, el enlazador incluye generalmente un espaciador situado entre el enlazador y el extremo 3'. Para la smtesis de acidos nucleicos, el brazo enlazador se une habitualmente al 3'-OH del extremo terminal 3' mediante un enlace ester que puede escindirse con reactivos basicos para liberar el acido nucleico del soporte solido.

Se conocen en la tecnica una amplia variedad de enlazadores, que se pueden utilizar para unir la sonda de acido nucleico al soporte solido. El enlazador puede estar formado de cualquier compuesto, que no interfiera significativamente con la hibridacion de la secuencia objetivo con la sonda unida al soporte solido. El enlazador puede estar formado, por ejemplo, por un acido nucleico homopolimerico, que puede anadirse facilmente al enlazador mediante smtesis automatizada. Alternativamente, se pueden usar polfmeros tales como polietilenglicol con adicion de grupos funcionales como el enlazador. Estos polfmeros se prefieren actualmente sobre los acidos nucleicos homopolimericos porque no interfieren significativamente con la hibridacion de la sonda con el acido nucleico objetivo. El polietilenglicol se prefiere particularmente porque esta disponible comercialmente, es soluble en medios tanto organicos como acuosos, se pueden anadir funciones facilmente y es completamente estable en condiciones de smtesis de acido nucleico y posteriores a la smtesis.

Los fragmentos de enlace entre el soporte solido, el enlazador y la sonda preferiblemente no se escinden durante la smtesis o eliminacion de los grupos protectores de la base en condiciones basicas a alta temperatura. Estos enlaces pueden, sin embargo, ser seleccionados de grupos que son escindibles bajo una variedad de condiciones. Ejemplos de enlaces actualmente preferidos incluyen enlaces carbamato, ester y amida.

Deteccion de acidos nucleicos en muestras

Pueden usarse soportes solidos y oligomeros para la deteccion de acidos nucleicos. Tales metodos de deteccion incluyen: proporcionar una muestra, poner en contacto al menos un analogo de oligonucleotido con la muestra en condiciones que permitan la hibridacion del oligomero con moleculas de acido nucleico y detectar una o mas moleculas de acido nucleico de la muestra que se han hibridado con uno o mas oligomeros.

Una muestra puede ser de cualquier fuente, y puede ser una muestra biologica, tal como una muestra de un organismo o un grupo de organismos de la misma o de diferentes especies. Una muestra biologica puede ser una muestra de fluido corporal, por ejemplo, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de medula osea, un fluido ascftico, un fluido pleural, un fluido de lavado pelvico, un fluido ocular, orina, semen, esputo o saliva. Una muestra biologica tambien puede ser un extracto de hisopos cutaneos, nasales, de garganta o genitales, o extractos de material fecal. Las muestras biologicas tambien pueden ser muestras de organos o tejidos, incluyendo tumores. Las muestras biologicas tambien pueden ser muestras de cultivos celulares, incluyendo tanto lmeas celulares como cultivos primarios de celulas procariotas y eucariotas.

Una muestra puede ser del medio ambiente, tal como de un cuerpo de agua o del suelo, o de una fuente de alimento, bebida o agua, una fuente industrial, area de trabajo, area publica o area de estar. Una muestra puede ser un extracto, por ejemplo, un extracto lfquido de una muestra de suelo o de alimento. Una muestra puede ser una solucion elaborada a partir de un lavado o remojo, o suspension de un hisopo de artmulos tales como herramientas, prendas de vestir, artefactos u otros materiales.

Una muestra puede ser una muestra no procesada o procesada; el procesamiento puede implicar etapas que aumentan

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la pureza, concentracion o accesibilidad de los componentes de la muestra para facilitar el analisis de la misma. Como ejemplos no limitativos, el procesamiento puede incluir etapas que reducen el volumen de una muestra, remueven o separan componentes de una muestra, solubilizan una muestra o uno o mas componentes de la muestra, o alteran, modifican, exponen, liberan o aislan componentes de una muestra. Ejemplos no limitativos de tales procedimientos son centrifugacion, precipitacion, filtracion, homogeneizacion, lisis celular, union de anticuerpos, separacion celular, etc. Por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas, la muestra es una muestra de sangre que se procesa al menos parcialmente, por ejemplo, mediante la eliminacion de los globulos rojos, por concentracion, por seleccion de uno o mas tipos de celulas o virus (por ejemplo, globulos blancos o celulas patogenas), o por lisis de celulas, etc.

Ejemplos de muestras incluyen una solucion de moleculas de acido nucleico al menos parcialmente purificadas. Las moleculas de acido nucleico pueden ser de una sola fuente o multiples fuentes, y pueden comprender ADN, ARN o ambos. Por ejemplo, una solucion de moleculas de acido nucleico puede ser una muestra que se sometio a cualquiera de las etapas de lisis celular, concentracion, extraccion, precipitacion, seleccion de acido nucleico (tal como, por ejemplo, seleccion de ARN poli A o seleccion de secuencias de ADN que comprenden elementos Alu), o tratamiento con una o mas enzimas. La muestra tambien puede ser una solucion que comprende moleculas de acido nucleico sinteticas.

Un oligomero o soporte solido puede ser cualquier formato de oligomero descrito en la presente memoria, o cualquier oligomero que comprende un componente monomero, dimero o que no es acido nucleico (por ejemplo, un enlazador, fluoroforo, atenuador, fraccion estabilizante) descrito en la presente memoria. Un analogo de oligonucleotido usado en los metodos aqm descritos puede ser de cualquier longitud y de cualquier composicion de base, y puede comprender uno o mas fracciones de acido nucleico, peptidos, protemas, lipidos, carbohidratos, esteroides y otras fracciones bioqmmicas y qmmicas. Puede proporcionarse un analogo de oligonucleotido en solucion o unido a un soporte solido. En algunas realizaciones preferidas, el oligomero comprende residuos de HypNA y pPNA, y puede comprender residuos de HypNA y pPNA en proporciones de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:3. Mas preferiblemente, el oligomero usado en los metodos descritos en la presente invencion comprende proporciones de residuos de HypNA a pPNA de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2.

Los metodos de deteccion para acidos nucleicos unidos son bien conocidos en la tecnica y pueden incluir el uso de un marcador detectable que esta unido o incorporado en moleculas de acido nucleico de la poblacion en estudio o que se une o se incorpora a una molecula de acido nucleico objetivo hibridada o complejo de molecula de acido nucleico objetivo hibridada. Los marcadores detectables para las moleculas de acido nucleico son bien conocidos en la tecnica, y comprenden moleculas fluorescentes tales como fluoroforos (incluidos los expuestos aqm), radioisotopos, grupos qmmicos alterados en masa, miembros de union espedfica tales como biotina que pueden ser detectados por moleculas de generacion de senales, y similares. Las etiquetas detectables tambien se pueden incorporar o unirse a un oligomero, por ejemplo, en los casos en que se utiliza la hibridacion en sandwich usando un oligomero senal para la deteccion, o la deteccion se lleva a cabo usando un miembro de union espedfico, tal como un anticuerpo que reconoce los complejos de moleculas de acido nucleico objetivo/oligomero. Los soportes solidos pueden ser escaneados, expuestos a una pelicula, inspeccionados visualmente, etc. para determinar la presencia de un marcador detectable y, de este modo, determinar la union de una molecula de acido nucleico objetivo a un oligomero inmovilizado en un soporte solido tal como los de la invencion.

Kits

Un aspecto aqm descrito es la formulacion de kits que facilitan la practica de smtesis usando soportes solidos y ensayos usando oligomeros, como se ha descrito anteriormente. Los kits tipicamente comprenden un soporte solido u oligomero, ya sea presente como una especie qmmicamente reactiva util para preparar conjugados, o presente como un oligomero terminado en el que el oligomero es un miembro de par de union espedfica. El kit opcionalmente comprende ademas uno o mas agentes reguladores, tipicamente presentes como una solucion acuosa. Los kits opcionalmente comprenden ademas reactivos de deteccion adicionales, un medio de purificacion para purificar la sustancia marcada resultante, patrones de luminiscencia, enzimas, inhibidores enzimaticos, disolvente organico, o instrucciones para llevar a cabo un ensayo de la invencion. Otros formatos para kits seran evidentes para los expertos en la tecnica.

A modo de resumen, en las realizaciones ejemplares, la presente invencion proporciona:

un uso de una sonda para la deteccion de un polimorfismo en secuencias objetivo de acido nucleico, comprendiendo la sonda un oligomero de acido nucleico que comprende una base que tiene una formula seleccionada entre:

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en las que R10 es una fraccion alquinilo seleccionada del grupo que consiste en: etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo, 1- pentinilo, 1,3-pentadiinilo, fenil-etinilo, piridin-etinilo, pirimidin-etinilo, triazin-etinilo, tiofen-etinilo, tiazol-etinilo e imidazol- etinilo; y

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un atenuador de ene^a de fluorescencia que comprende:

a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un primer enlace diazo exodclico y en donde el primer o el segundo residuo esta unido covalentemente al tercer residuo a traves de un segundo enlace diazo; o

b) al menos dos residuos, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un enlace diazo exodclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado a partir de arilo polidclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo polidclicos sustituidos o no sustituidos; en donde los grupos arilo y heteroarilo tienen de 1 a 3 anillos; y

en donde dicho atenuador esta unido en el extremo 3' o en el extremo 5' de dicho oligomero de acido nucleico; en donde el oligomero contiene de 8 a 30 nucleomonomeros.

Los materiales y metodos que se describen aqm se ilustran adicionalmente mediante los ejemplos que siguen. Estos ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invencion reivindicada.

Ejemplos

Ejemplo 1: Smtesis de CPH BHQ1-Plus

Se preparo 1-O-DMT-2-(N-Fmoc-4-aminobutiril-1,3-propanodiol 1 (Figura 1) de acuerdo con Nelson, et al., patente de Estados Unidos No. 5.942.910 (1999), excepto porque se utilizo una mezcla de THF, agua y Na2CO3 (en lugar de DMF) durante la etapa de adicion de Fmoc que conduce a 1. Despues de la purificacion por cromatografia en columna, se elimino el grupo Fmoc de 1 con metilamina en etanol y despues de una eliminacion rigurosa de la metilamina por evaporacion conjunta con piridina, se anadio acido 9-acridinacarboxflico activado con BOP en DMF. Se aislo el 1-O- DMT-2-(N-carboxi-acridina-4-aminobutiril)-1,3-propanodiol, 2, resultante mediante eliminacion de los disolventes y cromatografia en columna. Despues de un secado adicional por evaporacion conjunta de piridina seca, se anadio anhidrido de acido diglicolico para producir 1-O-DMT-2-(N-carboxiacridina-4-aminobutiril)-3-O-diglicolato-1,3- propanodiol, 3, aislado como su sal de trietilamina despues de la cromatografia en columna. Se anadio 3 a aminopropil CPG, despues de la activacion con BOP y NMM, para producir DMT acridina CPG 4. Los grupos amina que no reaccionaron en la CPG se protegieron (acetilaron) con una mezcla de anhidrido acetico y n-metilimidazol en acetonitrilo. Se determino que la carga de DMT de CPG 4 era de 45 a 80 micromoles por gramo, encontrada por destritilacion (3% de DCA/DCM) de una cantidad del soporte seco y analisis colorometrico.

De acuerdo con la Fig. 2, CPG 4 se destritilo (3% de DCA/DCM), se lavo y se seco por evaporacion conjunta con piridina (Esquema 2). Se anadio amidita de BHQ1 DMT (Cook, et al., patente de Estados Unidos No. 7.109.312 (2006)) a la CPG destritilada y se activo con etiltiotetrazol 0,5 M. Despues de 2 minutos, se lavo el CPG con MeCN y se oxido con una solucion de yodo, piridina y agua en THF. El soporte 5 se lavo, se acetilo como anteriormente, despues se lavo bien y se seco. La carga final de DMT fue de 30 - 50 micromoles/g.

Ejemplo 2: Smtesis de 5'-DMTdU-5-alquinil(BHQ1)3'-diisopropil cianoetil fosforamidita

imagen31

Comenzando con 5-yodouridina 6, se elaboro el compuesto 9 en una smtesis en 5 etapas. En primer lugar, el acoplamiento de Sonogashira (JACS 2005, 127, 15071) con propargilamina trifluoroacetamida, yoduro de cobre y tetrakistrifenilfosfina paladio (0) en DMF con trietilamina produjo el nucleotido 7, 5-propargil(trifluoroacetamida), con un rendimiento del 37% despues de cromatografia de sflice. El nucleosido se seco bien y se anadio el grupo 5'DMT

utilizando cloruro de DMT en piridina seca para producir 8 pL con un rendimiento del 87% despues de cromatograffa. El grupo protector de amina de TFA se elimino con metilamina en etanol, para producir el nucleosido de 5-propargilamina. A continuation, se anadio acido carboxflico BHQ C3 al nucleosido de amina con BOP y N-metilmorfolina para producir el nucleosido 11, 5'-DMTdU-5-alquinil(BHQ1).

imagen32

Despues de secar por evaporation a partir de piridina, el nucleosido 11 se convirtio en 5'-DMTdU-5-alquinil(BHQ1)3'- diisopropil cianoetil fosforamidita 12 con tetraisopropil cianoetil fosforamidita y tetrazol en una mezcla de acetonitrilo seco y diclorometano. Despues de la purification en una columna de sflice con un gradiente de metanol en diclorometano con piridina al 2%, se obtuvieron 700 mg de 12. La fosforamidita se acoplo a 5'-TTTTTTTTTT-3' 10 inmovilizado sobre CpG con la qufmica estandar de fosforamidita. El analisis del producto por ESMS mostro una masa de 3.809,5 AMU (calculada 3.808,5).

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Uso de una sonda para la deteccion de un polimorfismo en secuencias objetivo de acido nucleico, comprendiendo la sonda un oligomero de acido nucleico que comprende una base que tiene una formula seleccionada de:

   imagen1

   en las que R10 es una fraccion alquinilo seleccionada del grupo que consiste en: etinilo, 1-propinilo, 1 -butinilo, 1- pentinilo, 1,3-pentadiinilo, fenil-etinilo, piridin-etinilo, pirimidin-etinilo, triazin-etinilo, tiofen-etinilo, tiazol-etinilo e imidazol- etinilo; y

   un atenuador de energia de fluorescencia que comprende:

   a) al menos tres residuos, cada uno seleccionado independientemente de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un primer enlace diazo exodclico y en donde el primer o el segundo residuo esta unido covalentemente al tercer residuo a traves de un segundo enlace diazo; o

   b) al menos dos residuos, cada uno independientemente seleccionado de arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde el primer residuo esta unido covalentemente al segundo residuo a traves de un enlace diazo exodclico y al menos uno de los residuos es un miembro seleccionado a partir de arilo polidclico sustituido o no sustituido y grupos heteroarilo polidclicos sustituidos o no sustituidos; en donde los grupos arilo y heteroarilo tienen de 1 a 3 anillos; y

   en donde dicho atenuador esta unido en el extremo 3' o en el extremo 5' de dicho oligomero de acido nucleico; en donde el oligomero contiene de 8 a 30 nucleomonomeros.
2. 2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho atenuador es de una estructura de acuerdo con la Formula

   V:

   imagen2

   en la que

   R1, R2 y R3 son miembros seleccionados independientemente entre arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido;

   X y Y son miembros seleccionados independientemente entre un grupo funcional reactivo y un fragmento de enlace que une covalentemente a dicho atenuador al oligomero de acido nucleico, con la condicion de que al menos uno de X y Y sea dicho fragmento de enlace;

   m es un numero entero de 0 a 5, de manera que cuando m es mayor que 1, los grupos X son iguales o diferentes; y v es un numero entero de 1 a 10.
3. 3. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho atenuador es de una estructura de acuerdo con la Formula VI:

   imagen3

   en la que

   R5, R6 y R7 son miembros seleccionados independientemente entre -NR'R'', arilo sustituido o no sustituido, nitro, alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido y alcoxi C1-C6 sustituido o no sustituido,

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   en donde R' y R'' se seleccionan independientemente entre H y alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido;

   X y Y son miembros seleccionados independientemente entre un grupo funcional reactivo y un fragmento de enlace que une covalentemente a dicho atenuador con el oligomero de acido nucleico, con la condicion de que al menos uno de X y Y sea dicho fragmento de enlace;

   n es un numero entero de 0 a 1;

   a es un numero entero de 0 a 4, de manera que cuando a es mayor que 1, los grupos R5 son iguales o diferentes;

   b es un numero entero de 0 a 4, de manera que cuando (v x b) es mayor que 1, los grupos R6 son iguales o diferentes;

   c es un numero entero de 0 a 5, de manera que cuando c es mayor que 1, los grupos R7 son iguales o diferentes; y

   v es un numero entero de 1 a 10, de manera que cuando v es mayor que 1, el valor de b en cada uno de los anillos fenilo b es igual o diferente.
4. 4. El uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o la reivindicacion 3, en donde v es 1.
5. 5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho atenuador tiene una estructura seleccionada de:

   imagen4

   y

   en las que X5 es un fragmento de enlace que une covalentemente a dicho atenuador con el oligomero de acido nucleico.
6. 6. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho atenuador es de una estructura de acuerdo con la Formula

   (II)

   imagen5

   en la que

   R1, R2 y R3 son miembros seleccionados independientemente entre arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido;

   en donde un miembro seleccionado entre R1, R2 y R3 incluye una estructura de acuerdo con la Formula IV:

   imagen6

   en la que R4 es un miembro seleccionado entre alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo y heteroarilo sustituido;

   X, Y y Y' son miembros seleccionados independientemente entre un grupo funcional reactivo y un fragmento de enlace que une covalentemente a dicho atenuador al oligonucleomero de acido nucleico, con la condicion de que al menos uno de X, Y y Y' sea dicho fragmento de enlace;

   f es un numero entero de 0 a 4, de manera que cuando (f x s) es mayor que 1, los grupos Y' son iguales o diferentes; m es un numero entero de 0 a 5, de manera que cuando m es mayor que 1, los grupos X son iguales o diferentes;

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   n es un numero entero de 0 a 6, de manera que cuando (n x t) es mayor que 1, los grupos Y son iguales o diferentes;

   s es un numero entero de 0 a 6, de manera que cuando s es mayor que 1, los grupos R3 son iguales o diferentes; y

   t es un numero entero de 1 a 6, de manera que cuando t es mayor que 1, los grupos R2 son iguales o diferentes, y cuando

   t es 1 y s es 0, un miembro seleccionado entre R1, R2 y combinaciones de los mismos es un miembro seleccionado de grupos arilo polidclico sustituido o no sustituido y heteroarilo polidclico sustituido o no sustituido; en donde los grupos arilo y heteroarilo tienen de 1 a 3 anillos.
7. 7. El uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde dicho atenuador es de una estructura de acuerdo con la Formula

   (III):

   imagen7
8. 8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en donde dicho atenuador tiene la estructura:

   imagen8

   en las que

   X5 y X6 son miembros seleccionados independientemente entre H, un grupo funcional reactivo y un fragmento de enlace que une covalentemente dicho agente atenuador al oligomero de acido nucleico, con la condicion de que al menos uno de X5 y X6 sea un fragmento de enlace de este tipo.
9. 9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que dicho fragmento de enlace es NH o NR‘, en donde R‘ se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido.
10. 10. El uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que dicho oligomero de acido nucleico es la sonda, preferiblemente en donde dicha sonda se selecciona de balizas moleculares, sondas Scorpion, sondas Sunrise, sondas conformacionalmente asistidas, sondas LightUp, sondas de deteccion de invasores y sondas TaqMan.
11. 11. El uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que dicha fraccion alquinilo es 1-propinilo.
12. 12. El uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el oligomero de acido nucleico comprende ademas un fluoroforo.
13. 13. El uso de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el polimorfismo en secuencias objetivo de acido nucleico es un polimorfismo de nucleotido unico.
14. 14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el polimorfismo en las secuencias objetivo de acido nucleico se produce a partir de una supresion de un nucleotido o una insercion de un nucleotido con respecto a un alelo de referencia.

    imagen9

    imagen10