CN107922454A - 双猝灭剂探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包括两种激发态能量的猝灭剂的核酸探针及其使用方法。

Description

双猝灭剂探针
相关申请的交叉引用
本申请根据35USC 119(e)要求于2015年4月15日提交的美国临时申请第62/147,695号的权益，出于所有目的通过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
本发明属于带标记的核酸探针和检测这些探针或探针片段的方法的领域。本发明的示例性物质是用两个或更多个能够猝灭由一个或多个荧光部分发出的能量的猝灭部分标记的核酸低聚物，所述荧光部分还与核酸低聚物缀合。通常，至少一个猝灭部分和一个荧光部分在发生从荧光团至猝灭剂的可检测能量转移的足够接近的低聚物上的位置结合。
背景技术
qPCR市场上的主要探针类型是用于5’核酸酶测定的线性水解探针。它们习惯上用两种染料标记，通常位于核酸低聚物的末端，例如5’荧光报告分子和3’猝灭剂，例如暗猝灭剂。3’修饰可以起到在杂交时抑制聚合酶从探针延伸以及在探针与其靶序列杂交前猝灭来自荧光团的信号的双重目的。
猝灭剂和荧光团可以通过福斯特共振能量转移(FRET)和/或静态猝灭相互作用，假设它们彼此接触，形成非荧光的基态复合物(Marras,S.A.E.,Kramer,F.R.和Tyagi,S.(2002)Nucleic Acids Res.30,e122；Johansson,M.K.(2006).Methods Mol.Biol.335,17–29)。当探针在溶液中游离时，这种相互作用抑制信号。在寡核苷酸杂交时，形成的双螺旋是相当刚性的并且因此与更加柔性的单股寡核苷酸相比提高了有效长度。因此，探针与靶序列的结合足以破坏位于寡核苷酸的相对末端的染料之间的相互作用，并释放荧光信号(Parkhurst,K.M.和Parkhurst,L.J.(1995).Biochemistry 34,285–292)。
通过在荧光团和猝灭剂之间水解寡核苷酸，可以使杂交时的信号释放恒定。事实上，当Taq聚合酶从引物延伸并在其路径上与探针相遇时实现裂解(图1)。聚合酶的核酸酶活性从探针的5’端裂解掉探针的一个或几个碱基，直到探针失去结合稳定性并从链上转移。这种水解是探针中的信号传导机制的基础。
图1是5’核酸酶测定的说明。简单来说，变性后，探针和引物退火到解离的链上。在延伸期间，聚合酶从引物延伸，遇到探针并水解从链上转移的核苷酸片段。探针的裂解使提供恒定信号释放的荧光团和猝灭剂分离。
一般来说，探针性能可以通过信噪比：扩增后的最终荧光除以扩增前的初始荧光来定量。初始荧光表示猝灭效率，因此两倍的这种背景信号使S:N减少到1/2。猝灭效率部分地取决于寡核苷酸长度。这是因为根据(1/r)^6的关系，其中r是跨空间的距离，随着染料之间的距离增加，FRET猝灭相当快速地减少(Cardullo等人.(1988).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,8790–8794.)。单链寡核苷酸被认为表现为无规卷曲，所以有效距离是许多构象的平均值，但是原理保持不变：增加序列长度减少了猝灭效率，导致探针的基线荧光升高，而信噪比值变差。由于这个原因，探针设计通常限制在30个碱基或更短，以达到足以用于最终应用的猝灭效率。
选择寡核苷酸的长度，不光要考虑猝灭效率还要考虑其结合稳定性。常见的设计指南是选择TM为70℃，高于引物的TM的探针序列。探针通常必须长于20个碱基以实现根据碱基组成的该TM，并在没有特别修饰的情况下促进杂交。因此序列设计是结合稳定性和猝灭效率之间的谨慎的折衷，但是20至30个碱基窗口对许多困难靶标是不够的。例如，SNP基因分型需要短于20个碱基的探针以便实现错配识别所需的增强的特异性。如此，低TM的SNP探针会是非功能性而不能使用化学部分来提高其结合稳定性—小沟结合剂(MGB)(Kutyavin等人.(2000).Nucleic Acids Res.28,655–661)或用于BHQplus探针的丙炔基残基等。这些化学修饰起到放松低限，允许设计长度为20个碱基以下的紧凑序列(compact sequences)的作用。
许多靶基因尤其是富AT的，并且需要更长的序列来获得合适的TM。通过将猝灭剂定位在更接近于荧光报告分子的内部位置而非3’端，可以放松序列长度的上限。事实上，一些最早的TaqMan探针设计由于以下原因使猝灭剂位于内部位置—为了改善其猝灭效率(Lee等人.(1993)Nucleic Acids Res.21(16):3761-3766)。然而，现在腾出的3’位置仍然必须用如末端磷酸酯或脂肪族碳间隔物的阻断剂修饰以防止探针起引物的作用并触发延伸。
具有内部猝灭剂的探针对长于30个碱基的序列确实改善了猝灭效率。内部猝灭剂习惯上位于胸苷碱基上以保留糖-磷酸酯主链并且大概地使对碱基配对的任何破坏最小化。然而，对于某些测定，该策略会减少扩增时信号释放的幅度。这种抑制的原因并不完全明确，但是结果有效地减少了S:N比中的分子，影响了探针性能。图2A至图2C显示了当黑洞猝灭剂-1(Black Hole Quencher-1，BHQ1)位于内部T残基上时，3种不同探针长度的代表性结果。
图2A至图2C.由末端标记的探针发送信号得到的扩增迹线显示为斜杠线。由内部T-BHQ1探针发送信号得到的扩增迹线显示为实线。对较长的探针序列来说，猝灭效率的改善是最显著的，而与末端标记的探针相比，短的21个碱基的探针具有降低的信号释放幅度。
由于用于在寡核苷酸合成期间掺入猝灭剂的反应性前体涉及T连接的亚磷酰胺，因此将BHQ1栓系与胸苷将探针设计约束为具有向5’端的T的那些序列。这种碱基依赖性是明显的限制，这是因为来自选择测定的信号释放减少，尤其是探针序列较短的那些。通过：
1.改善信号释放的幅度和猝灭效率两者；
2.消除限制猝灭剂位置的任何碱基依赖性；
3.允许设计具有相似性能改善的长序列和短序列两者的标记取向，
可以使qPCR测定的设计更灵活，并且使其信号放大更稳健。
本发明提供了符合这三条并且还具有其他优势的核酸探针。
发明内容
本发明提供了包括激发态能量的两种猝灭剂的核酸探针和使用其的方法。
由以下详细描述，本发明的其他目的、优势和方面会是清楚的。
附图说明
图1是5’核酸酶()测定的说明。
图2A至图2C显示了不同探针长度的末端标记的探针(斜杠线)和内部T-BHQ1标记的探针(实线)的扩增迹线。
图3显示了本发明的示例性双猝灭剂探针的结构。
图4A至图4C显示了不同探针长度的末端标记的探针(斜杠线)和双猝灭剂探针(实线)的扩增迹线。
图5A至图5F显示了不同探针长度的末端标记的探针(斜杠线)和双猝灭剂探针(实线)的(原始和标准化的)扩增迹线。
图6A显示了末端标记的探针(斜杠线)和I-TBHQ1+3-BHQ1探针(实线)的扩增迹线。图6B显示了末端标记的探针(斜杠线)和I-BHQ1+3-BHQ1探针(实线)的扩增迹线。
图7A显示了末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和I-TDAB+3-BHQ1探针(空心线)的扩增迹线。图7B显示了末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和I-苯胺+3-BHQ1探针(空心线)的扩增迹线。
图8A显示了末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和I-dRBHQ0+3-BHQ1探针(空心线)的扩增迹线。图8B显示了末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和I-gBHQ0+3-BHQ1探针(空心线)的扩增迹线。
图9A显示了末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和I-BHQ0+3-Sp3探针(空心线)的扩增迹线。图9B显示了末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和I-BHQ1+3-BHQ0探针(空心线)的扩增迹线。
图10显示了末端标记的探针(斜杠线)和不同的I-BHQ0+3-BHQ1探针的扩增迹线。
图11A至图11L分别显示了不同探针序列的末端标记的探针(斜杠线)、I-BHQ0+3-BHQ1探针(实线)和没有互补物的探针(空心线)的熔解曲线。
具体实施方式
缩写
本文使用的“BHQ”通常是指包括一个或多个重氮键的暗猝灭剂，尤其是指“黑洞猝灭剂TM(Black Hole QuenchersTM)”。第7,019,129号美国专利中描述了示例性的BHQ。本文使用的“FET”是指“荧光能量转移”。本文使用的“FRET”是指“荧光共振能量转移”。本文使用的这些术语是指辐射能量转移过程和非辐射能量转移过程两者。例如，这些术语中包括发射光子和涉及长程电子转移的过程。贯穿本说明书，将这两种现象归入通用术语“供体-受体能量转移”。“SNP”是指单核苷酸多态性。
定义
在更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于本文描述的具体实施方式，因为这样的实施方式可以改变。还应该理解的是，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，术语不旨在限制。本发明的范围仅由所附权利要求限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在给出值的范围的情况下，应该理解，除非上下文明确指出，在该范围的上限和下限与在所述范围内的任何其他陈述值或中间值之间，每个中间值至下限单位的十分之一包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本发明内，受限于所述的范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，本发明还包括排除那些包括的限制中的任一个或两个的范围。本文给出了数值前面的术语“约”的某些范围。本文使用的术语“约”为其后面的确切数值以及接近或近似于术语后面的数值提供文字支持。在确定数值是否接近或近似于具体记载的数值时，接近或近似的未记载数值可以是在存在数值的上下文中提供了具体记载的数值的实质等同物的数值。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过以引用并入本文，引用的幅度如同每个单独的出版物、专利或专利申请特别和单独地被指定为通过引用并入。此外，每个引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的主题。任何出版物的引用是针对其在申请日前的公开内容，而不应该被解释为承认本文描述的发明由于现有发明而无权先于这样的出版物。进一步地，提供的出版物的日期可能不同于其实际出版日期，这可能需要单独确认。
注意到可以撰写权利要求来排除任何可选的元素。因此，该声明旨在用作用于使用与权利要求元素的记载相关的这样的排他性术语如“唯一地”、“仅仅”等或使用“否定”限定的引用基础。如在阅读本公开后将对本领域的技术人员显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组件和特征，所述组件和特征可以容易地与任意的其他几个实施方式的特征分离或合并而不脱离本发明的范围或精神。任何记载的方法可以按记载的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序执行。虽然与本文公开的那些相似或等价的任何方法和材料也可以用于实践或测试本发明，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。
以下定义广泛地适用于下文阐述的本发明的每种实施方式。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。一般地，本文使用的命名法和在下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学，以及核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域熟知和通常采用的。标准技术用于核酸和肽的合成。一般根据本领域和各种一般参考文献中的常规方法进行分子生物学技术和程序(一般见Sambrook等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，其通过引用并入本文)。本文使用的命名法和在分析化学和有机合成中的实验室程序是本领域熟知和通常采用的。标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。
除非另有说明，术语“烷基”，单独地或作为另一种取代基的部分，是指直链或支链，或环烃基团，或其组合，所述烷基可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可包括具有指定的碳原子数(即C1-C10是指1至10个碳原子)的一价基团、二价基团、三价基团和四价基团。饱和烃基的例子包括但不限于，基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的例子包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级的同系物和异构体。除非另有说明，术语“烷基”也任选地包括下面更详细地定义的烷基的衍生物，如“杂烷基(heteroalkyl)”。限于烃基的烷基被称为“同烷基(homoalkyl)”。本文使用的术语“烷基”是指烷基、链烯基和炔基部分，其中的每种视情况可以是一价、二价或多价物质以满足化合价要求。烷基也任选地被例如一种或多种在本文被称为“烷基取代基”的基团取代。
术语“亚烷基”，单独地或作为另一种取代基的部分，是指衍生自烷基部分的二价基团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并进一步包括下文描述的基团如“杂亚烷基(heteroalkylene)”。典型地，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，在本发明中优选具有10个或更少的碳原子的那些基团。对于亚烷基和杂亚烷基接头基团，任选的是不通过写出接头基团式的方向暗示接头基团的取向。例如，式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-，和任选地-R’C(O)2-。“低级烷基”或“低级亚烷基”是短链烷基或短链亚烷基，通常具有8个、7个、6个、5个或更少的碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，分别是指通过氧原子、氨基或硫原子连接于分子的剩余部分的烷基。
除非另有说明，术语“杂烷基”，单独地或与另一术语结合，是指由规定数目的碳原子和至少一个杂原子组成的稳定的直链烷基或支链烷基，或环烷基，所述杂原子选自由B、O、N、Si和S组成的组，其中杂原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化。杂原子可位于杂烷基的任何内部位置或在链的末端，例如烷基通过其连接到分子的剩余部分的位置。“杂烷基”基团的例子包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。两个或更多个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。相似地，术语“杂亚烷基”，单独地或作为另一种取代基的部分，是指取代的或未被取代的二价杂烷基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以位于链末端的任一端或两端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷氨基、亚烷二氨基等)。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”，单独地或与其他术语结合，分别表示环形式的“烷基”和“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可位于杂环与分子的剩余部分连接的位置。环烷基的例子包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，术语“卤(halo)”或“卤素(halogen)”，单独地或作为另一种取代基的部分，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烷基”指包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”指包括但不限于三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的芳香族取代基，其可以是稠合在一起或共价连接的单环或多环(优选1至3个环，其中的一个或多个环任选地是环烷基或杂环烷基)。术语“杂芳基”是指含有1至4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮原子和硫原子任选地被氧化，氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子连接于分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性的例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基环和杂芳基环体系中的每一种的取代基选自下文描述的“芳基取代基”的组。
为简洁起见，术语“芳基”当与其他术语结合使用(例如芳基氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)时，所述“芳基”任选地包括如上定义的同芳环和杂芳环。因此，术语“芳基烷基”任选地包括其中芳基连接于烷基的基团(如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(例如亚甲基)已被例如氧原子取代的烷基(例如苯氧甲基、2-吡啶苯氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
烷基和杂烷基(包括常常被称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基通常被称为“烷基取代基”，并且其可以选自但不限于数目为0至(2m’+1)的范围内的以下各种基团中的一种或多种：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，其中m’是在这样的基团中碳原子的总数目。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地指氢，取代的或未被取代的杂烷基，取代的或未被取代的芳基(例如1-3个卤原子取代的芳基)，取代的或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。当本发明的化合物包括多于一种R基团，例如，当存在多于一种这些基团时，每种R基团被独立地选择为各种R’、R”、R’”和R””基团。当R’和R”连接于相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合以形成5元环、6元环或7元环。例如，-NR’R”指包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上文对取代基的讨论中，本领域技术人员将明白术语“烷基”包括具有结合于除氢原子以外的基团的碳原子的基团，如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和芳基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。示例性烷基取代基包括在本文中被称为“反应性官能团”和“连接位点”的基团。在各种实施方式中，烷基取代基是含磷部分，例如本文所述的磷酸二酯或磷酸二酯修饰物。
与描述的烷基取代基相似，芳基基团和杂芳基基团的取代基通常被称为“芳基取代基”。示例性取代基选自烷基取代基和其他取代基列表，例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目在0至芳香环体系的开环化合价的总数范围内；以及其中R’、R”、R”’和R””优选地独立地选自氢，取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的杂烷基、取代的或未被取代的芳基和取代的或未被取代的杂芳基。当本发明的化合物包括多于一种R基团，例如，当存在多于一种这些基团时，每种R基团被独立地选择为各种R’、R”、R’”和R””基团。
芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基取代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，以及q是0至3的整数。可供选择地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，以及r是1至4的整数。如此形成的新环的一个单键可任选地被双键取代。可供选择地，芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基取代，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R’”优选地独立选自氢或取代的或未被取代的(C1-C16)烷基。示例性芳基取代基包括在本文中被称为“反应性官能团”和“键合位点”的基团。
如本文使用的，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。
符号“R”是表示取代基的通用缩写，所述取代基选自H、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的杂烷基、取代的或未被取代的芳基、取代的或未被取代的杂芳基和取代的或未被取代的杂环基。R也可以指烷基取代基和芳基取代基。
术语“盐”包括根据本文描述的化合物上的具体取代基，用相对无毒的酸或碱制备的化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性官能性时，可通过使中性形式的这样的化合物与足量的净相(neat)或在适当的惰性溶剂中的希望的碱接触，获得碱加成盐。碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨盐或镁盐，或相似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性官能性时，可通过使中性形式的这样的化合物与足量的净相或在适当的惰性溶剂中的希望的酸接触，获得酸加成盐。酸加成盐的例子包括来源于无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的盐，以及来源于相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸如精氨酸等的盐，以及有机酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(见例如Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66:1-19(1977))。本发明的某些特定化合物兼有碱性官能性和酸性官能性，这允许化合物被转化为碱加成盐或酸加成盐。还包括盐的水合物。
如本文使用的，“核酸”是指核苷、核苷酸和寡核苷酸，例如DNA、RNA，无论单链、双链或更高度聚合的杂交基序，以及其任何化学修饰物。修饰物包括但不限于提供化学基团的修饰物，所述化学基团将另外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和反应性掺入至核酸配基核碱基或掺入至核酸配基作为整体。这样的修饰物包括但不限于磷酸二酯基团修饰物(例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、糖修饰物、5-位嘧啶修饰物、8-位嘌呤修饰物、在环外胺处的修饰、内容非标准或非天然核碱基如4-硫脲核苷、5-溴代尿嘧啶或5-碘代尿嘧啶置换；骨架修饰物如肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、吗啉代基；甲基化物如2’-O-甲基核苷、5-甲基-2’-脱氧胞苷；非常规碱基配对组合物如异碱基、异胞苷和异胍等。“核单体(nucleomonomer)”是指单个核酸单位，其可以是核苷、核苷酸或其修饰物。
本文使用的“核碱基(nucleobase)”包括不仅含有已知的嘌呤杂环和嘧啶杂环，而且含有其杂环类似物和互变异构体的部分。嘌呤包括腺嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤，示例性的嘌呤类似物包括8-氧代-N6-甲基腺嘌呤和7-脱氮杂黄嘌呤。嘧啶包括尿嘧啶和胞嘧啶，以及其类似物如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和4,4-乙基胞嘧啶(4,4-ethanocytosine)。该术语还涵盖非天然核碱基。代表性的非天然核碱基包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queuosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、硝基吲哚和2,6-二氨基嘌呤。
在各种实施方式中，本发明的化合物包括在5-位衍生的嘧啶。衍生物是1-链烯基、1-炔基、芳杂环和1-炔基芳杂环修饰物。“1-链烯基”是指烯属不饱和(含双键)非环基团(acyclic group)。“1-炔基”是指炔属不饱和(含有三键)非环基团。
本文使用的“核苷”是指核酸的亚单位，其中核碱基共价连接于糖或糖类似物，并且所述亚单位任选地包括亚磷酸酯、亚磷酰胺或磷化氢。术语核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷或任何其他核苷，所述其他核苷是核碱基的N-糖苷或C-糖苷。糖碳的立体化学结构可以不同于D-核糖的立体化学结构。核苷还包括含有糖部分的修饰物的物质，例如，其中一个或多个羟基被卤素、杂原子、脂肪族基团取代，或被官能化为醚类、胺类、硫醇等。戊糖部分可以被己糖或可供选择的结构如环戊烷环、6元吗啉环等取代。如本文定义的核苷还包括连接于氨基酸和/或氨基酸类似物的核碱基，所述氨基酸和/或氨基酸类似物具有游离羧基和/或游离氨基和/或其受保护的形式。核苷也任选地包括一种或多种核碱基修饰物，例如用氟碳基(fluorocarbyl)、链烯基或炔基部分修饰的核碱基修饰物。包括磷酸二酯或磷酸二酯修饰物的核苷在本文中被称为核苷酸。
如本文使用的“糖修饰物”是指除了2’-脱氧核糖以外的任何戊糖或己糖部分。修饰的糖包括例如D-核糖，2’-O-烷基、2’-氨基、2’-卤代官能化的戊糖、己糖等。示例性的糖修饰物包括其中一个或多个羟基被卤素、杂原子、烷基部分取代，或被官能化为醚类、酯类等的糖。戊糖部分可以被己糖或可供选择的结构如环戊烷环、6元吗啉环等取代。如本文定义的核苷也意图包括连接于氨基酸和/或氨基酸类似物的核碱基，所述氨基酸和/或氨基酸类似物具有游离羧基和/或游离氨基和/或其受保护的形式。还包括具有除了D-核糖的立体化学结构以外的立体化学结构的糖。
“磷酸二酯基团修饰物”是指共价偶联相邻的核单体的天然磷酸二酯基团的任何类似物。替代键合包括：磷酸二酯类似物，例如硫代磷酸酯和甲基膦酸酯；和含有键的非磷物质，例如缩醛和酰胺。
核酸修饰物还包括3’、5’和碱基修饰物如用猝灭剂(例如BHQ)、荧光团、插入剂、小沟结合剂、碳氟化合物、稳定基团或另一部分标记。在各种实施方式中，修饰物或标记通过接头基团共价缀合于低聚物。
本文将低聚物定义为彼此通过磷酸二酯或修饰的磷酸二酯部分共价偶联的两个或更多个核单体(nucleomonomer)。因此，低聚物可具有少至两个核单体(二聚体)，且基本上没有核单体的上限。低聚物可以是有能力结合的，因此，可以与同源的单链或双链(或更高级聚合)核酸序列进行碱基配对。低聚物也用作如本文描述的更长的低聚物的合成子。低聚物也可含有脱碱基位点和假核苷。在各种实施方式中，本发明的低聚物是官能化的。下文讨论了官能化低聚物的部分。在描述某些实施方式中，术语“低聚物”可交换地用于指低聚物的核酸序列、提供本发明的探针的修饰的核酸序列或提供本发明的固体支持物的修饰的核酸序列。
“肽”是指其中单体是氨基酸并通过酰胺键连接在一起的低聚物，可供选择地被称为多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可使用L-旋光异构体或D-旋光异构体。另外，也包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯甘氨酸和高精氨酸。通常遇见的非基因编码的氨基酸也可用于本发明。本发明使用的所有氨基酸可以是D-异构体或L-异构体。一般优选L-异构体。另外，其他模拟肽在本发明中也是有用的。一般性综述见Spatola,A.F.,氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides andProteins),B.Weinstein编,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)。
“固体支持物”是具有用于连接分子、化合物、细胞或其他实体的表面或这些物质连接的表面的固体物质。固体支持物的表面可以是平的或呈其他结构的。固体支持物可以是有孔的或无孔的。固体支持物可以是包括表面的芯片或阵列，以及可包括玻璃、硅、尼龙、聚合物、塑料、陶瓷或金属的芯片或阵列。固体支持物也可以是膜(如尼龙膜、硝化纤维素膜或高分子膜)，或板或盘，并且可以由玻璃、陶瓷、金属或塑料组成，例如由例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或聚异质同晶体制成的96孔板。固体支持物也可以是任何形状的珠或颗粒，并优选是球形的或接近球形的，并且珠或颗粒优选具有1毫米或更少的直径或最大宽度，更优选为0.1至100微米的直径或最大宽度。这样的颗粒或珠可以由任何适合的材料(例如玻璃或陶瓷)和/或一种或多种聚合物(例如尼龙、聚四氟乙烯、TEFLONTM、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶(sepaharose)、琼脂糖、纤维素、纤维素衍生物或葡聚糖)组成，和/或可包括金属，尤其是顺磁性金属，如铁。
用于固相合成的支持物是本领域已知的，并且包括但不限于高交联剂聚苯乙烯(McCollum等人,Tetrahedron Lett.32:4069-4072(1991))、聚苯乙烯/PEG共聚物(Gao等人,Tetrahedron Lett.32:5477-5480(1991))、硅胶(Chow等人,Nucl.Acids Res.9:2807-2817(1981))、聚酰胺键合硅胶(Gait等人,Nucl.Acids Res.10:6243-6254(1982))、纤维素(Crea等人,Nucl.Acids Res.8:2331-2348(1980))和可控孔度玻璃(CPG)(Koster等人,Tetrahedron Lett.24:747-750(1983))。示例性固体支持物是CPG珠。CPG珠可衍生化用于以各种方式连接核单体或低聚物。例如，可以用3-氨丙基三乙氧基硅烷处理CPG珠，以添加氨丙基接头柄(handle)，用于连接寡核苷酸类似物单体或二聚体(Koster,等人,Tetrahedron Lett.24:747-750(1983))，或者，优选长链烷基胺基团，最优选包括末端核苷的长链烷基胺基团，可以连接于CPG(Adams,等人,J.Am.Chem.Soc.105:661-663(1983))。用于寡核苷酸合成或肽合成的支持物例如dT-LCAA-CPG(Applied Biosystems)是商业可获得的。
“插入剂”是指能在相邻的核碱基之间部分插入和堆叠的平面芳香族或芳杂环部分。这些部分可以是小分子或更大实体如蛋白质的一部分。插入剂的非限制性的例子包括吖啶、蒽、蒽环类、蒽环酮、亚甲基蓝、吲哚、蒽醌、喹啉、异喹啉、二氢醌、四环素、补骨脂素、香豆素、卤化乙锭、乙锭均二聚体、同型二聚体唑黄(YOYO)、噻唑橙(TOTO)、蒽环抗生素(dynemicins)、1,10-菲咯啉-铜、卡奇霉素(calcheamicin)、卟啉类、偏端霉素、纺锤菌素(netropcins)和紫罗碱。
“小沟结合剂”是指典型地具有约150至约2000道尔顿的分子量的部分。所述部分以非插入的方式结合于双链(或更高级聚合)DNA、RNA或其杂交体的小沟内，优选地，具有大于约103M-1的缔合常数。小沟结合化合物具有广泛变化的化学结构，然而，示例性小沟结合剂具有月牙形三维结构。示例包括某些天然存在的化合物如纺锤菌素、偏端霉素和莱克西菌素(lexitropsin)、光神霉素、色霉素A3、橄榄霉素、蒽霉素、西伯利亚霉素，以及进一步相关的抗生素和合成衍生物。某些双季铵盐杂环化合物，二芳基脒如戊烷脒、脒(stilbamidine)和贝尼尔(berenil)、CC-1065和相关吡咯并吲哚和吲哚多肽、赫斯特33258、4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以及许多由天然存在的或合成的氨基酸组成的寡肽是小沟结合剂化合物。第6,084,102号美国专利中描述了示例性小沟结合剂。可以通过良好建立的分光光度法如紫外(u.v.)光谱和核磁共振(NMR)光谱以及通过凝胶电泳检测该类型的结合。当小沟结合剂分子结合时紫外光谱的移位和利用“核欧沃豪斯”(NOSEY)效应的NMR光谱是尤其熟知的并且是对于该目的有用的技术。凝胶电泳检测小沟结合剂与双链DNA或其片段的结合，因为在这种结合时双链DNA的迁移率改变。
小沟结合剂典型地通过包括约20个原子、约15个原子、约10个原子或约5个原子的链的接头连接于低聚物或固体支持物。
基于相对于小沟结合剂的“月牙形”或类似的几何结构，插入剂是平面芳香族(优选多环的)分子，容易地将插入部分或插入剂与小沟结合剂区分开。通过利用核欧沃豪斯效应的NMR光谱也可以进行实验性区分。
本文使用的术语“接头”或“L”是指单个共价键(“零级”)或掺入了1-30个选自由C、N、O、S、Si和P组成的组的非氢原子的一系列稳定的共价键，所述共价键使本发明的组分共价连接在一起，例如使固体支持物连接于本发明的稳定剂、猝灭剂、核单体或低聚物；或使猝灭剂或稳定部分与本发明的亚酰胺中的核碱基连接。示例性接头包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个非氢原子。除非另有说明，涉及连接的“连接(linking)”、“连接的(linked)”、“键合(linkage)”、“缀合(conjugating)”、“缀合的(conjugated)”和类似术语是指利用接头的技术和掺入接头的物质。示例性接头包括如本文定义的键合位点。此外，接头用于使低聚物或初期低聚物(低聚物合成过程中)与本发明的固体支持物连接。因此，本发明也提供通过接头共价连接于固体支持物(例如本发明的固体支持物)的本发明的低聚物。本发明的固体支持物和低聚物任选地包括固体支持物和低聚物的两种组分之间(例如，低聚物和固体支持物之间，荧光团和低聚物之间，猝灭剂和低聚物之间，荧光团和猝灭剂之间等)的可裂解接头。在各种实施方式中，将固体支持物连接于低聚物的接头是可裂解接头。
“可裂解接头”是具有一个或多个可裂解基团的接头，所述可裂解基团可通过反应或条件的结果被破坏。示例性可裂解接头位于式I或式II的R8内，用于使本发明的合成的低聚物从在其上合成该低聚物的固体支持物方便地分离。术语“可裂解基团”是指通过裂解连接释放部分与缀合物剩余部分的键，允许释放本发明的固体支持物或低聚物的组分的部分。在制备和使用本发明的低聚物和固体支持物中所使用的示例性裂解机制是酶促或以其他方式化学介导的。
除了酶促可裂解基团外，本发明的范围也包括通过试剂而非酶的作用裂解的一个或多个位点。示例性非酶促裂解试剂包括但不限于酸、碱、光(例如硝基苄基衍生物、苯甲酰甲基、邻-羟基肉桂酸酯、苯偶姻酯)和热。许多可裂解基团是本领域已知的。见例如Jung等人,Biochem.Biophys.Acta,761:152-162(1983)；Joshi等人,J.Biol.Chem.,265:14518-14525(1990)；Zarling等人,J.Immunol.,124:913-920(1980)；Bouizar等人,Eur.J.Biochem.,155:141-147(1986)；Park等人,J.Biol.Chem.,261:205-210(1986)；Browning等人,J.Immunol.,143:1859-1867(1989)。此外，宽范围的可裂解的、双官能的(同双官能和异双官能的)间隔臂是商业可获得的。
示例性可裂解基团是可通过试剂例如氢氧化钠、氨或其他胺裂解的。在各种实施方式中，在室温或在加热下容易地裂解可裂解接头。在一个实施方式中，式I和式II的R8包括通过胺(例如氨或有机溶液中的基本无水的胺)处理裂解的可裂解接头。
“键合位点”是连接两种或更多种组分(例如官能性组分、固体支持物、寡肽或接头)的部分。该术语是指通过互补反应配偶体的反应形成的共价键，每个配偶体具有与其配偶体的官能团互补反应性的官能团。本发明的固体支持物和低聚物中的键合位点是独立选择的。示例性键合位点包括但不限于S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O，和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oYx-PEG，其中Yx是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O，以及o是1至50的整数。在每个这些示例性键合位点中，NH可以是NRt，其中Rt是取代的或未被取代的烷基，或取代的或未被取代的杂烷基。键合位点可以是磷酸二酯基团。在各种实施方式中，键合位点在接头和荧光团之间，接头和猝灭剂之间，接头和稳定部分之间或接头和固体支持物之间。在本发明的低聚物和固体支持物的示例性实施方式中，每个键合位点是不同的。
本文使用的术语“荧光团”是指固有荧光的部分，或说明在结合于生物化合物或金属离子，或通过酶促代谢时荧光性的改变，即荧光的(fluorogenic)。荧光团可以被取代以改变荧光团的溶解性、光谱性能或物理性能。许多荧光团对本领域技术人员是已知的，并包括但不限于香豆素、吖啶、呋喃、丹酰、花菁(cyanines)、芘、萘、苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、吲哚、氮茚、硼聚苯并氮杂吲哚(borapolyazaindacene)、嗪和呫吨，后者包括荧光素、若丹明、若萨明(rosamine)、对甲氨基酚(rhodol)。Haugland,分子探针(Molecular Probes)，荧光探针和研究化学的手册(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals)中描述了本发明使用的这些和其他荧光团。在共同拥有的第2005/0214833和2005/0170363号美国专利申请，以及本文下文中描述了进一步有用的荧光团。
本文使用的“猝灭剂”是指可以至少部分地使荧光团发射的光减弱的本发明的任何修饰部分。这种减弱被称为“猝灭”。因此在各种实施方式中，在猝灭基团的存在下荧光团的激发导致产生比预期强度小或者甚至完全不存在的发射信号。猝灭典型地通过激发的荧光团和猝灭基团之间的能量转移发生。
荧光团或猝灭剂可包括提高希望的特性的取代基，相对于不存在这样的取代基的“母体”化合物，所述希望的特性例如水中的溶解度、细胞通透性或改变的吸收和发射谱。如此，本发明中使用的荧光团或猝灭剂包括相对于不存在改进取代基的相同母体化合物，提高希望的特性的取代基。
“官能性组分”是对本发明的具有选自以下结构的化合物中的部分的通用术语，所述结构选自猝灭剂、荧光团或稳定部分(包括但不限于插入剂、小沟结合部分、稳定部分(例如炔基和氟烷基部分)修饰的核碱基，和构象稳定部分，如共同拥有的第2007/0059752号美国专利申请中描述的那些)。
表述“多核苷酸的扩增”包括但不限于方法如聚合酶链式反应(PCR)、连接扩增(或连接酶链式反应，LCR)和基于使用Q-β复制酶的扩增方法。这些方法是众所周知的并在本领域广泛实践的。见例如，第4,683,195和4,683,202号美国专利，以及Innis等人,1990(对于PCR)；以及Wu等人,1989a(对于LCR)。用于进行PCR的试剂和硬件是商业可获得的。用于扩增来自具体基因区域的序列的引物优选与靶区域或靶区域侧翼区中的序列互补并与其特异地杂交。可直接对通过扩增产生的核酸序列测序。可供选择地，在序列分析之前可以克隆扩增的序列。Scharf(1986)描述了用于酶促扩增的基因组片段的直接克隆和序列分析的方法。本发明提供了用于扩增过程的低聚物引物。此外，提供了用于合成这样的引物的固体支持物。除了引物，本发明提供了探针，使用这样的探针的方法，以检测、表征或定量扩增产物：还提供了使用固体支持物以合成这些低聚物探针。
术语“碱基堆积扰动(base-stacking perturbations)”是指引起碱基堆积的扰动的任何事件，例如碱基对错配、蛋白质结合于其识别位点，或任何其他形成寡核苷酸加合物的实体。本发明的各种探针能够检测、表征和/或定量这样的碱基堆积扰动。此外，本发明提供用于合成能够检测、表征和/或定量这样的碱基堆积扰动的探针的固体支持物。
术语“杂交的”是指两个核酸链相互关联，所述关联可以是完全碱基配对的或不完全碱基配对的：一般地，该术语是指包括本发明的低聚物的关联，无论所述低聚物结合于固体支持物或在溶液中。
术语“变性”是指核酸双螺旋(或更高级聚合体)的链不再通过氢键碱基配对并且分离成为单链分子的过程。变性的方法对于本领域技术人员是熟知的，并且包括热变性和碱变性。该术语一般是指本发明的探针从其靶核酸解离。
术语“错配”是指在非100％互补的杂交核酸双螺旋(或更高级聚合体)中的核酸的核碱基。错配包括任何位于核酸互补链的两个核碱基的核碱基之间的不正确配对，所述不正确配对不是沃森-克里克碱基配对，例如A:T或G:C。总同源性的缺乏可能是由于缺失、插入、倒位、置换或移码突变。在各种实施方式中，本发明的低聚物包括相对于其靶核酸的错配，优选允许该低聚物的靶标中对应错配的检测和/或表征和/或定量。在某些实施方式中，错配是单个核苷酸错配。
如本文使用的，术语“多态性”是指基因中的序列变异，以及“突变”是指与表型相关或被认为与表型相关的基因中的序列变异。术语“基因”是指编码功能性产物蛋白控制区域的基因组片段。根据本发明使用的用于受试者识别的多态性标记位于基因组的编码区或非编码区，并且本发明的各种探针被设计为与包括这些标记的核酸区域杂交。如本文使用的术语“受试者”是指提供出于基因测试的目的获得靶核酸的测试样品的受试者。本发明的低聚物用于检测和/或表征和/或定量多态性和突变。此外，本发明的固体支持物用于合成用于检测和/或表征和/或定量多态性和突变的低聚物。
如本文使用的术语“探针”是指使用本发明的固体支持物或亚酰胺制备的核酸低聚物。在各种实施方式中，探针在与结合配偶体相互作用时产生可检测的响应。探针包括至少一个可检测部分，或在响应于探针与结合配偶体相互作用探针的状态发生一些改变时，形成可检测的能量转移对的一对部分。本发明提供了探针，和用于合成探针的亚酰胺和固体支持物。本发明的示例性探针用于检测多态性。在各种实施方式中，多态性是单核酸多态性(SNP)。
本文使用的术语“可检测响应”是指信号的改变或发生，所述信号是通过观察或通过仪器直接或间接可检测的，以及所述信号的存在，优选所述信号的幅度是用于测试样品中的探针的靶结合配偶体的存在的函数。典型地，可检测响应是来自荧光团的光学响应，该光学响应导致吸收光或荧光的波长分布特征或强度的改变，或光散射、荧光量子收率、荧光寿命、荧光偏振的改变，激发或发射波长的转变或以上参数的组合。给出的光谱特性的可检测的改变一般是增加或减少。然而，导致荧光强度增强和/或荧光发射或激发的波长的转变的光谱改变也是有用的。在离子结合上的荧光的改变通常是因为可以在荧光团的激发态或基态发生的指示剂中的构象或电荷改变，因为在离子结合位点的电荷密度的改变，因为通过结合的靶金属离子而使荧光猝灭，或因为这些或其他作用的任何组合。可供选择地，可检测响应是信号的发生，其中荧光团是内在发荧光的，并且在结合于金属离子或生物化合物时信号不产生改变。本发明提供了提供可检测响应的探针和用于合成这样的探针的固体支持物。
本文使用的术语“载体分子”是指本发明的化合物连接的任何分子。代表性载体分子包括但不限制于蛋白质(例如酶、抗体)、糖蛋白、肽、糖类(例如单糖、寡糖和多糖)、激素、受体、抗原、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子等。“载体分子”也指不能被认为落入“分子”的经典定义的物质，例如固体支持物(例如合成支持物、色谱支持物、膜)、病毒和微生物。
符号显示与键垂直，表明所显示的部分与分子的剩余部分连接的点。
本文所述的化合物可具有一个或多个不对称中心或平面。含有不对称取代的原子的本发明的化合物可以以光学活性形式或外消旋形式分离。本领域熟知如何制备光学活性形式，如通过拆分外消旋形式(外消旋体)、通过不对称合成或通过由光学活性起始材料合成。外消旋体的拆分可以通过例如常规方法完成，例如在拆分试剂的存在下结晶，或者使用例如手性HPLC色谱柱进行色谱。烯烃的许多几何异构体、C＝N双键等也可以存在于本文所述的化合物中，并且所有这些稳定的异构体都被考虑在本发明中。描述了本发明的化合物的顺式和反式几何异构体，并且所述顺式和反式异构体可以作为异构体的混合物或作为分开的异构体形式被分离。除非具体指出具体的立体化学或异构形式，否则意指所有手性(对映异构体和非对映异构体)和外消旋形式，以及所有几何异构形式的结构。
本文使用的外消旋体、双外消旋(ambiscalemic)体和非外消旋(scalemic)体或对映异构体纯的化合物的图示获得自Maehr,J.Chem.Ed.,62:114-120(1985)：实楔形和虚楔形用于表示手性元素的绝对构型；波形线表示否认它代表的键可能产生的任何立体化学含意；实粗线和虚粗线是几何描述符号，表示所示的相对构型但不暗示任何绝对的立体化学；并且楔形轮廓和点或虚线表示具有不定的绝对构型的对映异构性纯的化合物。
术语“带电基团”是指带有负电荷或正电荷的基团。负电荷或正电荷可以具有选自1、2、3或更高的整数或分数的电荷数。示例性带电基团包括例如-OPO3 2-、-OPO2 -、-P+Ph3、-N+R’R”R”’、-S+R和-C(O)O-。
本文描述的化合物可以具有一个或多个带电基团。例如，该化合物可以是两性离子的，但总体上可以是中性的。其他实施方式根据pH和其他因素可以具有一个或多个带电基团。在这些实施方式中，化合物可以与合适的反离子结合。本领域熟知如何制备盐或交换反离子。这些盐可以通过使游离酸形式的这些化合物与化学计量的适当碱(例如氢氧化Na、氢氧化Ca、氢氧化Mg或氢氧化K，碳酸Na、碳酸Ca、碳酸Mg或碳酸K，碳酸氢Na、碳酸氢Ca、碳酸氢Mg或碳酸氢K等)反应来制备，或通过使游离碱形式的这些化合物与化学计量的适当酸反应来制备。这样的反应通常在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中进行。反离子可以通过例如离子交换技术如离子交换色谱来改变。除非明确指出反离子或盐，否则意指所有的两性离子、盐和反离子。在某些实施方式中，盐或反离子可以是药学上可接受的，用于施用于受试者。随后讨论药学上可接受的盐。
可选择地，本发明的化合物可以在酸不稳定部分裂解后形成包括一个或多个带电基团的化合物。
在一些实施方式中，本文使用的术语的定义依据IUPAC。
双猝灭剂探针
在一个方面，本发明提供了一种核酸探针，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与其连接的第一猝灭剂和第二猝灭剂，其中第一猝灭剂连接在寡核苷酸的内部位置。
第一猝灭剂和第二猝灭剂如本文所定义。
在一些实施方式中，该寡核苷酸还包括荧光团。荧光团如本文所定义。
在一些实施方式中，本发明提供了包括具有以下结构的寡核苷酸的核酸探针：
5’-Y1-L1-LQ1-L2-Y2-3’，
其中Y1包括两个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列；Y2包括两个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列。Y1和Y2中的一个具有与其核苷酸序列(直接或通过接头)共价连接的荧光团，Y1和Y2中的另一个具有与其核苷酸序列(直接或通过接头)共价连接的第二猝灭剂。L1和L2独立地选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。LQ1是：
其中Q1是第一猝灭剂。第一猝灭剂、第二猝灭剂和荧光团如本文所定义。
Y1、Y2、L1、L2和LQ1的任意组合被涵盖在本公开中，并特别地由本发明提供。
在一些实施方式中，Y1的核苷酸序列包括具有(直接或通过接头)共价连接于荧光团或第二猝灭剂的5’磷酸酯的第一核苷酸N1，和具有共价连接于L1的3’磷酸酯的第二核苷酸N2。
在一些实施方式中，Y2的核苷酸序列包括具有共价连接于L2的5’磷酸酯的第三核苷酸N3，和具有(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂或荧光团的3’磷酸酯的第四核苷酸N4。
在一些实施方式中，当第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂；而当第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂时，第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团。
在一些实施方式中，核酸探针进一步包括连接于使第一核苷酸N1的5’磷酸酯连接于荧光团或第二猝灭剂的接头的一个或多个DNA或RNA核苷酸。在一些实施方式中，核酸探针进一步包括连接于使第四核苷酸N4的3’磷酸酯连接于第二猝灭剂或荧光团的接头的一个或多个DNA或RNA核苷酸。
在一些实施方式中，寡核苷酸包括15至45个(即15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45)个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸包括20至30个(即20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸(总共)具有15至45个(即15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45)个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸(总共)具有20至30个(即20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸。
在一些实施方式中，第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团；而第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂。
在一些实施方式中，当第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，Y1是8至11(即8、9、10或11)个核苷酸的序列。在一些实施方式中，当第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，Y1是9个核苷酸的序列。
在一些实施方式中，当第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，Y1是8至11个核苷酸的序列，Y2是6至24(即6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)个核苷酸的序列。
在一些实施方式中，第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂；第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团。
在一些实施方式中，当第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，Y2是8至11(即8、9、10或11)个核苷酸的序列。在一些实施方式中，当第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，Y2是9个核苷酸的序列。
在一些实施方式中，当第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团时，Y2是8至11个核苷酸的序列，Y1是6至24(即6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24)个核苷酸的序列。
在一些实施方式中，L1是未取代的烷基。在一些实施方式中，L1是未取代的C1-C7(即C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7)烷基。在一些实施方式中，L1是未取代的C1-C3(即C1、C2或C3)烷基。在一些实施方式中，L1是甲基。在一些实施方式中，L1是乙基。在一些实施方式中，L1是正丙基。
在一些实施方式中，L2是未取代的烷基。在一些实施方式中，L2是未取代的C1-C7(即C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7)烷基。在一些实施方式中，L2是未取代的C1-C3(即C1、C2或C3)烷基。在一些实施方式中，L2是甲基。在一些实施方式中，L2是乙基。在一些实施方式中，L2是正丙基。
在一些实施方式中，L1和L2各自是相同的。在一些实施方式中，L1和L2不同。在一些实施方式中，L1和L2各自是甲基。在一些实施方式中，L1和L2各自是乙基。在一些实施方式中，L1和L2各自是正丙基。
在一些实施方式中，核酸探针是具有以下结构的寡核苷酸：
5’-Y1-L1-LQ1-L2-Y2-3’
其中Y1、Y2、L1、L2和LQ1如本文所定义。
猝灭剂
第一(内部)猝灭剂
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有包括选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及其组合的至少三个残基的结构，其中残基中的至少两个通过环外重氮键共价连接。
在一些实施方式中，至少三个残基中的每一个是取代或未取代的苯基。
在一些实施方式中，至少三个残基中的至少两个是被至少一个未取代的C1-C6烷基部分取代的苯基。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)通过L3连接于寡核苷酸。L3如本文所定义。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)连接于核苷酸，该核苷酸是从寡核苷酸的5’端向3’端的8、9、10或11个核苷酸。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)连接于从寡核苷酸的5’端到3’端的第8和第9个核苷酸之间、第9和第10个核苷酸之间、第10和第11个核苷酸之间或第11和第12个核苷酸之间。在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)连接于从寡核苷酸的5’端到3’端的第9和第10个核苷酸之间。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)连接于核苷酸，该核苷酸是从寡核苷酸的3’端到5’端的8、9、10或11个核苷酸。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)连接于从寡核苷酸的3’端到5’端的第8和第9个核苷酸之间、第9和第10个核苷酸之间、第10和第11个核苷酸之间或第11和第12个核苷酸之间。在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)连接于从寡核苷酸的3’端到5’端的第9和第10个核苷酸之间。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有选自以下的结构：
Ra、Rb和Rc独立地选自取代或未取代的芳基。
L3选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，Ra、Rb和Rc独立地选自取代或未取代的苯基。
在一些实施方式中，L3是单键。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有选自以下的结构：
其中Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、和硝基。L3如本文所定义。
在一些实施方式中，Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、未取代的烷基和硝基。
在一些实施方式中，Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基和硝基。
在一些实施方式中，Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和硝基。
在一些实施方式中，Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7(如果存在)和Ra8(如果存在)是H。
在一些实施方式中，Rb2、Rb3、Rb4(如果存在)、Rb5、Rb6、Rb7(如果存在)和Rb8(如果存在)独立地选自H、未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基和硝基。在一些实施方式中，Rb2、Rb3、Rb5、Rb6、Rb7(如果存在)和Rb8(如果存在)独立地选自H和未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基。在一些实施方式中，Rb4是硝基。
在一些实施方式中，Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7(如果存在)和Rc8(如果存在)独立地选自H、未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基和硝基。在一些实施方式中，Rc2、Rc3、Rc5、Rc6、Rc7(如果存在)和Rc8(如果存在)独立地选自H和未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基。
Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7、Rc8和L3的任意组合被涵盖在本公开中，并特别地由本发明提供。
在一些实施方式中，Q1具有以下结构：
其中Ra2、Ra3、Ra5和Ra6是H；Rb2、Rb3、Rb5、Rb6、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6和L3如本文所定义。
在一些实施方式中，Rb2、Rb3、Rb5和Rb6中的至少一个(即1个、2个、3个或全部)独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rb2、Rb3、Rb5和Rb6的剩余部分是H。在一些实施方式中，Rb2、Rb3、Rb5和Rb6中的一个是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rb2、Rb3、Rb5和Rb6的剩余部分是H。
在一些实施方式中，Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6中的至少一个(即1个、2个、3个、4个或全部)独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6的剩余部分是H。在一些实施方式中，Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6中的一个是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6的剩余部分是H。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有以下结构：
其中Rb2、Rc2、Rc4和L3如本文所定义。
在一些实施方式中，Rc4是H。在一些实施方式中，Rb2和Rc2独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基；并且Rc4是H。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有选自以下的结构：
其中L3如本文所定义。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有以下结构：
第二猝灭剂
在一些实施方式中，第二猝灭剂具有包括选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及其组合的至少3个残基的结构，其中残基中的至少两个通过环外重氮键共价连接。
在一些实施方式中，第二猝灭剂通过L4连接于寡核苷酸。L4如本文所定义。
在一些实施方式中，第二猝灭剂具有以下结构：
其中Re2、Re5、Rf2和Rf4独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基和硝基；并且L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，Re2和Re5独立地选自H、未取代的烷基和未取代的烷氧基。在一些实施方式中，Re2和Re5独立地选自H、未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基和未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷氧基。在一些实施方式中，Re2和Re5独立地选自H、甲基和甲氧基。
在一些实施方式中，Rf2和Rf4独立地选自H、未取代的烷基和硝基。在一些实施方式中，Rf2和Rf4独立地选自H、未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基和硝基。在一些实施方式中，Rf2和Rf4独立地选自H、甲基和硝基。
在一些实施方式中，Re2是未取代的C1-C4烷基；Re5是H；Rf2是未取代的C1-C4烷基；并且Rf4是H。
在一些实施方式中，Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷基；Rf2是硝基；并且Rf4是未取代的C1-C4烷基。
在一些实施方式中，Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷氧基；Rf2是H；并且Rf4是硝基。
在一些实施方式中，L4是取代或未取代的二烷基胺。
在一些实施方式中，L4具有以下结构：
其中LN选自取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基；并且RN选自H、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在一些实施方式中，式中所示的氮原子上的连接点是与第二猝灭剂的苯基部分的连接点。
在一些实施方式中，LN是未取代的烷基。在一些实施方式中，LN是未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基。在一些实施方式中，LN是乙基。
在一些实施方式中，RN是取代的或未取代的烷基。在一些实施方式中，RN是取代的或未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)烷基。在一些实施方式中，RN是未取代的C1-C4(即C1、C2、C3或C4)羟烷基。在一些实施方式中，RN是乙基。在一些实施方式中，RN是2-羟乙基。
在一些实施方式中，第二猝灭剂具有以下结构：
其中Re2、Re5、Rf2、Rf4、LN和RN如本文所定义。
在一些实施方式中，第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4如本文所定义。
在一些实施方式中，第二猝灭剂具有以下结构：
第二猝灭剂可以来自猝灭试剂，例如通过猝灭试剂上的反应性官能团与寡核苷酸或与寡核苷酸连接的接头上的互补反应性的反应性官能团反应。
在一些实施方式中，第二猝灭剂是(来自)BHQ(Black Hole生物检索技术公司(Biosearch Technologies,Inc.)，如第7,019,129号美国专利描述的猝灭剂。在一些实施方式中，第二猝灭剂是具有如下结构的BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3衍生物
其中L4如本文所定义。
在一些实施方式中，第二猝灭剂是(来自)提交于2014年5月9日的名称为“Cosmic猝灭剂”的第61/990,913号美国临时专利申请的猝灭剂。在一些实施方式中，第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4如本文所定义。
在一些实施方式中，第二猝灭剂是(来自)黑莓猝灭剂(BlackBerryQuencher)(Berry&Associates公司；描述于第7,879,986号美国专利)。在一些实施方式中，第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4如本文所定义。
在一些实施方式中，第二猝灭剂的结构是本文对第一猝灭剂(Q1)所示的任何结构。
在一些实施方式中，第二猝灭剂是(来自)Dabcyl、Dabsyl、猝灭剂、IowaIowa或Iowa
在一些实施方式中，第二猝灭剂连接于寡核苷酸的3’或5’端。在一些实施方式中，第二猝灭剂连接于寡核苷酸的3’端。
在一些实施方式中，第二猝灭剂连接于第四核苷酸N4的3’磷酸酯或连接于第一核苷酸N1的5’磷酸酯。在一些实施方式中，第二猝灭剂连接于第四核苷酸N4的3’磷酸酯。
荧光团
本发明的化合物的一个优势是广泛的能量供体分子可以与猝灭剂官能化的核酸探针和寡核苷酸结合使用。大量的荧光团对本领域技术人员是已知的。见例如Cardullo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.of ChemicalPhysics 21:836-850(1953)；Hochstrasser等人,Biophysical Chemistry 45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods in Enzymology 246:300-334(1995)；Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang等人,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990)；Wang等人,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。
表1提供了可以与本发明的猝灭剂结合使用的示例性供体的非限制性列表。
表1
文献中存在用于为具体的探针选择合适的供体受体对的大量可用的实践指导，例如以下参考文献：Pesce等人编，荧光光谱(Fluorescence Spectroscopy)(Marcel Dekker,New York,1971)；White等人，荧光分析：实用方法(Fluorescence Analysis:A PracticalApproach)(Marcel Dekker,New York,1970)；等。文献也包括提供荧光分子和显色分子的详尽列表和它们用于选择报告分子-猝灭剂对的光学性能的参考文献(见例如Berlman，芳香族分子的荧光光谱手册(Handbook of Fluorescence Spectra of AromaticMolecules)，第二版(Academic Press,New York,1971)；Griffiths，有机分子的颜色与结构(Colour and Constitution of Organic Molecules)(Academic Press,New York,1976)；Bishop编，指示剂(Indicators)(Pergamon Press,Oxford,1972)；Haugland，荧光探针和研究化学手册(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,荧光和磷光(Fluorescence andPhosphorescence)(Interscience Publishers,New York,1949)；等。而且，文献中存在用于使通过可以加入核酸的常见的反应基团共价连接的报告分子和猝灭剂分子衍生化的大量的指导，例如以下参考文献：Haugland(如上)；Ullman等人，第3,996,345号美国专利；Khanna等人，第4,351,760号美国专利。因此，选择用于具体应用的能量交换对和使能量交换对的成员与探针分子例如核酸、肽或其他聚合物缀合都在本领域技术人员的能力之内。
一般地，优选的是猝灭剂的吸光谱带基本上与供体的荧光发射谱带重叠。当供体(荧光团)是利用供体-受体能量转移的探针的组分时，本发明的供体荧光部分和猝灭剂(受体)优选被选择为使得当供体部分被激发时供体和受体部分表现出供体受体-能量转移。在选择荧光团-猝灭剂对时要考虑的一个因素是它们之间的供体-受体能量转移的效率。优选地，供体和受体部分之间的FRET效率是至少10％，更优选为至少50％，甚至更优选为至少80％。使用本文描述或本领域已知的方法可以容易地实证检验FRET的效率。
也可以通过改变供体和受体基团二聚化或紧密联系的能力来调整供体-受体对之间的能量转移效率。如果供体和受体部分是已知或被确定为紧密联合的，则通过调整供体和受体之间的接头部分或探针本身的长度可以促进联合的增加或减少。通过调整探针构建体中的疏水相互作用或离子相互作用，或位阻排斥力，可以增加或减少供体-受体联合的能力。因此，负责供体-受体对联合的分子内相互作用可以是增强或减弱的。因此例如，通过例如利用具有总负电荷的供体和具有总正电荷的受体，可以降低供体-受体对之间的联合。
除了直接连接于探针的荧光团以外，也可通过间接方式连接荧光团。在该实施方式中，配体分子(例如生物素)通常共价结合于探针物质。然后配体结合于另一种分子(例如链霉亲和素分子)，其固有地可被检测到或共价结合于信号体系，如荧光化合物或通过非荧光化合物的转化产生荧光化合物的酶。作为标记感兴趣的有用的酶包括例如水解酶，具体是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，水解酶、肽酶或氧化酶，具体是过氧化物酶。荧光化合物包括如上文讨论的荧光素和其衍生物、若丹明和其衍生物、丹酰(dansyl)、伞形酮等。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述见第4,391,904号美国专利。
用于与本发明的猝灭剂结合使用的供体包括例如呫吨染料(包括荧光素)、花青染料和若丹明染料。许多合适形式的这些化合物是广泛商业可获得的，在它们的苯基部分具有取代基，所述取代基可以用作结合的位点或用作与核酸连接的结合官能性。与本发明的猝灭剂结合使用的荧光化合物的另一个基团是在α位或β位具有氨基的萘胺。包括在这样的萘胺基化合物中的是1-二甲氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯和2-对甲苯氨基(touidinyl)-6-萘磺酸酯。其他供体包括3-苯基-7-异氰酸基香豆素，吖啶如9-异硫氰酸酯吖啶和吖啶橙、N-(对-(2-苯并唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并二唑、茋、芘等。
在其中探针是核酸探针的示例性的实施方式中，荧光团是荧光素(例如FAM)。荧光团优选连接于核酸的3’-端或5’-端，虽然内部位点也是可以进入的并且具有针对选择的目的的实用性。无论荧光团连接于哪个末端，猝灭剂通常将连接于它的对映点，或核酸链的内部的位置。优选使用供体的亚酰胺衍生物引入供体基团。可供选择地，通过与在连接到核酸的栓链(tether)或接头臂上的反应性官能团(例如己胺)反应，可以引入包括反应性官能团(例如异硫氰酸酯、活性酯等)的供体基团。
在另一种优选的实施方式中，可以通过使用衍生化的合成支持物在核酸的3’端连接供体部分。例如，使用以该荧光团(Biosearch Technologies,Inc.)的类似物衍生化的固体支持物将TAMRA(四甲基若丹明羧酸)连接于核酸的3’端。
考虑到涉及小分子与核酸缀合的文献中良好发展的主体，将供体/受体对连接于核酸的许多其他方法对本领域技术人员是显而易见的。例如，在固相合成结束时，通过用亚磷酰胺部分衍生化的染料的方式将若丹明和荧光素染料便利地连接于核酸的5’-羟基(见例如Woo等人，第5,231,191号美国专利；和Hobbs,Jr.，第4,997,928号美国专利)。
更特别地，存在许多接头部分和用于将基团连接于核酸的5’端或3’端的方法，例如通过以下的参考文献例证的：Eckstein,编者，核酸和类似物：实用方法(Nucleic Acidsand Analogues:A Practical Approach)(IRL Press,Oxford,1991)；Zuckerman等人,Nucleic Acids Research,15:5305-5321(1987)(核酸上的3’-硫醇基团)；Sharma等人,Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3’-巯基)；Giusti等人,PCR方法和应用(PCRMethods and Applications),2:223-227(1993)和Fung等人，第4,757,141号美国专利(5’-磷氨基基团，通过从P.E.Biosystems,CA.获得的Aminolink TM II所得)。Stabinsky，第4,739,044号美国专利(3-氨基烷基磷酰基团)；Agrawal等人,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)(通过磷酰胺键的连接)；Sproat等人,Nucleic Acids Research,15:4837(1987)(5-巯基)；Nelson等人,Nucleic Acids Research,17:7187-7194(1989)(3’-氨基)等。
检测荧光标记的手段对本领域技术人员是熟知的。因此，例如，可以通过用合适波长的光激发荧光团并检测产生的荧光来检测荧光标记。可以视觉地，通过胶片的手段，通过使用电子检测器如电荷耦合装置(CCD)或光子倍增器等检测荧光。相似地，通过提供合适的用于酶的底物和检测产生的反应产物可以检测酶标记。
荧光团可以是非蛋白质有机荧光团或荧光蛋白。非蛋白质有机荧光团的示例性家族是：呫吨衍生物(如荧光素，若丹明，俄勒冈绿，曙红和德克萨斯红)、花青衍生物(如花青，吲哚碳花青，氧碳花青，硫碳花青和部花青)、方酸(squaraine)衍生物和环取代的方酸(包括Seta，SeTau和方染料(Squaredyes))、萘衍生物(如丹酰和普罗丹(prodan)衍生物)、香豆素衍生物、二唑衍生物(如吡啶基唑、硝基苯并二唑和苯并二唑)、蒽衍生物(如蒽醌、包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)、芘衍生物(例如级联蓝(cascadeblue))、嗪衍生物(如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和嗪170)、吖啶衍生物(如原黄素、吖啶橙和吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(如金胺、结晶紫和孔雀石绿)、和四吡咯衍生物(如卟吩、酞菁和胆红素)。
在一些实施方式中，荧光团是(来自)6-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯荧光素(TET)、6-羧基若丹明(R6G)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、1-二甲氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐、2-对甲苯胺基-6-萘磺酸盐、5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、香豆素染料、吖啶染料、吲哚二羰花青3(Cy3)、吲哚二羰花青5(Cy5)、吲哚二羰花青5.5(Cy5.5)、3-(1-羧基-戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧杂羰花青(CyA)、1H,5H,11H,15H-呫吨并[2,3,4-ij:5,6,7-i’j’]二喹嗪-18-、9-[2(或4)-[[[6-[2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代己基]氨基]磺酰基]-4(或2)磺基苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17-八氢-内盐(TR或德克萨斯红)、BODIPY染料、苯并唑、茋或芘。
在一些实施方式中，荧光团来自6-羧基荧光素(FAM)。在一些实施方式中，荧光团包括荧光素部分。
在一些实施方式中，荧光团通过L5连接于寡核苷酸。L5如本文所定义。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
在一些实施方式中，荧光团来自6-羧基-四氯荧光素。在一些实施方式中，荧光团包括四氯荧光素(TET)部分。
在一些实施方式中，荧光团通过L5连接于寡核苷酸。L5如本文所定义。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
在一些实施方式中，荧光团是(来自)第7,344,701号美国专利中描述的呫吨染料。
在一些实施方式中，荧光团是(来自)CALGold 540(LGC生物检索技术(LGCBiosearch Technologies))。在一些实施方式中，荧光团包括CALGold 540(LGC生物检索技术)部分。
在一些实施方式中，荧光团通过L5连接于寡核苷酸。L5如本文所定义。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
在一些实施方式中，荧光团是(来自)CALOrange 560(LGC生物检索技术)。在一些实施方式中，荧光团包括CALOrange 560(LGC生物检索技术)部分。
在一些实施方式中，荧光团通过L5连接于寡核苷酸。L5如本文所定义。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
在一些实施方式中，荧光团来自6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(HEX)。在一些实施方式中，荧光团包括6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(HEX)部分。
在一些实施方式中，荧光团通过L5连接于寡核苷酸。L5如本文所定义。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
在一些实施方式中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的杂烷基。
在一些实施方式中，荧光团具有以下结构：
在一些实施方式中，荧光团具有选自以下的结构：
L5如本文所定义。
在一些实施方式中，荧光团具有选自以下的结构：
在一些实施方式中，荧光团连接于寡核苷酸的5’或3’端。在一些实施方式中，荧光团连接于寡核苷酸的5’端。在一些实施方式中，荧光团连接于第一核苷酸N1的5’磷酸酯或连接于第四核苷酸N4的3’磷酸酯。在一些实施方式中，荧光团连接于第一核苷酸N1的5’磷酸酯。
示例性猝灭剂/荧光团组合
如本文定义的第一猝灭剂(Q1)、第二猝灭剂和荧光团的任何组合被涵盖在本公开中，并特别地由本发明提供。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有以下结构：
第二猝灭剂具有以下结构：
并且荧光团具有选自以下的结构：
L3、L4和L5如本文所定义。
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有以下结构：
第二猝灭剂具有以下结构：
并且荧光团具有选自以下的结构：
在一些实施方式中，第一猝灭剂(Q1)具有以下结构：
第二猝灭剂具有以下结构：
并且荧光团具有以下结构：
低聚物
还提供了核酸低聚物，例如探针。示例性低聚物包括各自任选地通过接头共价连接于该低聚物的两种猝灭剂(即第一猝灭剂和第二猝灭剂)。示例性低聚物包括各自任选地通过接头共价连接于该低聚物的两种猝灭剂(即第一猝灭剂和第二猝灭剂)和荧光团。
示例性低聚物包括寡核苷酸、寡核苷、寡脱氧核糖核苷酸(包含2’-脱氧基-D-核糖或其修饰形式)即DNA、寡核糖核苷酸(包含D-核糖或其修饰的形式)即RNA，以及任何其他类型的多核苷酸，所述其他类型的多核苷酸是嘌呤或嘧啶核碱基或修饰的嘌呤或嘧啶核碱基的N-糖苷或C-糖苷。如本文使用的低聚物还包括化合物，其中相邻的核单体通过酰胺键连接，如之前所描述的(Nielsen等人,Science(1991)254:1497-1500)。一般在低聚物中发现的元件，如呋喃糖环和/或磷酸二酯键可以被任何合适的功能上等价的元件取代。“低聚物”因此意图包括充当用于核碱基的支架或支持物的任何结构，其中支架允许以序列依赖的方式结合于靶核酸。
连接本发明的低聚物中的核单体的示例性基团包括(i)磷酸二酯和磷酸二酯修饰物(硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等)，(ii)含有非磷等排物(甲酰缩醛(formacetal)、核糖缩醛(riboacetal)、氨基甲酸酯等)的替代键，(iii)吗啉基残基、碳环残基或其他呋喃糖，如阿拉伯糖，或代替核糖或脱氧核糖的己糖，以及(iv)通过酰胺键连接的核单体或通过任何合适的替代键连接的非环核单体。
本发明的低聚物可以用修饰的和常见的核单体形成，以及使用目前商业可获得的标准固相(或溶液相)低聚物合成技术合成。通常，通过包括以下步骤的方法合成低聚物：合成具有保护基团和核碱基以及能够偶联于核单体或低聚物的偶联基团的核单体或低聚物合成子；将核单体或低聚物合成子偶联于受体核单体或受体低聚物；移除保护基团；并根据需要重复循环直至合成希望的低聚物。
本发明的低聚物可以是包括大于40、50或100个核单体的低聚物的任何长度的低聚物。在各种实施方式中，低聚物含有2～100个核单体。大于或等于约10～40个核单体的长度对治疗性或诊断性应用是有用的。本发明特别地包括含有2、3、4或5个核单体的短低聚物，并且所述短低聚物是有用的，例如用作合成子。
具有随机化序列并含有少于20个、少于15个或少于10个核单体的低聚物对引物是有用的(例如在使用随机序列引物的克隆或扩增方案中的引物)，条件是低聚物含有可以作为用于聚合酶或反转录酶的引物的残基。
低聚物可包含常规的磷酸二酯键，或可包含磷酸二酯修饰物如磷酰胺键。这些替代键包括但不限于以下实施方式，其中式-O-P(O)(S)-O-(“硫代磷酸酯”)、-O-P(S)(S)-O-(“二硫代磷酸酯”)、-O-P(O)-(NRo 2)-X-、-O-P(O)(Ro)-O-O-P(S)(Ro)-O-(“硫逐烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonate)”)、-P(O)(ORp)-X-、-O-C(O)-X-或-O-C(O)(NRp 2)-X-的部分，其中Ro是H(或盐)或烷基(C1-C12)，且Rp是烷基(C1-C9)，以及通过结合于核单体的碳的-O-或-S-使所述键与相邻的核单体连接。在各种实施方式中，用于本发明的低聚物的替代键包括磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键和硫逐甲基膦酸酯键。硫代磷酸酯键和甲基膦酸酯键向生理环境下的低聚物提供额外的稳定性。虽然不需要相同低聚物中所有这样的键是相同的，但尤其优选的本发明的低聚物含有一致的硫代磷酸酯键或一致的甲基膦酸酯键。
低聚物或其片段是常规地合成的，并且可以使用本发明的化合物制备。可以使用本领域已知和本文描述的合成方法，使用适当保护的核单体，合成含有本发明的化合物的低聚物以及本领域已知的其他碱基。发现了用于合成低聚物的方法，例如Froehler,B.,等人,nucleic acid Res.(1986)14:5399-5467；nucleic acids Res.(1988)16:4831-4839；nucleosides and nucleic acids(1987)6:287-291；Froehler,B.,Tetrahedron Lett.(1986)27:5575-5578；Caruthers,M.H.，寡脱氧核苷酸-基因表达的反义抑制(Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression)(1989),J.S.Cohen,编者,CRC Press,Boca Raton,p7-24；Reese,C.B.等人,Tetrahedron Lett.(1985)26:2245-2248。还描述了通过甲基亚磷酰胺(methyl phosphonamidite)化学结构合成甲基膦酸酯连接的低聚物(Agrawal,S.等人,Tetrahedron Lett.(1987)28:3539-3542；Klem,R.E.,等人，第WO 92/07864号国际公开)。
如本文公开的，本发明提供了低聚物的“缀合物”。例如，低聚物可以共价连接于各种功能性组分，如稳定部分、荧光团、猝灭剂、插入剂和与DNA双螺旋的小沟特异地相互作用的物质(小沟结合剂，“MGB”)。其他选择的缀合部分可以是标记如放射性标记、荧光标记、酶标记或使用可裂解接头促进细胞联合的部分等。合适的放射性标记包括32P、35S、3H和14C；合适的荧光标记包括荧光素、试卤灵、若丹明、BODIPY(分子探针)和德克萨斯红；合适的酶包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。另外的荧光团是本文中阐述的，并且是本领域公认的。其他共价连接部分包括生物素、抗体或抗体片段和蛋白质(例如转铁蛋白和HIV Tat蛋白)。
如本文讨论的和本领域公认的，可以通过任何方便的键合使低聚物衍生化。例如小沟结合剂、荧光团、猝灭剂和插入剂，如吖啶或补骨脂素可通过任何可用的-OH或-SH连接于本发明的低聚物，例如低聚物的5’-端位、RNA的2’-位或掺入嘧啶的5-位的OH、NH2、COOH或SH。在5-位含有例如-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2OH或-CH2CH2CH2SH的衍生化形式用于本发明。可以如所描述的合成包括聚赖氨酸或赖氨酸的缀合物，且所述缀合物可以进一步提高低聚物与其靶核酸序列的结合亲和性(Lemaitre,M.等人,Proc Natl Acad Sci(1987)84:648-652；Lemaitre,M.等人,nucleosides and nucleic acids(1987)6:311-315)。
可以连接各种各样的取代基，包括通过键和替代键结合的取代基。低聚物的磷酸二酯键的-OH部分可以被磷酸基团取代，通过标准保护基团，或偶联基团保护以制备与其他核单体的另外的键，或可以结合到缀合的取代基。5’-端OH可以是磷酸化的；2’-OH或3’端的OH取代基也可以是磷酸化的。羟基也可以被衍生化为标准保护基团。
本发明的低聚物可以被共价衍生化为使用可裂解接头促进细胞联合的部分。用于这样的缀合物的接头可包括二硫键键，所述二硫键在低聚物运输剂缀合物进入细胞后被还原。该类型的含有二硫键的接头具有可控制的半衰期。由于二硫键连接的氧化还原电势，相对于胞内条件，这样的接头在胞外条件下是稳定的。
反应性官能团
本发明的化合物的组分(例如接头、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、载体分子和固体支持物)可以通过由第一反应性官能团和第二反应性官能团的反应形成的键合位点连接。反应性官能团具有互补反应性，并且它们反应以在化合物的两种组分之间形成共价连接，本文中被称为键合位点。例如，根据式(I)或(II)的化合物，其中Rx或Rs是可以与在另一种组分(如接头、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、载体分子和固体支持物)上的互补反应性的反应性官能团反应以通过所产生的键合位点共价连接组分的反应性官能团。互补反应性的反应性官能团可以位于其他组分(接头、核苷等)的任何位置，例如烷基或杂烷基，芳基或杂芳基核心，或芳基或杂芳基核心上的取代基。在各种实施方式中，当反应基团连接于烷基(或杂烷基)，或取代的烷基(或杂烷基)链时，反应性基团优选位于链的末端位置。
用于实践本发明的反应性基团和反应的类别在生物缀合物化学领域中通常是熟知的那些。目前，用本发明的低聚物的反应性前体可得到的反应的有利的类别是在相对温和条件下进行的反应。这些包括但不限于亲核取代(胺和醇与酰基卤，活性酯的反应)、亲电取代(例如烯胺反应)，以及碳碳和碳杂原子多重键的加成(例如迈克尔加成反应、第尔斯-阿尔德加成反应)。例如March,高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)，第三版，John Wiley和Sons,New York,1985；Hermanson,生物缀合物技术(BioconjugateTechniques),Academic Press,San Diego,1996；以及Feeney等人,蛋白质的修饰(Modification of Proteins)；化学系列的进展(Advances in Chemistry Series),Vol.198,美国化学学会,Washington,D.C.,1982中讨论了这些和其他有用的反应。
例如，本发明中使用的反应性官能团包括但不限于烯烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮基、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐、次磺酸异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸酯、硝酮、羟胺、肟、异羟肟酸、硫代异羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳化二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物、和亚硝基化合物。反应性官能团也包括用于制备生物缀合物的官能团，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。用于制备每个这些官能团的方法是本领域熟知的，并且它们应用于具体目的或出于具体目的修饰在本领域技术人员的能力范围内(见例如Sandler和Karo编,有机官能团制备(ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS),Academic Press,San Diego,1989)。
有用的反应性官能团转化包括，例如：
(a)容易地转化为各种衍生物的羧基基团，所述衍生物包括但不限于活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、硫酯、对-硝基苯酯)、酰基卤、酰基咪唑、烷基、链烯基、炔基和芳香族酯；
(b)羟基基团，其可以转化为酯、醚、卤化物、醛等；
(c)卤代烷基基团，其中卤化物随后可以被亲核基团例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子取代，由此导致在卤素原子的位置共价连接新基团；
(d)亲二烯体基团，其能够参与第尔斯-阿尔德反应，例如马来酰亚胺基基团；
(e)醛或酮基团，使得通过形成羰基衍生物，例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟的后续衍生化，或通过如格利雅加成或烷基锂加成这的机制的后续衍生化是可能的；
(f)磺酰卤基团，用于与胺的后续反应，例如形成磺胺；
(g)硫醇基，其可以例如转化为二硫化物或与酰基卤反应；
(h)胺或巯基基团，其可以例如被酰化、烷基化或氧化；
(i)烯，其可经历例如环加成、酰化、迈克尔加成等；
(j)环氧化物，其可与例如胺和羟基化合物反应；以及
(k)亚磷酰胺和用于核酸合成的其他标准官能团。
选择反应性官能团，以便它们不参与或干扰对组装本发明的低聚物必需的反应。供选择地，可以通过保护基团的存在保护反应性官能团避免参与反应。本领域技术人员理解如何保护具体的官能团以便其不干扰选择的一组反应条件。有用的官能团的例子，参见例如Greene等人，有机体系中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis),John Wiley和Sons,New York,1991。
共价键合部分
本发明的一些低聚物包括反应性官能团部分，其能够影响低聚物和靶序列之间的至少一个共价键。通过提供多个这样的部分也可以形成多重共价键。共价键优选用于靶链的核碱基残基，也可以用其他部分的靶标(包括糖或磷酸二酯)制成。影响交联剂的部分的反应性质决定了双螺旋中靶标的性质。优选的交联剂部分包括酰化剂和烷基化剂，尤其是相对于提供序列特异性部分的位置定位的那些，以便允许与链中的靶位置反应。
可以将交联剂部分方便地置于低聚物序列中类似的嘧啶或嘌呤残基位置。定位可以在5’-和/或3’-端、序列的内部或以上的组合。优选在末端位置的放置以使柔性提高。类似部分也可以连接到肽骨架。
用于本发明的烷基化部分的例子包括N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶和N6,N6-桥亚乙基腺嘌呤。
很明显核碱基不需要是嘌呤或嘧啶；事实上反应功能连接的部分完全不需要是核碱基，而且可以是糖、接头、猝灭剂、稳定部分、荧光团或本发明的这些低聚物组分的一些组合。连接反应性基团的任何手段只要位置是正确的就符合要求。
合成
通常照惯例合成本发明的化合物(如本发明的固体支持物、单体(例如亚磷酰胺)和低聚物或其片段)。见例如第7,019,129号美国专利；第8,466,266号美国专利和第7,879,986号美国专利。本领域已知和本文描述的合成方法可用于使用适当保护的核单体合成含有本发明的化合物的低聚物，以及本领域已知的其他碱基。用于合成低聚物的方法可见于，例如Froehler,B.,等人,Nucleic acids Res.(1986)14:5399-5467；Nucleic acids Res.(1988)16:4831-4839；nucleosides and nucleotides(1987)6:287-291；Froehler,B.,Tetrahedron Letters(1986)27:5575-5578；Caruthers,M.H.，基因表达的寡脱氧核苷酸-反义抑制(Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression)(1989),J.S.Cohen,编者,CRC Press,Boca Raton,p7-24；Reese,C.B.等人,TetrahedronLetters(1985)28:2245-2248。还描述了通过甲基亚磷酰胺化学结构合成甲基膦酸酯连接的低聚物(Agrawal,S.等人,Tetrahedron Letters(1987)28:3539-3542；Klem,R.E.,等人,第WO 92/07864号国际公开)。
在示例性的实施方式中，使用标准合成条件和试剂，将核单体直接掺入低聚物或其适当的片段。通过该方法形成的示例性键包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、碳酸酯、吗啉代氨基甲酸酯和磺酸酯。
在各种实施方式中，合成涉及从适当的前体开始合成短合成子(二聚体、三聚体等)。该途径适于合成包括以下的键，N-甲基羟胺、二甲基氢化偶氮、氨基磺酸酯、氨基甲酸酯、磺酸酯、磺胺、缩甲醛(formacetal)、硫代缩甲醛(thioformacetal)和碳酸酯。
本发明的低聚物可以通过任何合适的化学方法合成，包括亚酰胺、三酯或氢磷酸酯偶联方法和条件。低聚物优选从合适的起始合成子合成，所述起始合成子优选在5’-位用DMT、MMT、FMOC(9-芴基甲氧基羰基)、PACO(苯氧基乙酰基)，甲硅烷基醚如TBDMS(叔丁基二苯基甲硅烷基)或TMS(三甲基甲硅烷基)保护，并在3’-位激活为酯、H-磷酸酯、亚酰胺，如β-氰乙基亚磷酰胺，甲硅烷基醚如TBDMS或TMS或叔丁基二苯基。可供选择地，合适的尿苷或胞苷前体如嵌段的5-碘代-2’-脱氧尿苷、5-碘代-2’-O-烷基尿苷、5-溴代-2’-脱氧尿苷、5-三氟甲烷磺酸酯-2’-脱氧尿苷、5-溴代-2’-O-烷基尿苷或嵌段的和受保护的5-碘代-2’-脱氧胞苷、5-溴代-2’-脱氧胞苷、5-三氟甲烷磺酸酯-2’-脱氧胞苷、5-碘代-2’-O-烷基胞苷、5-溴代-2’-O-烷基胞苷，可被方便地掺入短的低聚物，如二聚体、三聚体、四聚体或五聚体或更长的合成子中，该短的低聚物随后被衍生化以产生合适的合成子和更长的低聚物。
使用合成子如单体、二聚体或三聚体完成含有约4个或更多个核单体残基的低聚物的示例性合成，所述合成子携带适于与亚酰胺、H-磷酸酯或三酯化学物质使用的偶联基团。合成子可用于通过磷酸二酯或含磷键而非磷酸二酯(例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硫逐甲基膦酸酯、磷酰胺等)连接低聚物的组分。
其他含非磷的取代键的合成可以使用本领域已知的合适的前体完成。
一旦合成了希望的核酸，优选从其合成和处理的固体支持物上通过本领域已知的方法裂解，以移除存在的任何保护基团(例如60℃，5h，浓氨)。在碱基敏感基团(例如TAMRA)连接于核酸的那些实施方式中，去保护优选使用更温和的条件(例如，丁胺:水1:3，8个小时，70℃)。通过使用快速去保护剂亚酰胺(例如dC-乙酰基、dG-dmf)促进在这些条件下的去保护。
从支持物裂解和去保护之后，通过本领域已知的任何方法纯化核酸，所述方法包括色谱、萃取和凝胶纯化。在优选的实施方式中，使用HPLC纯化核酸。优选通过在分光光度计中测量260nm处的光密度来确定分离的核酸的浓度和纯度。
本发明的测定和低聚物探针
在各种实施方式中，本发明提供了用于一种或多种测定形式的低聚物。在选择的实施方式中，低聚物参与与其靶标联合或解离时可检测信号的产生。本发明的低聚物探针不限于用于任何具体测定的形式。因此，下面的描述意图说明本发明的低聚物可使用的示例性测定形式，而不意图限制所述低聚物可使用的测定形式。
测定
下面的讨论一般地与本文描述的测定相关。该讨论意图通过引用某些优选的实施方式说明本发明，并且不应被解释为限制可使用本发明的化合物的探针和测定类型的范围。利用本发明的化合物的其他测定形式对本领域技术人员是显而易见的。
通常，为确定靶分子例如未知量的核酸的浓度，优选首先获得参比数据，其中恒定量的探针与一定范围内的已知量的核酸标准品接触。使用来自每个参比混合物的荧光发射强度以获得图像或标准曲线，其中将未知浓度与已知标准品的强度比较。例如，以下的探针可用于获得这样的参比数据：a)与靶核酸内的序列杂交；b)在5’-和3’-末端为标记位点时具有荧光团和猝灭剂修饰；并且c)具有在未结合构象中猝灭的荧光特性，然后在结合于靶核酸时释放信号。这样的探针提供了特征性的荧光发射，其中信号随靶核酸浓度的增加而增加。然后，将未知量的靶标样品与探针接触，确定来自混合物的荧光强度。然后与参比标准比较荧光发射的强度，以获得测试混合物中的靶标的浓度。
多重分析
在另一种实施方式中，利用本发明的固体支持物和低聚物作为用于检测混合物中的一种或多种物质的多重测定中的探针或一种或多种探针的组分。
在进行多重类型分析和测定中，基于本发明的固体支持物或低聚物的探针是尤其有用的。在典型的多重分析中，使用两种或更多种探针检测两种或更多种不同的物质(或一种或多种物质的不同区域)，其中每种探针标记了不同的荧光团。用于依赖供体受体能量转移的多重分析的优选物质满足至少两个标准：荧光物质是明亮的和光谱良好分辨的；并且荧光物质和猝灭剂之间的能量转移是有效的。
本发明的固体支持物和低聚物允许多重测定的设计，其中多于一种荧光报告分子(reporter)与一种或多种猝灭剂结构配偶。使用本发明的固体支持物或低聚物的许多不同的多重测定对本领域技术人员是显而易见的。在一种示例性测定中，至少两种不同的荧光报告分子与在它们各自的低聚物上的相同类型的猝灭剂结构配对，以通过FRET或接触猝灭调节信号。可供选择地，可以实施测定，其中将至少两种不同的荧光报告分子与不同的荧光特性更好地“匹配”的猝灭剂结构配偶。荧光团可结合于与猝灭剂相同的分子或不同的分子。此外，与猝灭剂和荧光团相似，在具体的测定系统(如共价连接荧光团和猝灭剂的寡序列)中使用的载体分子可以是相同的或不同的。
除上面描述的混合物以外，本发明还提供了检测具体的分子物质存在的定性方法。该方法包括：(a)使所述物质与含有本发明的固体支持物或低聚物的混合物接触；以及(b)检测产生的混合物的一种或多种组分的荧光特性的改变，以此检测分子物质的存在。
使用供体-受体能量转移的两种或更多种探针的同时使用是本领域已知的。例如，已经描述了使用具有不同序列特异性的核酸探针的多重测定。荧光探针已经用于确定个体是纯合的野生型、纯合的突变体或对于特定突变是杂合的。例如，使用识别野生型序列的一种荧光素猝灭的分子信标和识别突变等位基因的另一种若丹明猝灭的分子信标，对个体进行针对β-趋化因子受体的基因型分型是可能的(Kostrikis等人.Science 279:1228-1229(1998))。仅荧光素信号存在说明个体是野生型，仅若丹明信号存在说明个体是纯合的突变体。若丹明和荧光素信号二者均存在是杂合子的特征。Tyagi等人.NatureBiotechnology16:49-53(1998)描述了四种不同标记的分子信标同时用于辨别等位基因，以及Lee等人,BioTechniques 27:342-349(1999)描述了对六种PCR产物的七种颜色的同源检测。
本发明的猝灭剂可以用于多重测定，所述多重测定被设计为检测和/或定量基本上任何物质，包括例如全细胞、病毒、蛋白质(例如酶、抗体、受体)、糖蛋白、脂蛋白、亚细胞颗粒、生物体(例如沙门氏菌)、核酸(例如DNA、RNA和其类似物)、多糖、脂多糖、脂质、脂肪酸、非生物聚合物和小分子(例如毒素、药物、杀虫剂、代谢物、激素、生物碱、类固醇)。
核酸探针
本发明的固体支持物和低聚物是有用的核酸探针，并且他们可以用作各种DNA扩增/定量策略的检测剂的组分，所述DNA扩增/定量策略包括例如5’-核酸酶测定、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)；以及用于对溶液相或固相(例如阵列)测定中的靶标的直接检测。此外，固体支持物和低聚物可以用于基本上任何形式的探针，包括例如选自分子信标、Scorpion探针TM、Sunrise探针TM、构象辅助探针、发光探针、入侵者检测探针(Invader Detection probes)和TaqManTM探针的形式。见例如，Cardullo,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.Chem.Physics,21:836-850(1953)；Hochstrasser,R.A.等人,Biophysical Chemistry,45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods in Enzymology,246:300-334(1995)；Steinberg,I.,Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.,Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang,G.等人,Tetrahedron Letters,31:6493-6496(1990)；Wang,Y.等人,Anal.Chem.,67:1197-1203(1995)；Debouck,C.等人,nature genetics增刊,21:48-50(1999)；Rehman,F.N.等人,Nucleic Acids Research,27:649-655(1999)；Cooper,J.P.等人,Biochemistry,29:9261-9268(1990)；Gibson,E.M.等人,Genome Methods,6:995-1001(1996)；Hochstrasser,R.A.等人,Biophysical Chemistry,45:133-141(1992)；Holland,P.M.等人,ProcNatl.Acad.Sci USA,88:7276-7289(1991)；Lee,L.G.等人,Nucleic Acids Rsch.,21:3761-3766(1993)；Livak,K.J.等人,PCR Methods and Applications,Cold SpringHarbor Press(1995)；Vamosi,G.等人,Biophysical Journal,71:972-994(1996)；Wittwer,C.T.等人,Biotechniques,22:176-181(1997)；Wittwer,C.T.等人,Biotechniques,22:130-38(1997)；Giesendorf,B.A.J.等人,Clinical Chemistry,44:482-486(1998)；Kostrikis,L.G.等人,Science,279:1228-1229(1998)；Matsuo,T.,Biochemica et Biophysica Acta,1379:178-184(1998)；Piatek,A.S.等人,NatureBiotechnology,16:359-363(1998)；Schofield,P.等人,Appl.Environ.Microbiology,63:1143-1147(1997)；Tyagi S.等人,Nature Biotechnology,16:49-53(1998)；Tyagi,S.等人,Nature Biotechnology,14:303-308(1996)；Nazarenko,I.A.等人,Nucleic AcidsResearch,25:2516-2521(1997)；Uehara,H.等人,Biotechniques,26:552-558(1999)；D.Whitcombe等人,Nature Biotechnology,17:804-807(1999)；Lyamichev,V.等人,NatureBiotechnology,17:292(1999)；Daubendiek等人,Nature Biotechnology,15:273-277(1997)；Lizardi,P.M.等人,Nature Genetics,19:225-232(1998)；Walker,G.等人,Nucleic Acids Res.,20:1691-1696(1992)；Walker,G.T.等人,Clinical Chemistry,42:9-13(1996)；以及Compton,J.,Nature,350:91-92(1991)。
因此，本发明提供了用于检测核酸靶序列的方法。所述方法包括：(a)使靶序列与检测核酸(例如本发明的低聚物)接触；(b)使靶结合序列与靶序列杂交，由此改变检测核酸的构象，引起荧光参数的改变；以及(c)检测荧光参数的变化，由此检测核酸靶序列。
除非另外注明，在本文描述的方法中，优选的检测核酸包括单链靶结合序列。结合序列连接于：i)荧光团；ii)第一猝灭剂，和iii)第二猝灭剂。结合序列具有任选地进一步连接于其的稳定部分。此外，在检测核酸与互补序列杂交之前，该检测核酸优选为在荧光团被激发时允许荧光团和猝灭剂之间进行供体-受体能量转移的构象。此外，在该部分描述的每种方法中，检测荧光的改变作为靶序列存在的指示。优选实时检测荧光的改变。
目前优选的核酸探针不要求核酸采用用于探针的二级结构以起作用。在该方法中，并且除非另外注明，在该部分描述的其他方法中，检测核酸可假定基本上任何分子内相关的二级结构，但该结构优选是选自发夹、茎环结构、假结、三股螺旋和构象辅助结构的成员。此外，分子内碱基配对的二级结构优选包括靶结合序列的部分。
在另一方面，本发明提供了用于检测靶序列的扩增的方法。该方法涉及使用扩增反应如PCR。示例性扩增反应包括一个或多个以下的步骤：
(a)使包括感兴趣的靶序列的样品核酸与位于靶序列侧翼的PCR引物杂交；
(b)用聚合酶延伸杂交的引物以产生PCR产物，并使PCR产物的两条链分离以使靶序列的有义链和反义链可进入；
(c)使检测核酸与PCR产物中的靶序列的有义链或反义链杂交，由此改变检测核酸的构象(例如使有助于猝灭效率的任何二级结构或无规卷曲构象线性化)，引起荧光参数的改变(如信号强度)，其中检测核酸包括：
i)单链靶结合序列，其与PCR产物中的靶序列的有义链或反义链的至少一个部分互补并与PCR引物之间的区域杂交；
ii)荧光团；以及
iii)第一猝灭剂和第二猝灭剂；
其中在检测核酸与靶序列杂交之前，该检测核酸优选是在荧光团被激发时允许荧光团和猝灭剂之间进行供体-受体能量转移的构象；以及
(d)测量荧光参数的改变以检测靶序列和其扩增。
任选地，如果在引物延伸期间(上文步骤(b))聚合酶遇到杂交的检测核酸，并且使连接了荧光团和猝灭剂的低聚物水解(如通过聚合酶的二级核酸酶活性)，则可以使荧光参数的变化恒定。
在进一步的方面，本发明提供了确定第一核酸和第二核酸是否杂交的方法。在该方法中，第一核酸是根据本发明的低聚物(在溶液中或结合于固体支持物)。该方法包括：(a)使第一核酸与第二核酸接触；(b)检测选自第一核酸、第二核酸和其组合的成员的荧光特性的改变，由此确定杂交是否发生。
在各种实施方式中，本发明提供了用于检测核酸靶序列的多态性的探针和方法。多态性是指群体中两种或更多种基因决定的替代序列或等位基因的发生。多态性标记或位点是发生趋异(divergence)的基因座。优选的标记具有至少两种等位基因，每种以选择的群中大于1％的频率，更优选大于10％或20％的频率发生。多态性基因座可以小至1个碱基对。多态性标记包括限制性片段长度多态性、可变数量的串联重复序列(VNTR)、高变区、微卫星(minisatellite)、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复和插入元件如Alu。首先鉴别的等位基因形式被任意地指定为参比形式，其他等位基因形式被指定为替代的或变异等位基因。在选择的群体中最频繁发生的等位基因形式有时被称为野生型形式。二倍体生物体可以是对等位基因形式的纯合的或杂合的。双等位基因多态性具有两种形式。三等位基因多态性具有三种形式。
在示例性的实施方式中，本发明的探针用于检测单核苷酸多态性。单核苷酸多态性发生于由单个核苷酸所占据的多态性位点，所述多态性位点是等位基因序列之间的变异的位点。所述位点常常在等位基因的高度保守序列(例如在群体中少于1/100或1/1000的成员变异的序列)之前和之后。通常由于在多态性位点处的一种核苷酸被另一种核苷酸置换，导致单核苷酸多态性出现。转换是一种嘌呤被另一种嘌呤取代，或一种嘧啶被另一种嘧啶取代。颠换是嘌呤被嘧啶取代或嘧啶被嘌呤取代。单核苷酸多态性也可以相对于参比等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入而发生。
可以使用具有两种猝灭剂和荧光团的本发明的低聚物，或可供选择地，可以用能量转移对的成员(例如猝灭剂或荧光团)标记一种或多种核酸。当用猝灭剂标记的核酸是探针时，可以通过观察猝灭剂和核酸之间的相互作用，或更优选地观察猝灭剂对连接于第二核酸的荧光团的荧光的猝灭，来检测第一核酸和第二核酸之间的相互作用。
在一些实施方式中，形成了猝灭剂和荧光团之间的基态复合体。在示例性的实施方式中，猝灭剂和荧光团二者都缀合于相同的核酸低聚物。
除了设计为研究核酸扩增、多态性、检测和定量的一般用途，本发明的固体支持物和低聚物可以用于目前已知或后来发现的基本上任何核酸探针形式。例如，本发明的固体支持物和低聚物可以掺入探针基序，如TaqmanTM探针(Held等人,Genome Res.6:986-994(1996)；Holland等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:7276-7280(1991)；Lee等人,NucleicAcids Res.21:3761-3766(1993))、分子信标(Tyagi等人,Nature Biotechnology 14:303-308(1996)；Jayasena等人,第5,989,823号美国专利,发布于1999年9月23日)、蝎子探针(scorpion probes)(Whitcomb等人,Nature Biotechnology 17:804-807(1999))、日出探针(sunrise probes)(Nazarenko等人,Nucleic Acids Res.25:2516-2521(1997))、构象辅助探针(Cook,R.,第2007/0059752号美国专利申请公开,公开于2007年3月15日)、基于肽核酸(PNA)的发光探针(Kubista等人,WO 97/45539,1997年12月)、双链特异性DNA染料(Higuchi等人,Bio/Technology 10:413-417(1992)；Wittwer等人,BioTechniques 22:130-138(1997))等。非同位素DNA探针技术(Nonisotopic DNA Probe Techniques),Academic Press,Inc.1992中综述了可以使用本发明的猝灭剂的这些探针基序和其他探针基序。
用于本发明的探针的低聚物可以是任何适当的大小，并且优选为约2～约100个核苷酸，更优选为约10～80个核苷酸，还更优选为约10～约40个核苷酸。在双标记(荧光团-猝灭剂)探针中，供体部分优选是从猝灭剂分离至少约6个核苷酸，优选至少约8个核苷酸，优选至少10个核苷酸，和更优选至少约15个核苷酸。在各种实施方式中，供体部分优选连接于探针的3’-端核苷酸或5’-端核苷酸。猝灭剂部分也优选连接于探针的3’-端核苷酸或5’-端核苷酸。更优选地，供体和受体部分分别连接于探针的3’-端核苷酸和5’端核苷酸或5’端核苷酸和3’-端核苷酸，虽然在内部放置也是有效的。
本发明的核酸探针的精确序列和长度部分取决于其结合的靶多核苷酸的性质。结合位置和长度可以改变以获得对具体实施方式的退火和解链特性。在许多本领域公认的参考文献中可以发现进行这样的设计选择的指导。
在一些实施方式中，核酸探针的3’-端核苷酸是封闭的或呈现出不能通过核酸聚合酶延伸。通过将供体或受体部分与核酸探针的末端3’-位直接连接或通过接头部分连接，可以方便地进行这样的封闭。
核酸可包括DNA、RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的形式。探针和靶核酸二者都可以作为单链、双螺旋或三螺旋等的形式存在。此外，可以在核碱基部分、糖部分或磷酸骨架处用其他基团修饰核酸，所述其它基团如放射性标记、小沟结合剂、插入剂、乙酰类不饱和烃(acetylinically unsaturated hydrocarbons)、氟烷基、供体部分和/或受体部分等。
本发明的低聚物用作是离散序列的引物，或用作具有随机序列的引物。随机序列引物通常长度为约6或7个核单体。这样的引物可以用于各种核酸扩增方案(PCR、连接酶链式反应等)或用于克隆方案。在本发明的5’-端上的置换通常不干扰低聚物起引物作用的能力。具有不是3’-末端残基的位点处的2’-修饰，使低聚物核糖核酸酶H无能力或反之使核酸酶稳定的本发明的低聚物可以有利地用作含有核酸酶的细胞提取物或其他溶液中的RNA或DNA序列的探针或引物。因此，低聚物可以用于通过以下方法在样品中扩增核酸的方案：即通过将低聚物与含有靶核酸的样品混合，然后使低聚物与靶核酸杂交，并通过PCR、LCR或其他适当的方法扩增靶核酸。
用螯合剂如EDTA、DTPA或1,2-环己二胺乙酸的类似物衍生化的低聚物可用于各种体外诊断测定，如(第4,772,548、4,707,440和4,707,352号美国专利)所述。可供选择地，本发明的低聚物可以用交联剂如5-(3-碘代乙酰氨基丙-1-基)-2’-脱氧尿苷或5-(3-(4-溴代丁酰胺基)丙-1-基)-2’-脱氧尿苷衍生化，并用于各种测定方法或试剂盒，如(第WO 90/14353号国际公开)所述。
除上述的用途以外，通过用任何适当的方法测量受试细胞或重组系统中的表达水平，可以在体外系统中证实低聚物抑制基因表达的能力。(Graessmann,M.,等人,NucleicAcids Res.(1991)19:53-59)。
本领域技术人员可以凭经验确定利于本发明的低聚物和靶核酸分子之间杂交的条件，所述条件可以包括最佳的温育温度、盐浓度、寡核苷酸类似物探针的长度和和碱基组成，以及样品中低聚物和核酸分子的浓度。优选地，杂交在至少1毫摩尔镁的存在下和在高于6.0的pH下进行。在一些实施方式中，可能需要或希望处理样品以使样品中的核酸分子在杂交前为单链。这样的处理的例子包括但不限于用碱处理(优选随后中和)、在高温下温育或用核酸酶处理。
另外，因为与核酸杂交的盐依赖性主要由杂交寡核苷酸类似物的骨架的电荷密度决定，因此将非标准核苷酸类似物掺入本发明的低聚物中可以提高或降低杂交的盐依赖性。该调节可以用于使本发明的方法有优势，其中在某些方面该优势对能够例如通过改变盐条件提高杂交的严格性或通过减少盐浓度释放杂交的核酸可以是希望的。在本发明的其他方面，在非常低的盐中使本发明的寡核苷酸类似物与核酸的高亲和性结合可以是希望的。在这种情况下，使具有无电荷的骨架部分的核苷酸单体定位于本发明的寡核苷酸内是有利的。
本发明的低聚物与靶核酸分子结合的高度特异性允许从业者选择可以有利于区别核酸序列和靶核酸分子的杂交条件，所述核酸序列包括与一种或多种低聚物的至少一个部分完全互补的一段序列，所述靶核酸分子包括在基本上互补的序列内含有少数非互补碱基的一段序列。例如，杂交或洗涤温度可以选择为允许本发明的低聚物与沿一段序列完全互补的靶核酸分子之间的稳定杂交体，但促进本发明的低聚物与不完全互补的靶核酸分子(包括沿一段互补序列含有一个或两个碱基错配的那些靶核酸分子)之间的杂交体解离。杂交温度和洗涤温度的选择可以是至少部分地依赖于其他条件，如盐浓度、低聚物和靶核酸分子的浓度、低聚物与靶核酸分子的相对比例、要杂交的低聚物的长度、低聚物和靶核酸分子的核碱基组成、寡核苷酸类似物分子的单体组成等。此外，当选择利于完全互补分子的稳定杂交体，而不利于一个或多个核碱基错配的低聚物和靶核酸分子之间的稳定杂交体的条件时，可以考虑额外的条件，并且，需要时改变该额外条件，包括但不限于要杂交的寡核苷酸类似物的长度、低聚物和靶核酸分子之间的一段互补性序列的长度、该段互补性序列内的非互补核碱基的数量、错配核碱基的同一性、错配核碱基附近的核碱基的同一性以及任何沿一段互补序列错配的核碱基的相对位置。核酸杂交领域的技术人员能够根据具体的应用，确定在使用本发明的低聚物与靶核酸分子杂交中的有利的杂交和洗涤条件。“有利的条件”可以是有利于低聚物和靶核酸分子之间形成稳定杂交体的条件，所述稳定杂交体至少部分是基本上互补的，包括包含一个或多个错配的那些杂交体。
“有利的条件”可以是有利于低聚物和靶核酸分子之间形成稳定的杂交体而不利于不完全互补的分子之间形成杂交体或在不完全互补的分子之间形成不稳定的杂交体的条件，所述稳定杂交体至少部分是完全互补的。
使用如本文公开的方法，与不同序列的靶核酸分子杂交的本发明的低聚物的解链温度可以被确定，并且可以用于确定针对给定应用的有利条件。通过例如将靶核酸分子与结合于固体支持物的低聚物杂交和检测杂交的复合体，也可能凭经验确定有利杂交条件。
通过低聚物探针与固体支持物的直接或间接结合，可以方便地并有效地将结合于本发明的固体支持物或低聚物探针的靶核酸分子从调查群体的未结合的核酸分子中分离。可以在高严格性条件下洗涤固体支持物以移除未结合于低聚物探针的核酸分子。然而，低聚物探针与固体支持物的结合不是本发明的要求。例如，在某些应用中，通过穿过基质的离心或通过相分离或某些通过其他形式的分离(例如示差沉淀)可以分离结合的和未结合的核酸分子，所述其他形式的分离可任选地通过掺入低聚物探针的化学基团辅助(见例如，2000年5月9日授予Nie等人的第6,060,242号美国专利)。
核酸捕获探针
在一种实施方式中，包括第一猝灭剂和第二猝灭剂的固定化核酸用作捕获探针。固定化核酸任选地进一步包括稳定部分。核酸探针可以直接结合于固体支持物，例如通过探针的3’末端核苷酸或5’末端核苷酸与固体支持物结合。然而，更优选地，探针通过接头(如上文)结合于固体支持物。接头用于探针与固体支持物的距离。接头的长度最优选为约5～约30个原子，更优选为约10～约50个原子。
在各种实施方式中，固体支持物还用作在制备低聚物(探针)中的合成支持物。固体支持物和核酸的第一个3’单位之间的接头的长度和化学稳定性在支持物结合的核酸的有效合成和杂交中起重要作用。接头臂优选足够长以便在自动合成期间可以获得高收率(>97％)。需要的接头的长度将取决于具体使用的固体支持物。例如，当高交联聚苯乙烯用作固体支持物时，6个原子的接头通常足以在核酸的自动合成期间获得97％的收率。当CPG用作固体支持物时，接头臂优选为至少20个原子长以在自动合成期间获得高收率(>97％)。
固体支持物上固定的探针的杂交通常要求探针通过至少30个原子，优选至少50个原子与固体支持物分离。为了获得这种分离，接头通常包括位于接头和3’端之间的间隔区。对于核酸合成，接头臂常常通过酯键与3’端的3’-OH连接，所述酯键可以用碱试剂裂解以使核酸从固体支持物释放。
各种各样的接头是本领域已知的，其可用于将核酸探针结合于固体支持物。接头可以由任何化合物形成，所述化合物不显著干扰靶序列与结合于固体支持物的探针的杂交。接头可以由例如同聚核酸(homopolymeric nucleic acid)形成，所述同聚核酸通过自动合成可容易地被插入接头上。
可供选择地，聚合物如官能化的聚乙二醇可以用作接头。当前相对于同聚核酸，优选这样的聚合物，因为它们不显著干扰探针与靶核酸的杂交。聚乙二醇是尤其优选的，因为它是商业可获得的，可溶于有机介质和含水介质两者，易于官能化，并且在核酸合成条件和合成后条件下是完全稳定的。
在高温下在碱性条件下合成或移除核碱基保护基团的过程中，固体支持物、接头和探针之间的键合位点优选不被裂解。然而，这些键可以选自在各种条件下可裂解的基团。当前优选的键的例子包括氨基甲酸酯、酯和酰胺键。
样品中核酸的检测
本发明的固体支持物和低聚物可用于检测核酸。这样的检测方法包括：提供样品，在允许低聚物与核酸分子杂交的条件下使至少一种本发明的寡核苷酸类似物与样品接触，以及检测样品的已经与本发明的一种或多种低聚物杂交的一种或多种核酸分子。
样品可以来自任何来源，并且可以是生物样品，如来自一种有机体或来自一组有机体的样品，所述一组有机体来自相同的或不同的物种。生物样品可以是体液样品，例如血液样品、血清样品、淋巴液样品、骨髓样品、腹水、胸水、骨盆洗液、眼内液、尿液、精液、痰液或唾液。生物样品也可以是来自皮肤、鼻、喉和生殖拭样(genital swab)的提取物，或粪便物的提取物。生物样品也可以是器官或组织(包括肿瘤)的样品。生物样品也可以是细胞培养物的样品，所述细胞培养物包括原核细胞和真核细胞两者的细胞系和原代培养物两者。
样品可以来自环境，如来自水体或来自土壤，或来自食品、饮料或水源，来自工业源、工作区、公共区或生活区。样品可以是提取物，例如土壤或食品样品的液体提取物。样品可以是通过洗涤或浸泡或悬浮拭样制成的溶液，所述拭样来自如工具的物品，如衣物物品、人工制品或其他材料。
样品可以是未加工或加工的样品；加工可以涉及增加样品的组分的纯度、浓度或可进入性的步骤以促进样品的分析。作为非限制性实例，加工可以包括以下步骤：减少样品的体积，移除或分离样品的组分、使样品或一种或多种样品组分溶解或破坏、修饰、暴露、释放或分离样品的组分。这样的步骤的非限制性的例子是离心、沉淀、过滤、均化、细胞裂解、抗体结合、细胞分离等。例如，在本发明的一些优选的实施方式中，样品是至少部分加工的血液样品，例如，通过移除红细胞，通过浓缩，通过选择一种或多种细胞或病毒(例如，白细胞或病原细胞)，或通过细胞的裂解等。
示例性的样品包括至少部分纯化的核酸分子的溶液。核酸分子可以来自单个来源或多个来源，并且可以包括DNA、RNA或两者。例如，核酸分子的溶液可以是以下样品，即所述样品经历了任何的以下步骤：细胞裂解、浓缩、提取、沉淀、核酸选择(例如聚A RNA选择或包括Alu元件的DNA序列的选择)或用一种或多种酶处理。样品可以是包括合成核酸分子的溶液。
本发明的低聚物或固体支持物可以是本文公开的任何低聚物形式，或包括本文公开的单体、二聚体或非核酸组分(例如接头、荧光团、猝灭剂、稳定部分)的任何低聚物。用于本发明的方法的寡核苷酸类似物可以具有任何长度和任何核碱基组成，并且可以包括一种或多种核酸部分、肽、蛋白质、脂质、糖类、类固醇和其他生物化学和化学部分。本发明的寡核苷酸类似物可以在溶液中提供或结合于固体支持物。在本发明的某些优选实施方式中，低聚物包括非标准核苷酸类似物。
用于结合的核酸的检测方法是本领域熟知的，并且可以包括可检测标记的使用，所述标记连接于或掺入调查群体的核酸分子，或适合结合于或掺入杂交的靶核酸分子或杂交的靶核酸分子复合体。用于核酸分子的可检测标记是本领域熟知的，包括荧光分子如荧光团(包括本文描述的荧光团)、放射性同位素、质量改变的化学基团、特异性结合成员如可通过产生信号的分子检测的生物素等。可检测标记也可以掺入或连接于本发明的低聚物，例如，在使用信号低聚物的夹心杂交用于检测的情况下，或使用特异性结合成员如识别低聚物/靶核酸分子复合体的抗体进行检测的情况下。可以将固体支持物扫描，曝光于胶片，目测观察等，以确定可检测标记的存在，并由此确定靶核酸分子与固定于固体支持物上的低聚物的结合，如本发明的那些。
试剂盒
本发明的一个方面是试剂盒的配制，所述试剂盒促进使用本发明的化合物(如本发明的固体支持物或本发明的单体)的合成的实践和使用本发明的低聚物的测定的实践，如上所述。本发明的试剂盒典型地包括本发明的化合物(如本发明的固体支持物或本发明的低聚物)，该试剂盒呈现为用于制备缀合物的化学反应性物质或呈现为完整的低聚物，其中低聚物是特异性结合对成员。试剂盒任选地进一步包括一种或多种缓冲剂，典型地呈现为水溶液。本发明的试剂盒任选地进一步包括额外的检测试剂，用于纯化产生的标记物质的纯化介质、荧光标准品、酶、酶抑制剂、有机溶剂或用于进行本发明的测定的说明。试剂盒的其他形式对本领域技术人员会是显而易见的，并且在本发明的范围内。
通过总结，在示例性实施方式中，本发明提供了：
包括具有以下结构的寡核苷酸的核酸探针：
5’-Y1-L1-LQ1-L2-Y2-3’。
Y1包括两个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列。Y2包括两个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列。Y1和Y2中的一个具有与其核苷酸序列(直接或通过接头)共价连接的荧光团，Y1和Y2中的另一个具有与其核苷酸序列(直接或通过接头)共价连接的第二猝灭剂。L1和L2独立地选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。LQ1是Q1是具有选自和的结构的第一猝灭剂。Ra、Rb和Rc独立地选自取代或未取代的芳基。L3选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述段落的核酸探针，其中Y1的核苷酸序列包括：具有(直接或通过接头)共价连接于荧光团或第二猝灭剂的5’磷酸酯的第一核苷酸N1，和具有共价连接于L1的3’磷酸酯的第二核苷酸N2；Y2的核苷酸序列包括：具有共价连接于L2的5’磷酸酯的第三核苷酸，和具有(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂或荧光团的3’磷酸酯的第四核苷酸N4；其中，当所述第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述荧光团时，所述第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述第二猝灭剂；并且当第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂时，第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团。
根据前述任意段落的核酸探针，进一步包括连接于使第一核苷酸N1的5’磷酸酯连接于荧光团或第二猝灭剂的接头的一个或多个DNA或RNA核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，进一步包括连接于使第四核苷酸N4的3’磷酸酯连接于第二猝灭剂或荧光团的接头的一个或多个DNA或RNA核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于荧光团；并且第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Y1是8、9、10或11个核苷酸的序列。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Q1具有选自以下的结构：
其中Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基和硝基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和硝基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Q1具有以下结构：
其中Ra2、Ra3、Ra5和Ra6是H；Rb2、Rb3、Rb5和Rb6中的至少一个独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rb2、Rb3、Rb5和Rb6的剩余部分是H；以及Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6中的至少一个独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6的剩余部分是H。
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸包括15至45个核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸包括20至30个核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸具有15至45个核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸具有20至30个核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中L1和L2各自是未取代的C1-C7烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中L1和L2各自是未取代的C1-C3烷基；并且L1和L2是相同的。
根据前述任意段落的核酸探针，其中L1和L2各自是乙基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂具有以下结构：
其中Re2、Re5、Rf2和Rf4独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基和硝基；并且L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Re2是未取代的C1-C4烷基；Re5是H；Rf2是未取代的C1-C4烷基；并且Rf4是H。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷基；Rf2是硝基；并且Rf4是未取代的C1-C4烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷氧基；Rf2是H；并且Rf4是硝基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂来自Dabcyl、Dabsyl、猝灭剂、IowaIowa或Iowa
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团来自6-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯荧光素(TET)、6-羧基若丹明(R6G)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、1-二甲氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐、2-对甲苯胺基-6-萘磺酸盐、5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、香豆素染料、吖啶染料、吲哚二羰花青3(Cy3)、吲哚二羰花青5(Cy5)、吲哚二羰花青5.5(Cy5.5)、3-(1-羧基-戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧杂羰花青(CyA)、1H,5H,11H,15H-呫吨并[2,3,4-ij:5,6,7-i’j’]二喹嗪-18-9-[2(或4)-[[[6-[2,5-二氧-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代己基]氨基]磺酰基]-4(或2)磺基苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17-八氢-内盐(TR或德克萨斯红)、BODIPY染料、苯并唑、茋或芘。
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团来自6-羧基荧光素(FAM)。
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Y1的核苷酸序列包括：具有(直接或通过接头)共价连接于荧光团的5’磷酸酯的第一核苷酸N1，和具有共价连接于L1的3’磷酸酯的第二核苷酸N2；Y2的核苷酸序列包括：具有共价连接于L2的5’磷酸酯的第三核苷酸N3，和具有(直接或通过接头)共价连接于第二猝灭剂的3’磷酸酯的第四核苷酸N4；L1是未取代的C2烷基；L2是未取代的C2烷基；Q1具有以下结构：
第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基；并且荧光团包括荧光素部分。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂具有以下结构：
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸包括15至45个核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸具有15至45个核苷酸。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Y1是8至11个核苷酸的序列。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Y2是6至24个核苷酸的序列。
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团具有以下结构：
根据前述任意段落的核酸探针，其中Y1是8至11个核苷酸的序列；Y2是6至24个核苷酸的序列；第二猝灭剂具有以下结构：
荧光团具有以下结构：
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸是第一寡核苷酸，且该第一寡核苷酸适于与具有结构3’-Y3-Y4-5’的第二寡核苷酸杂交，其中：Y3包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括第五核苷酸N5；Y4包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括与核苷酸N5直接连接的第六核苷酸N6；其中如果第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交，则具有N5的N2碱基对和具有N6的N3碱基对形成的双螺旋的Tm高于在第二寡核苷酸和具有结构5’-Y1-Y2-3’的第三寡核苷酸之间形成的双螺旋的Tm。
根据前述任意段落的核酸探针，其中寡核苷酸是第一寡核苷酸，且该第一寡核苷酸适于与具有结构3’-Y3-Y4-5’的第二寡核苷酸杂交，其中：Y3包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括第五核苷酸N5；Y4包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括与核苷酸N5直接连接的第六核苷酸N6；其中如果第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交，则具有N5的N2碱基对和具有N6的N3碱基对形成的双螺旋的Tm低于在第二寡核苷酸和具有结构5’-Y1-Y2-3’的第三寡核苷酸之间形成的双螺旋的Tm。
检测样品中的第二寡核苷酸的方法，包括：使样品与根据前述任意段落的核酸探针接触，其中，当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过向第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个进行供体-受体能量转移减少荧光团的荧光；以及检测到荧光的增加表示样品中存在第二寡核苷酸。
根据前述段落的方法，其中当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量转移减少荧光。
根据前述任意段落的方法，其中当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过基态猝灭减少荧光。
根据前述任意段落的方法，其中当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量和基态猝灭两者减少荧光。
根据任意前述段落的方法，其中荧光的增加由荧光团从第一寡核苷酸的裂解引起。
根据前述任意段落的方法，其中当第一寡核苷酸未杂交时，第一寡核苷酸形成无规卷曲构象，使得荧光团的荧光减少。
根据前述任意段落的方法，其中第一寡核苷酸包括自我互补的序列，并且其中猝灭剂和荧光团连接于第一寡核苷酸，使得当核酸聚合物经历分子内碱基配对时，荧光团的荧光被猝灭剂猝灭。
根据前述任意段落的方法，其中该方法用于PCR反应，其中PCR产物的合成导致荧光的增加。
检测样品中的第二寡核苷酸的方法，包括：使样品与根据前述任意段落的核酸探针接触，其中寡核苷酸是第一寡核苷酸，且第一寡核苷酸适于与第二寡核苷酸杂交，当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过向第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个进行供体-受体能量转移减少荧光团的荧光；以及检测到荧光的增加表示样品中存在第二寡核苷酸。
根据前述段落的方法，其中当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量转移减少荧光。
根据前述任意段落的方法，其中当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过基态猝灭减少荧光。
根据前述任意段落的方法，其中当第一寡核苷酸不与第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量和基态猝灭两者减少荧光。
根据前述任意段落的方法，其中荧光的增加由荧光团从第一寡核苷酸的裂解引起。
根据前述任意段落的方法，其中当第一寡核苷酸未杂交时，第一寡核苷酸形成无规卷曲构象，使得荧光团的荧光减少。
根据前述任意段落的方法，其中第一寡核苷酸包括自我互补的序列，其中猝灭剂和荧光团连接于第一寡核苷酸，使得当核酸聚合物经历分子内碱基配对时，荧光团的荧光被第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个猝灭。
根据前述任意段落的方法，其中该方法用于PCR反应，其中PCR产物的合成导致荧光增加。
核酸探针，包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与其连接的：第一猝灭剂，具有包括选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及其组合的至少三个残基的结构，其中所述残基中的至少两个通过环外重氮键共价连接；以及第二猝灭剂；其中第一猝灭剂连接于核苷酸，该核苷酸是从寡核苷酸的5’端到3’端的8、9、10或11个核苷酸；并且第一猝灭剂和第二猝灭剂通过独立地选自以下的成员连接于寡核苷酸：单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述段落的核酸探针，其中，寡核苷酸进一步包括通过选自以下的成员连接于寡核苷酸的5’端的荧光团：单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中至少三个残基中的每一个是取代或未取代的苯基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中至少三个残基中的至少两个是被至少一个C1-C6未取代的烷基部分取代的苯基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第一猝灭剂具有以下结构：
其中L3是选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基的成员。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂具有包括选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及其组合的至少3个残基的结构，其中残基中的至少两个通过环外重氮键共价连接。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂连接于寡核苷酸的3’端。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂具有以下结构：
其中Re2、Re5、Rf2和Rf4独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基和硝基；并且L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Re2是未取代的C1-C4烷基；Re5是H；Rf2是未取代的C1-C4烷基；并且Rf4是H。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷基；Rf2是硝基；并且Rf4是未取代的C1-C4烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷氧基；Rf2是H；并且Rf4是硝基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
根据前述任意段落的核酸探针，其中荧光团具有以下结构：
检测核酸靶序列的方法，该方法包括：(a)使靶序列与包括单链靶结合序列的检测核酸接触，其中检测核酸是根据前述任意段落的核酸探针，并且检测核酸处于在激发荧光团时允许荧光团与第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个之间进行供体-受体能量转移的构象；(b)使靶结合序列与靶序列杂交，从而改变检测核酸的构象，导致荧光参数的变化；以及(c)检测荧光参数的变化，从而检测核酸靶序列。
确定第一核酸和第二核酸是否杂交的方法，其中第一核酸是根据前述任意段落的核酸探针，该方法包括：(a)使第一核酸与第二核酸接触；以及(b)检测选自第一核酸、第二核酸及其组合的成员的荧光特性的改变，从而确定杂交是否发生。
监测核酸扩增反应的方法，该方法包括：(a)制备包括检测核酸的扩增反应混合物，其中检测核酸是根据前述任意段落的核酸探针；(b)使扩增反应混合物处于扩增条件；(c)监测反应混合物的来自检测核酸的荧光信号以获得测定结果；以及(d)采用测定结果监测核酸扩增反应。
检测靶序列的扩增的方法，该方法包括：(a)使包括靶序列的样品核酸与位于靶序列侧翼的PCR引物杂交；(b)用聚合酶延伸杂交的引物以产生PCR产物，将PCR产物的两条链分离以使靶序列的有义链和反义链接近；(c)使检测核酸杂交到PCR产物中的靶核酸的有义链或反义链，其中检测核酸是根据前述任意段落的核酸探针；其中在检测核酸与靶序列杂交之前，检测核酸处于在激发荧光团时允许荧光团与第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个之间进行供体-受体能量转移的构象；从而改变检测核酸的构象，导致荧光参数的变化；以及(d)测量荧光参数的变化以检测靶序列及其扩增。
通过以下实施例进一步说明本发明的材料和方法。提供这些实施例来说明但不限制要求保护的发明。
实施例
结构
内部猝灭的探针继续需要3’阻断剂，因此提高猝灭效率的合理方法是保留末端猝灭剂的阻断功能，同时在内部位置引入另外的猝灭剂。FAM标记的探针被发现与内部BHQ0部分最佳地发挥作用，这是令人惊讶的，因为这种染料配对具有最小的光谱重叠。通过使用破坏糖-磷酸骨架的连接化学将内部BHQ0定位在相邻残基之间，可以掺入内部BHQ0而不考虑碱基组成。用于掺入的亚磷酰胺前体的目录号为BNS-5050(生物技术检索公司)，具有以下化学结构：
在合成期间将反应性前体掺入寡核苷酸获得内部BHQ0修饰：
内部BHQ0在3’端补充额外的BHQ1部分。双猝灭剂FAM标记的探针的完整结构示于图3。
双猝灭剂探针内的通用染料取向可以表示为线性序列：5’-[FAM]-寡核苷酸序列1-[I-BHQ0]-寡核苷酸序列2-[BHQ1]-3’。
将内部BHQ0定位在第9和10个残基之间被发现是最佳的。从5’端的任何更接近或进一步移除导致信号释放减少。信号的扩大不仅依赖于序列位置而且还依赖于猝灭剂类型。其他猝灭剂如DABSYL即不能正常工作，也不能转换BHQ0/BHQ1染料取向。即使BHQ0发色团和寡核苷酸之间的连键的微妙变化也足以破坏信号的释放。经验性测试揭示了修饰的非常灵敏的系统，并且揭示了非常意料不到的协同作用。所有这些依赖性在后面的实验部分中都有说明。
功能
无论寡核苷酸的长度如何，BHQ0和BHQ1修饰的组合同时产生了更好的猝灭效率和信号释放。如图4A至图4C所示，作为双猝灭剂探针，之前测试的具有T-BHQ1修饰(比较图2A至图2C)的相同的三种探针序列已经显著改善了性能：
图4A至图4C.末端标记的探针发送信号得到的扩增迹线显示为斜杠线。双猝灭剂探针发送信号得到的扩增迹线显示为实线。较长的探针序列对猝灭效率的改善最为显著，同时所有三种都证实了改善的信号释放。比较的探针序列为：
21个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-TCCTTTGGGCTCCTGCCATCT-[BHQ1]-3’
21个碱基的探针(I-BHQ0+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-TCCTTTGGG[I-BHQ0]CTCCTGCCATCT-[3-BHQ1]-3’
29个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-AAACCACTTTATGAAAATCTAACTGGACA-[BHQ1]-3’
29个碱基的探针(I-BHQ0+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAACCACTT[I-BHQ0]TATGAAAATCTAACTGGACA-[3-BHQ1]-3’
35个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-BHQ0+3-BHQ1)
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
可以通过FRET距离依赖性预测改善的猝灭效率，但是不能容易地解释改善的信号。一种可能性是内部猝灭剂必须与荧光报告分子实际上具有较差的光谱重叠，以更好地信号传导扩增。BHQ0在495nm处具有最大吸光度，其吸收光谱稍微远离在520nm处具有最大发射的FAM。尽管仍是推测性的，但是内部猝灭剂可能在比报告分子更短的波长下或比3’端猝灭剂(BHQ1)更短的波长下必须具有λ最大值以获得最佳性能特征。
也有可能与单独起作用的两种猝灭剂中的任一种相比，两种猝灭剂彼此物理结合，产生与FAM更有效地相互作用的复合物。如果这是真的，这将产生3’BHQ1更接近5’荧光报告分子的结构化的探针构象，因此可以被认为是构象辅助的探针。
改善的信号释放可能源自BHQ0和Taq聚合酶之间有利的相互作用。虽然传统的末端标记的探针在杂交时立即释放信号，但是显示在双猝灭剂探针中这种信号传导机制实际上是非常小的。即使在杂交时，由于荧光报告分子和内部猝灭剂接近，FRET猝灭仍然显著。只有由聚合酶的核酸酶消化时是从猝灭剂标记的寡核苷酸裂解的荧光团，才能释放荧光信号。这类酶依赖性很难预测。它们可能涉及与蛋白质本身的细微的静电和疏水相互作用，并且在没有X射线晶体学的情况下难以建模。
虽然各种假设可以解释改善的信号放大，但是目前双螺旋稳定不是其中之一。证明了与传统的末端标记的探针相比，内部BHQ没有改善结合强度，而是将探针的TM平均降低1℃。这种不稳定性可能来源于内部修饰，这破坏了糖-磷酸骨架，在结合靶序列时引入了一系列种类。这些假设和它们的表征在实验部分更充分地描述。
通过从靶序列的单个稀释点扩增来检测大多数候选物的筛选效率。为了确保接近检测极限的灵敏度不受损失，双猝灭剂探针通过7点稀释系列进行测试，并且通过仪器的标准化算法进行分析后显示它们的扩增：
图5A至图5F.末端标记的探针发送信号得到的扩增迹线显示为斜杠线。双猝灭剂探针发送信号得到的扩增迹线显示为实线。
实验
通过依赖于发色团结构、与寡核苷酸的连接、朝向彼此的取向和序列内的位置的非常特定的修饰系统，可以实现双猝灭剂探针的改进的性能。无论与任何这些精确特征的偏差如何轻微，都会产生关于信号释放幅度的较差的性能，例如使用T连接的BHQ1修饰的探针所观察到的性能。
该I-TBHQ1修饰的化学结构为
在3’端用间隔区-C3修饰阻断的同时，该探针在内部位置仅包含单种猝灭剂：
5’-[FAM]-TCCTTTGGGC[I-TBHQ1]CCTGCCATCT-[3-Sp3]-3’
如图2A至图2C所示，在信号释放被抑制的同时，猝灭效率稍微改善，结果总体性能受到破坏。接下来，测试了用第二BHQ-1代替3’间隔区-C3的探针，以及用破坏糖-磷酸骨架的无碱基式代替内部T-BHQ1的探针：
图6A至图6B.末端标记的探针发送信号得到的扩增迹线显示为斜杠线。双BHQ1探针发送信号得到的扩增迹线显示为实线。无论图6A中的T连接式还是图6B中的无碱基式，具有两种BHQ1猝灭剂的两种配置都具有降低的信号响应并总体上降低了性能。比较的探针序列为：
21个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-TCCTTTGGGCTCCTGCCATCT-[BHQ1]-3’
21个碱基的探针(I-TBHQ1+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-TCCTTTGGGC[I-TBHQ1]CCTGCCATCT-[3-BHQ1]-3’
21个碱基的探针(I-BHQ1+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-TCCTTTGGG[I-BHQ1]CTCCTGCCATCT-[3-BHQ1]-3’
在除I-BHQ0+3-BHQ1配置之外与具有I-BHQ0+3-BHQ1配置的双猝灭剂探针相同的系统中测试I-BHQ1+3-BHQ1的无碱基式，但其表现却差得多。为了简洁起见，仅显示来自一个代表性测定的结果，而实际上已经在>10个不同序列的组中比较了这两种配置，其结果类似于这里给出的结果-某些探针序列具有来自I-BHQ1的信号响应降低，而来自I-BHQ0的信号响应则更频繁地改善。
其他双猝灭剂配置没有更好地表现，不同的修饰形式完全没有更好地表现。总是与3-BHQ1组合，分别合成了具有内部T-Dabsyl(I-TDAB)以及具有截短形式的仅含有第一芳基部分(I-苯胺)的BHQ0的35个碱基的探针。
图7A至图7B.斜杠线是末端标记的探针发送信号得到的扩增迹线。为了比较，实线是双猝灭剂探针I-BHQ0+3-BHQ1。空心迹线是图7A中的I-TDAB+3-BHQ1探针和图7B中的I-苯胺+3-BHQ1。I-TDAB改善了猝灭效率，但信号响应降低。I-苯胺具有与传统末端标记的探针等同的信号响应，但是猝灭效率较差，表明苯胺部分不作为猝灭剂起作用。与I-BHQ0+3-BHQ1相比，两种探头配置的整体性能都较差。比较的探针序列为：
35个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-BHQ0+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-TDAB+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAGAGTAG[I-TDAB]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-苯胺+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-苯胺]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
即使改变内部BHQ0与寡核苷酸之间的连接也会破坏这种独特的双猝灭剂探针配置的性能。合成了具有栓系于脱氧核糖部分的BHQ0的35个碱基的探针(I-dRBHQ0)，以及具有通过破坏糖磷酸骨架的乙二醇连接的BHQ0的另一种35个碱基的探针(I-gBHQ0)。这两种修饰形式的反应性前体的化学结构如下所示。
图8A至图8B.以斜杠线显示的扩增迹线由末端标记的探针发送信号。为了比较，实线迹线是双猝灭剂探针I-BHQ0+3-BHQ1。空心迹线是图8A中的I-dRBHQ0+3-BHQ1探针，图8B中的I-gBHQ0+3-BHQ1。与示例性的I-BHQ0相比，这些修饰物保持了相同发色团结构，而仅在其连接化学方面不同，并且两者都具有更差的信号响应。比较的探针序列为：
35个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-BHQ0+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-dRBHQ0+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-dRBHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-gBHQ0+3-BHQ1):
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-gBHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
这种功能依赖性不仅限于内部BHQ0，而且还限于位于3'末端的BHQ1猝灭剂。为了证明该末端猝灭剂对整个探针配置的重要性，测试了用间隔区(Spacer)C3替代BHQ1同时保留内部BHQ0的探针。还测试了两种猝灭剂的反向取向，使BHQ1位于内部位置，而BHQ-0位于3'末端：
图9A至图9B.斜杠线是用末端标记的探针发送信号的扩增迹线。为了对比，实线是双猝灭剂探针I-BHQ0+3-BHQ1。空心迹线是图9A中的I-BHQ0+3-Sp3，图9B中的I-BHQ1+3-BHQ0。与I-BHQ0+3-BHQ1相比，两种探针配置都具有较差的信号响应，强调BHQ1在组合中的重要作用以及猝灭剂相互之间的取向的重要作用。比较的探针序列是：
35个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-BHQ0+3-BHQ1)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
35个碱基的探针(I-BHQ0+3-Sp3)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-Sp3]-3’
35个碱基的探针(I-BHQ1+3-BHQ0)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ1]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ0]-3’
转变猝灭剂取向对功能具有显著影响，但是序列位置比这更敏感。使内部BHQ0的位置向5’荧光报告分子靠近和远离，测试的结果是：
图10.尽管通过将猝灭剂置于更靠近5’报告分子的位置使基线荧光稍微降低，但这只能表示，尤其与传统末端标记的探针(斜杠线)相比，9/10配置的猝灭效率在名义上的改进(实线)。然而，当内部BHQ0从第9和10个残基之间的示例性位置向任一方向移动时，信号释放被破坏，因此所有其他配置的性能较差。比较的探针序列为：
35个碱基的探针(末端标记的)：
5’-[FAM]-AAGAGTAGTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[BHQ1]-3’
6/7I-BHQ0+3-BHQ1：
5’-[FAM]-AAGAGT[I-BHQ0]AGTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
7/8I-BHQ0+3-BHQ1：
5’-[FAM]-AAGAGTA[I-BHQ0]GTAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
8/9I-BHQ0+3-BHQ1：
5’-[FAM]-AAGAGTAG[I-BHQ0]TAGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
9/10I-BHQ0+3-BHQ1：
5’-[FAM]-AAGAGTAGT[I-BHQ0]AGCCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
11/12I-BHQ0+3-BHQ1：
5’-[FAM]-AAGAGTAGTAG[I-BHQ0]CCTAAGAGTGTCAGTTGTACATCA-[3-BHQ1]-3’
通过FRET的距离依赖性可以很容易地解释猝灭效率的提高，但各种探针配置的信号差异是相当出乎意料的。为了确定作用机制，通过将每个探针与其互补序列结合，然后在温度梯度上缓慢解链，来表征杂交热力学。该熔解曲线记录转变温度或TM，以显示探针的结合稳定性。在低于扩增的退火温度的过低的TM下结合的探针提供了弱的信号响应。相反，结合稳定性的任何增加应该具有相反的效果。以这种方式测试了12种不同的探针设计，总是将I-BHQ0+3-BHQ1配置与传统的末端标记的探针进行比较。两者之间的唯一区别是内部猝灭剂，所以这个比较揭示了从I-BHQ0本身对结合稳定性的任何贡献：
与传统的探针相比，熔解曲线(图11A至图11L)显示I-BHQ0+3-BHQ1双猝灭剂探针配置的平均-1.0℃的轻微不稳定。虽然测试的不同探针序列的结果有所不同，并且选择序列确实对双猝灭剂配置记录了更高的TM，但是总的来说，BHQ0没有显著的稳定性。因此，杂交热力学似乎不是这种双猝灭探针类型的信号传导机制中的因素。
更有趣的是在60℃下杂交和非杂交构象之间的信号变化，如通过将斜杠迹线和实迹线与其相应的空心迹线比较所测量的。这些空心迹线表示在相同范围内没有互补物的每种探针，并且在较高的温度下会覆盖斜杠迹线和实迹线，这是因为所有链会解链分离。单独从熔解曲线可以得出结论，传统的探针具有最好的表现：与双猝灭探针配置相比，它在杂交时具有远远更大的信号释放。而与此杂交测定相比，PCR扩增产生非常不同的结果：双猝灭剂探针具有与传统探针等价或更高的信号释放。由于在60℃下的熔解曲线数据，PCR的结果是惊人的，这揭示了，即使在与其互补物杂交时，双猝灭剂探针仍能有效淬灭—除了最短的传统探针未被杂交以外，双猝灭剂探针比所有的都更好地猝灭。所有这些表明在PCR测定中，主要的信号传导机制是水解而不是杂交。探针水解通过聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性完成，所以看起来双猝灭剂探针通过与这种酶的相互作用而获得效力。这种修饰系统与聚合酶组合的协同作用将非常难以预期或工程化。只有通过在qPCR的情况下评估数十种不同配置的功能的重要实证检验才能完成。
方法
理解的是，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，并且，根据其进行的各种修改和改变会暗示本领域技术人员，并且包括在本申请的精神和范围内，并且被认为在所附的权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此出于所有目的通过引用全部内容并入。

Claims (70)

1.一种核酸探针，包括：
具有结构5’-Y1-L1-LQ1-L2-Y2-3’的寡核苷酸，其中
Y1包括两个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列；
Y2包括两个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列；
其中，Y1和Y2中的一个具有与其核苷酸序列(直接或通过接头)共价连接的荧光团，Y1和Y2中的另一个具有与其核苷酸序列(直接或通过接头)共价连接的第二猝灭剂；
L1和L2独立地选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基；以及
LQ1是
其中，Q1是具有选自以下的结构的第一猝灭剂：
其中，Ra、Rb和Rc独立地选自取代或未取代的芳基；以及
L3选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
2.权利要求1所述的核酸探针，其中，
Y1的核苷酸序列包括：
第一核苷酸N1，具有(直接或通过接头)共价连接于所述荧光团或所述第二猝灭剂的5’磷酸酯，和
第二核苷酸N2，具有共价连接于L1的3’磷酸酯；以及
Y2的核苷酸序列包括：
第三核苷酸N3，具有共价连接于L2的5’磷酸酯，和
第四核苷酸N4，具有(直接或通过接头)共价连接于所述第二猝灭剂或所述荧光团的3’磷酸酯；
其中，当所述第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述荧光团时，所述第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述第二猝灭剂；而当所述第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述第二猝灭剂时，所述第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述荧光团。
3.权利要求2所述的核酸探针，进一步包括连接于所述接头的一个或多个DNA或RNA核苷酸，所述接头使所述第一核苷酸N1的5’磷酸酯连接于所述荧光团或第二猝灭剂。
4.权利要求2或3所述的核酸探针，进一步包括连接于所述接头的一个或多个DNA或RNA核苷酸，所述接头使所述第四核苷酸N4的3’磷酸酯连接于所述第二猝灭剂或荧光团。
5.权利要求2所述的核酸探针，其中，
所述第一核苷酸N1的5’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述荧光团；以及
所述第四核苷酸N4的3’磷酸酯(直接或通过接头)共价连接于所述第二猝灭剂。
6.权利要求5所述的核酸探针，其中，Y1是8、9、10或11个核苷酸的序列。
7.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，Q1具有选自以下的结构：
其中，Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、和硝基。
8.权利要求7所述的核酸探针，其中，Ra2、Ra3、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5、Rb6、Rb7、Rb8、Rc2、Rc3、Rc4、Rc5、Rc6、Rc7和Rc8独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和硝基。
9.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，Q1具有以下结构：
其中，
Ra2、Ra3、Ra5和Ra6是H；
Rb2、Rb3、Rb5和Rb6中的至少一个独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rb2、Rb3、Rb5和Rb6的剩余部分是H；以及
Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6中的至少一个独立地是甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或异丁基或仲丁基或叔丁基，并且Rc2、Rc3、Rc4、Rc5和Rc6的剩余部分是H。
10.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸包括15至45个核苷酸。
11.权利要求10所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸包括20至30个核苷酸。
12.权利要求1至10中任一项所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸具有15至45个核苷酸。
13.权利要求12所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸具有20至30个核苷酸。
14.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，L1和L2各自是未取代的C1-C7烷基。
15.权利要求14所述的核酸探针，其中，L1和L2各自是未取代的C1-C3烷基；并且L1和L2是相同的。
16.权利要求15所述的核酸探针，其中，L1和L2各自是乙基。
17.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，所述第二猝灭剂具有以下结构：
其中Re2、Re5、Rf2和Rf4独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、和硝基；以及
L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
18.权利要求17所述的核酸探针，其中，Re2是未取代的C1-C4烷基；Re5是H；Rf2是未取代的C1-C4烷基；以及Rf4是H。
19.权利要求17所述的核酸探针，其中，Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷基；Rf2是硝基；以及Rf4是未取代的C1-C4烷基。
20.权利要求17所述的核酸探针，其中，Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷氧基；Rf2是H；以及Rf4是硝基。
21.权利要求1至16中任一项所述的核酸探针，其中，第二猝灭剂具有以下结构：
其中，L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
22.权利要求1至16中任一项所述的核酸探针，其中，第二猝灭剂来自BBQ-Dabcyl、Dabsyl、猝灭剂、IowaFQ、IowaRQ-nl或IowaRQ-n2。
23.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，所述荧光团来自6-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯荧光素(TET)、6-羧基若丹明(R6G)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、1-二甲氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐、2-对甲苯胺基-6-萘磺酸盐、5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、香豆素染料、吖啶染料、吲哚二羰花青3(Cy3)、吲哚二羰花青5(Cy5)、吲哚二羰花青5.5(Cy5.5)、3-(1-羧基-戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧杂羰花青(CyA)、1H,5H,11H,15H-呫吨并[2,3,4-ij:5,6,7-i’j’]二喹嗪-18-9-[2(或4)-[[[6-[2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代己基]氨基]磺酰基]-4(或2)磺基苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17-八氢-内盐(TR或德克萨斯红)、BODIPY染料、苯并唑、茋或芘。
24.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，所述荧光团来自6-羧基荧光素(FAM)。
25.前述权利要求中任一项所述的核酸探针，其中，所述荧光团具有以下结构：
其中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
26.权利要求1所述的核酸探针，其中，
Y1的核苷酸序列包括：
第一核苷酸N1，具有(直接或通过接头)共价连接于所述荧光团的5’磷酸酯，和
第二核苷酸N2，具有共价连接于L1的3’磷酸酯；以及
Y2的核苷酸序列包括：
第三核苷酸N3，具有共价连接于L2的5’磷酸酯，和
第四核苷酸N4，具有(直接或通过接头)共价连接于所述第二猝灭剂的3’磷酸酯；
L1是未取代的C2烷基；
L2是未取代的C2烷基；
Q1具有以下结构：
所述第二猝灭剂具有以下结构：
其中L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基；以及
所述荧光团包括荧光素部分。
27.权利要求26所述的核酸探针，其中，所述第二猝灭剂具有以下结构：
28.权利要求26或27所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸包括15至45个核苷酸。
29.权利要求28所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸具有15至45个核苷酸。
30.权利要求26所述的核酸探针，其中，Y1是8至11个核苷酸的序列。
31.权利要求26所述的核酸探针，其中，Y2是6至24个核苷酸的序列。
32.权利要求26至31中任一项所述的核酸探针，其中，所述荧光团具有以下结构：
其中L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
33.权利要求32所述的核酸探针，其中，所述荧光团具有以下结构：
34.权利要求26所述的核酸探针，其中
Y1是8至11个核苷酸的序列；
Y2是6至24个核苷酸的序列；
所述第二猝灭剂具有以下结构：
和
所述荧光团具有以下结构：
35.权利要求2所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸是第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸适于与具有结构3’-Y3-Y4-5’的第二寡核苷酸杂交，其中：
Y3包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括第五核苷酸N5；以及
Y4包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括与核苷酸N5直接连接的第六核苷酸N6；
其中，如果所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交，则具有N5的N2碱基对和具有N6的N3碱基对形成双螺旋，该双螺旋的Tm高于在所述第二寡核苷酸和具有结构5’-Y1-Y2-3’的第三寡核苷酸之间形成的双螺旋的Tm。
36.权利要求2所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸是第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸适于与具有结构3’-Y3-Y4-5’的第二寡核苷酸杂交，其中：
Y3包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括第五核苷酸N5；以及
Y4包括4个或更多个DNA或RNA核苷酸的序列，该序列包括与核苷酸N5直接连接的第六核苷酸N6；
其中，如果所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交，则具有N5的N2碱基对和具有N6的N3碱基对形成双螺旋，该双螺旋的Tm低于在所述第二寡核苷酸和具有结构5’-Y1-Y2-3’的第三寡核苷酸之间形成的双螺旋的Tm。
37.一种检测样品中的第二寡核苷酸的方法，包括：
使所述样品与权利要求35或36所述的核酸探针接触，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过向第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个的供体-受体能量转移减少荧光团的荧光；以及
检测到荧光的增加表示样品中存在所述第二寡核苷酸。
38.权利要求37所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量转移减少荧光。
39.权利要求37所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过基态猝灭减少荧光。
40.权利要求37所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量和基态猝灭两者减少荧光。
41.权利要求37至40中任一项所述的方法，其中，所述荧光的增加由所述荧光团从所述第一寡核苷酸的裂解引起。
42.权利要求37至41中任一项所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸未杂交时，所述第一寡核苷酸形成无规卷曲构象，使得所述荧光团的荧光减少。
43.权利要求37至41中任一项所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸包括自我互补的序列，并且其中所述猝灭剂和所述荧光团连接于所述第一寡核苷酸，使得当核酸聚合物经历分子内碱基配对时，所述荧光团的荧光被所述猝灭剂猝灭。
44.权利要求37至43中任一项所述的方法，其中，所述方法用于PCR反应，其中PCR产物的合成导致荧光的增加。
45.一种检测样品中的第二寡核苷酸的方法，包括：
使所述样品与权利要求1至34中任一项所述的核酸探针接触，其中，所述寡核苷酸是第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸适于与第二寡核苷酸杂交，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过向第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个的供体-受体能量转移减少荧光团的荧光；以及
检测到荧光的增加表示样品中存在所述第二寡核苷酸。
46.权利要求45所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量转移减少荧光。
47.权利要求45所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过基态猝灭减少荧光。
48.权利要求45所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸不与所述第二寡核苷酸杂交时，通过荧光共振能量和基态猝灭两者减少荧光。
49.权利要求45至48中任一项所述的方法，其中，所述荧光的增加由所述荧光团从所述第一寡核苷酸的裂解引起。
50.权利要求45至49中任一项所述的方法，其中，当所述第一寡核苷酸未杂交时，所述第一寡核苷酸形成无规卷曲构象，使得所述荧光团的荧光减少。
51.权利要求45至49中任一项所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸包括自我互补的序列，并且其中所述猝灭剂和所述荧光团连接于所述第一寡核苷酸，使得当核酸聚合物经历分子内碱基配对时，所述荧光团的荧光被所述第一猝灭剂和第二猝灭剂中的一个或两个猝灭。
52.权利要求45至51中任一项所述的方法，其中，所述方法用于PCR反应，其中PCR产物的合成导致荧光增加。
53.一种核酸探针，包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与其连接的：
第一猝灭剂，具有包括选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及其组合的至少三个残基的结构，其中，所述残基中的至少两个通过环外重氮键共价连接；以及
第二猝灭剂；
其中，所述第一猝灭剂连接于核苷酸，该核苷酸是从所述寡核苷酸的5’端到3’端的8、9、10或11个核苷酸；并且
所述第一猝灭剂和所述第二猝灭剂通过独立地选自以下的成员连接于所述寡核苷酸：单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
54.根据权利要求53所述的核酸探针，其中，所述寡核苷酸进一步包括通过选自以下的成员连接于所述寡核苷酸的5’端的荧光团：单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
55.根据权利要求53或54所述的核酸探针，其中，所述至少三个残基中的每一个是取代或未取代的苯基。
56.根据权利要求55所述的核酸探针，其中，所述至少三个残基中的至少两个是被至少一个C1-C6未取代的烷基部分取代的苯基。
57.根据权利要求56所述的核酸探针，其中，所述第一猝灭剂具有以下结构：
其中，L3是选自以下的成员：单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
58.根据权利要求53、54和57中任一项所述的核酸探针，其中，所述第二猝灭剂具有以下结构，所述结构包括选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基及其组合的至少3个残基，其中，所述残基中的至少两个通过环外重氮键共价连接。
59.根据权利要求58所述的核酸探针，其中，所述第二猝灭剂连接于所述寡核苷酸的3’端。
60.根据权利要求53至59中任一项所述的核酸探针，其中，所述第二猝灭剂具有以下结构：
其中，Re2、Re5、Rf2和Rf4独立地选自H、取代的或未取代的烷基、取代或未取代的烷氧基、和硝基；并且
L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
61.权利要求60所述的核酸探针，其中，Re2是未取代的C1-C4烷基；Re5是H；Rf2是未取代的C1-C4烷基；并且Rf4是H。
62.权利要求60所述的核酸探针，其中，Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷基；Rf2是硝基；并且Rf4是未取代的C1-C4烷基。
63.权利要求60所述的核酸探针，其中，Re2是未取代的C1-C4烷氧基；Re5是未取代的C1-C4烷氧基；Rf2是H；并且Rf4是硝基。
64.权利要求53至59中任一项所述的核酸探针，其中，所述第二猝灭剂具有以下结构：
其中，L4选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
65.权利要求53至64中任一项所述的核酸探针，其中，所述荧光团具有以下结构：
其中，L5选自单键、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的杂烷基和取代的或未取代的杂环烷基。
66.权利要求65所述的核酸探针，其中，所述荧光团具有以下结构：
67.一种检测核酸靶序列的方法，所述方法包括：
(a)使所述靶序列与包括单链靶结合序列的检测核酸接触，
其中，所述检测核酸是根据权利要求1至36和54至66中任一项所述的核酸探针，并且所述检测核酸处于在激发所述荧光团时允许在所述荧光团与所述第一猝灭剂和所述第二猝灭剂中的一个或两个之间进行供体-受体能量转移的构象；
(b)使所述靶结合序列与所述靶序列杂交，从而改变所述检测核酸的构象，导致荧光参数的变化；以及
(c)检测所述荧光参数的变化，从而检测所述核酸靶序列。
68.一种确定第一核酸和第二核酸是否杂交的方法，其中，所述第一核酸是根据权利要求1至36和53至66中任一项所述的核酸探针，该方法包括：
(a)使所述第一核酸与所述第二核酸接触；以及
(b)检测选自所述第一核酸、所述第二核酸及其组合的成员的荧光特性的改变，从而确定所述杂交是否发生。
69.一种监测核酸扩增反应的方法，该方法包括：
(a)制备包括检测核酸的扩增反应混合物，其中，所述检测核酸是根据权利要求1至36和54至66中任一项所述的核酸探针；
(b)使所述扩增反应混合物处于扩增条件；
(c)监测所述反应混合物的来自所述检测核酸的荧光信号以获得测定结果；以及
(d)采用测定结果监测所述核酸扩增反应。
70.一种检测靶序列的扩增的方法，所述方法包括：
(a)使包括所述靶序列的样品核酸与位于所述靶序列侧翼的PCR引物杂交；
(b)用聚合酶延伸杂交的引物以产生PCR产物，并将所述PCR产物的两条链分离以使所述靶序列的有义链和反义链接近；
(c)使检测核酸杂交到PCR产物中的靶序列的有义链或反义链，从而改变所述检测核酸的构象，导致荧光参数的变化，其中，所述检测核酸是根据权利要求1至36和54至66中任一项所述的核酸探针；
其中，在所述检测核酸与所述靶序列杂交之前，所述检测核酸处于在激发荧光团时允许所述荧光团与所述第一猝灭剂和所述第二猝灭剂中的一个或两个之间进行供体-受体能量转移的构象；以及
(d)检测所述荧光参数的变化以检测所述靶序列及其扩增。
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