JP2013156263A - 細胞処理液及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に到るまでの時間を短縮することができ、これにより測定者の負担軽減を図る。
【解決手段】フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色の工程前の細胞懸濁液を添加する細胞処理液であって、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を凍結乾燥することにより製造される。
【選択図】図４

Description

この発明は、フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために用いる細胞処理液及びその製造方法に関するものである。
従来、フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定を行う場合、組織を機械的に破砕して細胞単離を行い、この細胞単離において得られた細胞懸濁液を所定メッシュ径のメッシュにより濾過した後、最初に、界面活性剤による裸核化を行い、次に、ＲＮＡ除去液を用いたＲＮＡ除去を行って、最後に蛍光染色色素による蛍光染色を行っていた。
このような測定方法においては、上記界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液を用いたＲＮＡ除去、蛍光染色色素による蛍光染色が順を追って行われるものである（特許文献１参照）。
特表平９−５０９４９６号公報
しかしながら、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液を用いたＲＮＡ除去、蛍光染色色素による蛍光染色を順を追って行う場合には、これらの三工程のために３０分程度の時間を要しており、測定者にとって負担となる作業になっていた。
本発明は上記のようなフローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定における現状に鑑みなされたもので、その目的は、フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に到るまでの時間を短縮することができ、これにより測定者の負担軽減を図るための、細胞処理液及びその製造方法を提供することである。
本発明に係る細胞処理液は、フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色の工程前の細胞懸濁液を添加する細胞処理液であって、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を凍結乾燥することにより製造されることを特徴とする。
本発明に係る細胞処理液は、10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機を用い凍結乾燥によって製造されることを特徴とする。
本発明に係る細胞処理液の製造方法は、フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色の工程前の細胞懸濁液を添加する細胞処理液の製造方法の製造方法であって、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を凍結乾燥することにより製造することを特徴とする。
本発明に係る細胞処理液の製造方法は、10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機を用い凍結乾燥によって製造することを特徴とする。
本発明に係る細胞処理液及びその製造方法は、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を凍結乾燥することにより製造するものであるため、試薬調整の手間が無く、この製造方法により得られた細胞処理液に、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色の工程前の細胞懸濁液を添加すれば良く、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去及び蛍光染色の各処理を一度に進行させることができ、従来、界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液を用いたＲＮＡ除去、蛍光染色色素による蛍光染色を順を追って行うことにより要していた時間を短縮化することができ、測定者の負担を軽減する。
細胞核ＤＮＡ量測定方法としてのプロトコルを示すフローチャート。 フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定の結果の一例を示す図。 従来の手法によるフローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定の結果と、本発明実施例によるフローサイトメータによる細胞核DNA量測定の結果との差異を示す図。 本発明に係る細胞処理液を用いた細胞核ＤＮＡ量測定方法のプロトコルを示すフローチャート。 本発明に係る細胞処理液を用いずに行う、細胞核ＤＮＡ量測定方法のプロトコルを示すフローチャート。
以下添付図面を参照して本発明に係るフローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために用いる細胞処理液及びその製造方法の各実施例を説明する。
ここでは先に、乾燥凍結させていない細胞処理液を用いる場合を説明する。フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に際して、図１に示すフローチャートのプロトコルにより細胞核ＤＮＡ量測定を行う。まず、組織の機械的破砕を行う組織破砕システムを用いる。この組織破砕システムとしては、フローサイトメータの前処理装置である、例えば、メディマシーン及びメディコン（いずれも、アズワン株式会社製）を用いることができる。
上記メディコンに、冷ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を１ｍｌ注入して（Ｓ１１）、予め用意した組織片をメディコンの上部容器に入れて蓋をし、メディコンをメディマシーンにセットして、組織破砕を行う（Ｓ１２）。この組織破砕においては、例えば回転刃の回転数１００ｒｐｍで１０秒行う。
ステップＳ１２の処理後に、メディコンを取り出し、細胞懸濁液を吸引して試験管に移し（Ｓ１３）、新たな冷リン酸緩衝液をメディコンに１ｍｌ注入して（Ｓ１４）、ステップＳ１２、Ｓ１３を繰り返す。以上を細胞単離工程と称する。
上記の機械的破砕による細胞単離工程において得られ試験管に回収された細胞懸濁液を、例えば１００μメッシュ径のメッシュにより濾過する（Ｓ１５）。これを濾過工程と称する。
次に、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を混和することにより細胞処理液を生成する（Ｓ１６）。この処理を液生成工程と称する。いうまでもなく界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を混和せず、それぞれを別途同時に細胞懸濁液に加えてもよい。液生成工程では、例えば、界面活性剤として０．５ｍｌの０．２％Triton X-100 (Chameleon Reagent製)/リン酸緩衝液、ＲＮＡ除去液として１ｍｌの０．１％RNase（Worthington Biochemical Corporation製）/リン酸緩衝液、蛍光染色色素として２ｍｌの100μｇ／ｍｌ ヨウ素化プロピジウム(Propidium lodide) /リン酸緩衝液（和光純薬製）、の比により細胞処理液の製造を行う。
また、ステップＳ１６の過程については、取り扱いを容易にするため、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素をあらかじめ凍結乾燥しておき、これを用いた細胞処理液を生成する工程（図４のステップＳ１６Ａ）に適用してもよい。例えば、10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機（KYOWA VAC RLE−52ES：共和真空技術製）を用い凍結乾燥を行った。この凍結乾燥した試薬を、使用時に2mLのリン酸緩衝液で溶解し液体に戻すことで、上記ステップＳ１６の液生成工程で生成した細胞処理液と同様に使用する（図４のステップＳ１６Ａ）。
なお、ステップＳ１６またはＳ１６Ａにおいて用いる界面活性剤としては、Triton X-100の他に、Tween 20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ＮＰ-40（polyoxyethylene(9)octyiphenylether）を、蛍光染色色素として、PIの他に、DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)など、を用いることも可能である。
上記濾過工程により得られた細胞懸濁液を、上記液生成工程により得られた細胞処理液に添加し、例えば所定時間である６分間反応させる（Ｓ１７）。これを染色工程と称する。この染色工程に用いる細胞処理液は、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素が混和されたものであるから、界面活性化、ＲＮＡ除去及び蛍光染色が同時進行することになり、反応させるための時間を６分と短縮できている。細胞懸濁液を、界面活性剤、ＲＮＡ除去液、蛍光染色色素に個別に適用して反応させずに、反応を同時進行させる点においても時間短縮を図っている。
上記の染色工程が終了した細胞懸濁液をフローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供して結果を得る（Ｓ１８）。図２に示すように、蛍光強度を横軸にとり、縦軸に細胞数をとって結果を表す場合、Ｇ０／Ｇ１期の第１ピークと、Ｇ２／Ｍ期の第２ピークとについて、従来手法と本実施例手法とのｎ＝６の分析を行い比較を行った。それぞれのピークに対して蛍光強度の平均値、変動係数ＣＶ、ピークに含まれる細胞の割合を図３に示す。
上記図３の結果について、ｔ検定を行って求めた有意確率ｐを表示してある。この場合、ｐ＜0.05で有意差ありとした。これに対し、有意確率ｐは、ｐ≧0.10828であり、いずれも有意差なしであることが分かる。
上記において、ステップＳ１６において細胞処理液を生成しているが、この細胞処理液は、このステップ１６より前の濾過工程より前または細胞単離工程より前に液生成工程を行うことにより製造しておいて、染色工程において用いることができる。
また、ステップＳ１６において生成した細胞処理液或いはステップＳ１６Ａにおいて用いた乾燥凍結した試薬は、予め製造してキットとして、フローサイトメータを用いて細胞核ＤＮＡ量測定する場合に提供することができる。このキットは、図１のフローチャートによる細胞核ＤＮＡ量測定方法を行う場合に、ステップＳ１６の工程において生成した細胞処理液に代えて用いることができ、また、ステップＳ１６Ａにおいて用いることができる。
上記以外としては、フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に際して、図５のフローチャートに示すプロトコルにより細胞核ＤＮＡ量測定を行う。まず、組織の単離・染色を行うために、界面活性剤Triton X-100(Chameleon Reagent製)、ＲＮＡ除去液としてRNase（Worthington Biochemical Corporation製）、蛍光染色色素としてヨウ素化プロピジウム(Propidium lodide)及び燐酸緩衝液を混合した組織単離・染色用の溶液を生成する（Ｓ２1：混合工程）。組織単離・染色用の溶液内に組織を投入し（Ｓ２２）、混合液体をノズルにより吸引し（Ｓ２３）・吸引したノズル内の混合液を吐出する（Ｓ２４）。ステップＳ２３、Ｓ２４を繰り返すことにより細胞が単離し、また染色が行われる。上記ステップＳ２２と、Ｓ２３、Ｓ２４を繰り返す工程を、ピペッティング工程と称す。その後、上記でステップＳ２３、Ｓ２４を繰り返すことにより得られた液体をメッシュで濾過し、細胞懸濁液を生成する（Ｓ２５：濾過工程）。濾過工程により得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリーによる染色体分析に供して結果を得る（Ｓ２６：分析工程）。なお、図４のステップＳ１６Ａに関する説明において記載した方法により、界面活性剤Triton X-100、ＲＮＡ除去液、蛍光染色色素を事前に凍結乾燥しておき、燐酸緩衝液により溶解し、組織を投入してもよい。
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は前述した実施例に限定されることなく、本発明の精神を逸脱しない範囲内において、多くの設計変更を行うことができる。プロトコルにおいては、界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素の内、界面活性剤とＲＮＡ除去液を混和し、蛍光染色色素を別途同時又はほぼ同時に細胞懸濁液に添加することにより反応を同時進行させてもよい。

Claims (4)

  1. フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために、
    界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色の工程前の細胞懸濁液を添加する細胞処理液であって、
    界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を凍結乾燥することにより製造されることを特徴とする細胞処理液。
  2. 10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機を用い凍結乾燥によって製造されることを特徴とする請求項１に記載の細胞処理液。
  3. フローサイトメータによる細胞核ＤＮＡ量測定に供する細胞懸濁液を生成するために、
    界面活性剤による裸核化、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色の工程前の細胞懸濁液を添加する細胞処理液の製造方法の製造方法であって、
    界面活性剤、ＲＮＡ除去液及び蛍光染色色素を凍結乾燥することにより製造することを特徴とする細胞処理液の製造方法。
  4. 10%Triton X-100/RO水、1%ヨウ素化プロピジウム/RO水、1%RNase/RO水を、1対10対2(体積)の割合で混合した溶液を、65μLずつ試験管に分注し、凍結乾燥機を用い凍結乾燥によって製造することを特徴とする請求項３に記載の細胞処理液の製造方法。
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