JP4528664B2

JP4528664B2 - 蛍光粒子計数装置

Info

Publication number: JP4528664B2
Application number: JP2005116641A
Authority: JP
Inventors: 泰亮廣野
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2005-04-14
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2025-04-14
Also published as: JP2005331506A

Description

本発明は、２種以上の液体を混和させるためのマイクロチップを備えた蛍光粒子計数装置に関する。

従来、粒子を蛍光染色した上で計数することが、様々な技術分野で行われている。例えば、医療の分野では、血液から血小板及び赤血球を抽出した血小板製剤および赤血球製剤が使用されているが、これらの血小板製剤や赤血球製剤には白血球が残存していない方が好ましいため、製造過程において白血球の除去が行われる。そして、血小板製剤や赤血球製剤から白血球が除去されたかどうかの確認のための白血球の計数が行われている（例えば、特許文献１参照）。

図４は、白血球計数装置の従来構造の一例を示すブロック図であり、図中の符号１００は、蛍光染色した血小板製剤等を入れるための撮像用容器を示し、符号１０１は、該撮像用容器１００にレーザビームを照射するレーザ光源を示し、符号１０２はミラーを示し、符号１０３はＣＣＤカメラを示す。このような装置において、レーザ光源１０１にてレーザビーム（励起光）を撮像用容器１００に照射すると、白血球の像がＣＣＤカメラ１０３にて撮影される。その画像は、不図示のコンピュータに取り込まれ、画像処理が施されて白血球の数が計数される。

ところで、計数対象である粒子を蛍光染色するには、粒子を含む溶液に蛍光色素を混和させる必要がある。例えば、血小板製剤中の白血球を蛍光染色するためには、プロピディウム・イオダイド等の蛍光色素と血小板製剤（正確には、トライトンＸなどの界面活性剤などにより血小板や赤血球を除去し、白血球を裸核化した状態のもの）とを混和させる必要がある。

なお、蛍光粒子の計数を目的としたものではないが、２種以上の液体を混和させる装置（マイクロチップ）としては、図５に示す構造のものが提案されている（例えば、特許文献２及び特許文献３参照）。図中の符号２００は液状の検体を供給するための検体供給口を示し、符号２０１はその流路を示し、符号２０２は液状の試薬を供給する試薬供給口を示し、符号２０３はその流路を示す。これらの供給口２００，２０２から供給された検体及び試薬は合流部２０４にて合流して混合され、流出路２０５を経由して排出口２０６から排出されるようになっている。

特開２００１−８３０９２号公報特開２００２−２２１４８５号公報特開２００３−１８１２５５号公報

しかしながら、粒子を蛍光染色するには、粒子を含む溶液に、蛍光色素を十分に混和させておく必要がある。例えば、ヨウ化プロピジウム、エチジウムブロマイドなどの蛍光色素により白血球を蛍光染色する場合、該蛍光色素を白血球細胞核のＤＮＡの塩基と塩基の間に滑り込ませる必要があり、十分に混和させる必要がある。しかし、図５に示す構造のもので蛍光色素を混和させて、図４に示す計数装置で計数しようとしても、蛍光染色が不十分で、粒子の計数の精度も悪くなってしまうという問題があった。また、上述のように血小板や赤血球を除去し、白血球を裸核化する場合には、界面活性剤を十分に混和させ、反応させる必要があるが、図５に示す構造のものでは、混和が不十分で血小板や白血球細胞膜等が残存してしまい、白血球の計数の精度も悪くなってしまうという問題があった。

また、図４に示す計数装置を用いる場合、
・蛍光染色した血小板製剤等を撮像用容器１００に入れる作業
・蛍光粒子を容器の底部に落着させるために撮像用容器１００を回転させる処理（遠心処理）
・撮像用容器１００に入っている試料をトレース（特定）する作業
が必要となり、計数作業が煩雑になるという問題があった。

さらに、図４に示す計数装置の場合、測定用試料の濃度に応じて光路を切り換える必要があり、その分、計数作業が繁雑になったり、装置の構造が複雑になったりしていた。

本発明は、計数作業が簡単な蛍光粒子計数装置を提供することを目的とするものである。

請求項１に係る発明は、図１に例示するものであって、計数対象である粒子を含む第１液（Ｌ１）が流入される第１流入路（Ｂ１）、蛍光色素を含む第２液（Ｌ２）が流入される第２流入路（Ｂ２）、これらの流入路（Ｂ１，Ｂ２）に連通されると共に略ジグザグ状に湾曲するように構成されていてこれらの流入路（Ｂ１，Ｂ２）から流入された前記第１液（Ｌ１）及び前記第２液（Ｌ２）を混和して蛍光粒子（図２及び図３の符号３参照）を生成する混和部（Ｃ）、該混和部（Ｃ）に連通するように配置されて前記混和された液が流出される流出路（Ｄ）、及び、前記混和部（Ｃ）の下流側であって前記流出路（Ｄ）の上流側に設けられてなる第４液（Ｌ４）を供給して前記蛍光粒子（３）を整列させるための第４流入路（Ｂ４）、からなるマイクロチップ（Ａ）と、
前記流出路（Ｄ）に送り出された蛍光粒子（３）を計数する蛍光粒子計数部（Ｅ）と、
を設けて構成した蛍光粒子計数装置についてのものである。

請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明において、前記第１液（Ｌ１）及び前記第２液（Ｌ２）を希釈するための希釈液（Ｌ３）を前記混和部（Ｃ）の上流側に供給するための第３流入路（Ｂ３）、を設けて構成したことを特徴とする。

請求項３に係る発明は、図１に例示するように、請求項１又は２に記載の発明において、前記蛍光粒子計数部（Ｅ）は、前記流出路（Ｄ）の蛍光粒子（３）に励起光を照射する光源（１０）と、該励起光の前記蛍光粒子（３）への照射により発生した蛍光を捕捉する蛍光測定手段（１１）と、により構成された、ことを特徴とする。

請求項４に係る発明は、請求項１乃至３のいずれか1項に記載の発明において、前記第１流入路（Ｂ１）は、白血球を含む第１液（Ｌ１）が流入される流入路であり、
前記第２流入路（Ｂ２）は、前記白血球の細胞膜を溶解するための界面活性剤及び前記白血球を蛍光染色するための蛍光色素を含む第２液（Ｌ２）が流入される流入路である、ことを特徴とする。

請求項５に係る発明は、請求項４に係る発明において、前記第１流入路（Ｂ１）は、採血装置や血液バッグが装着可能な接続部（４）を有する、ことを特徴とする。

請求項６に係る発明は、請求項３乃至５のいずれか1項に記載の発明において、前記蛍光測定手段（１１）の出力を一定時間毎に取得するサンプリング手段（１４）と、
前記サンプリング手段（１４）の出力に基づき蛍光粒子（３）を計数するカウント手段（１５）と、を設けて構成したことを特徴とする。

請求項７に係る発明は、請求項３乃至６のいずれか１項に記載の発明において、前記蛍光測定手段（１１）が、静止画像を所定時間毎に順次取得するカメラである、ことを特徴とする。

請求項８に係る発明は、請求項７に記載の発明において、前記カウント手段（１５）による蛍光粒子の計数は、前記蛍光測定手段（１１）が取得した各静止画像における所定の蛍光分布測定領域（図６及び図７の符号Ｋ_１，Ｋ_２，Ｋ_３参照）に対して行い、
蛍光粒子が移動する方向における、前記所定の蛍光分布測定領域の幅ｗは、次式を満たす、ことを特徴とする。

請求項９に係る発明は、請求項８に係る発明において、図７(a)(b)に例示するように、前記流出路（Ｄ）を流れる液体の流速が、該流出路（Ｄ）の壁面近傍部から中央部にかけて変化する場合は、該壁面からｘだけ離れたところにおける前記蛍光分布測定領域（Ｋ_２，Ｋ_３）の幅ｗ_ｘは、次式を満たす、ことを特徴とする。

請求項１０に係る発明は、請求項９に記載の発明において、前記蛍光分布測定領域（Ｋ_２，Ｋ_３）における上流側の縁（２３，２５）が前記流出路（Ｄ）を横切る直線で、該領域における下流側の縁（２４，２６）が該下流側に突出した曲線であって、該領域（Ｋ_２，Ｋ_３）は、野球のホームベースのような形状である、ことを特徴とする。

請求項１１に係る発明は、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の発明において、前記カウント手段（１５）が、前記静止画像において、前記蛍光分布測定領域（Ｋ_１，Ｋ_２，Ｋ_３）における上流側の縁（２１，２３，２５）を通過している瞬間の蛍光粒子（３_１）、及び該蛍光分布測定領域における下流側の縁（２２，２４，２６）を通過している瞬間の蛍光粒子（３_２）のいずれか一方のみをカウントし、他方をカウントしないように構成された、ことを特徴とする。

なお、括弧内の番号などは、図面における対応する要素を示す便宜的なものであり、従って、本記述は図面上の記載に限定拘束されるものではない。

請求項１，３及び６に係る発明によれば、混和部は略ジグザグ状に湾曲されて形成されているので、第１液と第２液とを十分に混和させることができる。また、混和部を通り抜けるのに時間がかかるため、その間に、第１液と第２液とを十分に反応させて粒子を蛍光染色することができ、蛍光粒子計数部による蛍光粒子の計数を正確に行うことができる。さらに、マイクロチップの流入路や流出路を細くして第１液及び第２液の量を少なくすることができる。例えば、第１液が血小板製剤や血液であったとしても、無駄な血小板製剤等の損失を抑制できる。またさらに、第４液の供給により蛍光粒子を薄く整列させることができるので、第１液及び第２液の濃度にかかわらず蛍光粒子を前記蛍光粒子計数部により正確に測定できる。したがって、特許文献１のように、測定対象である液体の濃度に応じて光路を切り換えたりする必要が無く、計数作業や装置の構造を簡素化することができる。また、上記従来装置のように、遠心処理を行って蛍光粒子を整列させたりする必要も無いため、計数作業を簡素化でき、計数精度も向上できる。ヒューマン・エラーによる情報誤認識を排除でき、検査員の精神的・肉体的苦痛を低減できる。

請求項２に係る発明によれば、希釈液により第１液及び第２液を希釈化できるので、第１液及び第２液が粘度の高いものであっても蛍光粒子を薄く整列させることができ、蛍光粒子の計数を正確に行うことができる。

請求項４に係る発明によれば、第１液中の血小板や赤血球を除去でき、白血球細胞膜を溶解して白血球細胞核を蛍光染色できるので、白血球を正確に計数することができる。

請求項５に係る発明によれば、採血装置や血液バッグを前記接続部に接続するだけで白血球の計数ができ、上記従来装置のように別容器（例えば、図４に示す撮像用容器１００）に測定用試料を移し換えたりする必要が無いため、計数作業を簡素化することができる。また、採血装置や血液バッグに直接つながっている装置で計数できるので、情報をトレースする必要ないので、ヒューマン・エラーによる情報誤認識を排除でき、検査員の精神的・肉体的苦痛を低減できる。

請求項７に係る発明によれば、市販のカメラを使用することができ、専用の蛍光測定手段を作成する必要が無い分だけコストを低減することができる。

請求項８に係る発明によれば、一定の仮想領域を利用して蛍光粒子を計数するため、領域を利用しない場合に比べて計数精度を高めることができる。

請求項９及び１０に係る発明によれば、流出路の壁面近傍部から中央部にかけて流速が変化するような場合においても蛍光粒子の計数精度を高めることができる。

請求項１１に係る発明によれば、重複カウントを低減して、計数精度を高めることができる。

以下、図１乃至図３、並びに図６及び図７に沿って、本発明を実施するための最良の形態について説明する。

図１は、本発明に係るマイクロチップ及び蛍光粒子計数装置の構造の一例を示す模式図であり、図２は、第４液の流入により蛍光粒子を整列させる様子を示す模式図であり、図３(a)は、蛍光粒子を計数する方法を説明するための模式図であり、図３(b)は、同図(a)のゲート２０に沿った蛍光強度分布を示す波形図である。また、図６は、蛍光粒子を計数する別の方法を説明するための模式図であり、図７は、蛍光粒子を計数するさらに別の方法を説明するための模式図である。

本発明に係るマイクロチップは、図１に符号Ａで示すように、第１液Ｌ１が流入（送液）される第１流入路Ｂ１と、第２液Ｌ２が流入される第２流入路Ｂ２と、これらの流入路Ｂ１，Ｂ２に連通されると共に屈曲するように構成されていて前記第１液Ｌ１及び前記第２液Ｌ２が流入されて混和される混和部Ｃと、該混和部Ｃに連通するように配置されて前記混和された液が流出される流出路Ｄと、を備えている。本発明によれば、混和部Ｃは屈曲するように構成されているので、第１液Ｌ１と第２液Ｌ２とを十分に混和させることができる。

上述した混和部Ｃは、前記第１液Ｌ１と前記第２液Ｌ２とが十分に混和されるように、略ジグザグ状に湾曲させておくと良い。そのようにした場合には、第１液Ｌ１と第２液Ｌ２とを十分に混和させることができる。また、混和部Ｃを通り抜けるのに時間がかかるため、その間に、第１液Ｌ１と第２液Ｌ２とを十分に反応させることができる。例えば、後述の界面活性剤により、白血球細胞膜や赤血球や血小板を十分に溶解することができる。

なお、上述した流入路Ｂ１，Ｂ２や混和部Ｃや流出路Ｄは、基板１の表面に溝状に形成すると共に、該表面にカバー部材２を貼着することにより形成すると良い。

一方、本発明に係る蛍光粒子計数装置は、上述した構成のマイクロチップＡを備えている。このマイクロチップＡの第１流入路Ｂ１には、第１液Ｌ１として、計数対象である粒子（例えば、白血球）を含む測定用試料（例えば、血液や血小板製剤や赤血球製剤等）を流入させ、第２流入路Ｂ２には、第２液Ｌ２として、蛍光色素を含む溶液を流入させると良い。そのようにした場合には、第１液Ｌ１と第２液Ｌ２とが混和部Ｃにて混和されて蛍光粒子（図２の符号３参照）が生成され、該蛍光粒子３が前記流出路Ｄに送り出されることとなる。そして、この送り出される蛍光粒子３を蛍光粒子計数部（図１の符号Ｅ参照）により計数するようにすると良い。この蛍光粒子計数装置によれば、前記第１液Ｌ１と前記第２液Ｌ２とを十分に混和させて粒子を蛍光染色することができ、蛍光粒子計数部Ｅによる蛍光粒子３の計数を正確に行うことができる。また、マイクロチップＡの流入路Ｂ１，Ｂ２や流出路Ｄを細くして第１液Ｌ１及び第２液Ｌ２の量を少なくすることができる。例えば、第１液Ｌ１が血小板製剤や血液であったとしても、無駄な血小板製剤等の損失を抑制できる。

なお、血小板製剤や赤血球製剤中の白血球を計数する場合には、血小板や赤血球を除去すると共に、白血球を裸核化（白血球の細胞膜を除去すること）しておく必要がある。そのためには、白血球細胞膜、血小板及び赤血球を溶解するための界面活性剤を、前記第１液Ｌ１（上述した製剤）又は前記第２液Ｌ２（蛍光色素を含む溶液）に混入しておくと良い。例えば、前記第１流入路Ｂ１を、白血球を含む第１液Ｌ１が流入される流入路とし、前記第２流入路Ｂ２を、前記白血球の細胞膜を溶解するための界面活性剤及び前記白血球を蛍光染色するための蛍光色素を含む第２液Ｌ２が流入される流入路にすると良い。そのようにした場合には、血小板や赤血球を除去でき、白血球細胞膜を溶解して白血球細胞核を蛍光染色できるので、白血球を正確に計数することができる。ここで、界面活性剤としてはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などを挙げることができ、蛍光色素としては、例えば、ヨウ化プロピジウム、エチジウムブロマイドなど挙げることができる。

なお、図１では、第２流入路Ｂ２は１本であるが、２本以上として、界面活性剤及び蛍光色素を異なる流入路Ｂ２から供給するようにしても良い。

ところで、前記混和部Ｃよりも上流側に第３流入路Ｂ３を設けておいて、前記第１液Ｌ１及び前記第２液Ｌ２を希釈するための希釈液（第３液）Ｌ３を前記混和部Ｃの上流側に供給できるようにしておくと良い。そのようにした場合には、前記第１液Ｌ１及び前記第２液Ｌ２を希釈化できるので、前記第１液Ｌ１及び前記第２液Ｌ２が粘度の高いもの（例えば、高脂血症傾向のある粘性の高い血液や乳び血液）であっても蛍光粒子を薄く整列させることができ、蛍光粒子の計数を正確に行うことができる。希釈液としては、細胞が安定に存在でき、かつ、無色透明なバッファーを用いると良く、具体的にはＰＢＳバッファーを用いると良い。なお、前記第１液Ｌ１を前記第１流入路Ｂ１に流入させる前、或いは前記第２液Ｌ２を前記第２流入路Ｂ２に流入させる前に前記第１液Ｌ１又は前記第２液Ｌ２を希釈液にて適当な粘度（少なくともこれらの液Ｌ１，Ｌ２が各流入路Ｂ１，Ｂ２をスムーズに流れる程度の粘度）となるように予め希釈しておき、その後、前記第３流入路Ｂ３からも希釈液を流入させることにより最適粘度（例えば、蛍光粒子３が１個１個離間した状態で流れるような最適粘度）にするようにすると良い。例えば、粘度の高い血液に希釈液を混ぜて適当な粘度の第１液Ｌ１を調整し、該調整した第１液Ｌ１を前記第１流入路Ｂ１に流入させ、その後、前記第２流入路Ｂ２から蛍光色素を混入させることにより白血球の蛍光染色を行い、さらにその後、前記第３流入路Ｂ３から希釈液を混入させて粘度の最終調整を行うようにしても良い。ところで、図１では、前記第３流入路Ｂ３は、前記第１流入路Ｂ１及び前記第２流入路Ｂ２の合流部（符号Ｈ１参照）よりも下流側（符号Ｈ２参照）にて合流されるように構成されているが（つまり、前記第１液Ｌ１及び前記第２液Ｌ２を混合させた後に前記希釈液Ｌ３が混入されるように構成されているが）、もちろんこれに限られるものではない。例えば、前記第１流入路Ｂ１及び前記第３流入路Ｂ３の合流部を前記第２流入路Ｂ２の合流部よりも上流側にして、前記第１液Ｌ１及び希釈液Ｌ３を混合させた後に前記第２液Ｌ２を混入させるようにしても、前記第２流入路Ｂ２及び前記第３流入路Ｂ３の合流部を前記第１流入路Ｂ１の合流部よりも上流側にして、前記第２液Ｌ２及び希釈液Ｌ３を混合させた後に前記第１液Ｌ１を混入させるようにしても良い。

ところで、幾つかの蛍光粒子３がくっついた状態で（塊になった状態で）前記蛍光粒子計数部Ｅが配置された箇所を通過すると、複数個の蛍光粒子３が１つとしてカウントされてしまって計数精度が悪くなってしまうので、蛍光粒子３はくっつかない状態（互いに離間する状態）で前記蛍光粒子計数部Ｅが配置された箇所を通過するようにしなければならない。そこで、蛍光粒子３がくっついた状態か否かを前記蛍光粒子計数部Ｅか他の手段にて検知するようにしておき、そこで検知した情報を前記第３流入路Ｂ３に希釈液を入れる手段（希釈液流入手段）や第４液Ｌ４（詳細は後述）を入れる手段（第４液流入手段）にフィードバックするようにしておき、蛍光粒子３の状態に応じて希釈液や第４液Ｌ４の流入量を調整し、それにより、蛍光粒子３が１個１個分離された状態で給送されるようにすると良い。

また、前記混和部Ｃの下流側であって前記流出路Ｄの上流側に第４液Ｌ４を供給するための第４流入路Ｂ４を設けておいて、前記混和部Ｃからの流れ（層流状態の流れ）を乱さないようにして前記第４液Ｌ４を供給することにより前記蛍光粒子３を整列させるようにすると良い（図２参照）。この第４液Ｌ４としては、上述のバッファーを用いると良い。この場合、第４液Ｌ４の流入方向や流入速度等を調整することにより、前記混和部Ｃからの層流を薄くし（符号ｄ１，ｄ２参照）、蛍光粒子３が、前記流出路Ｄの壁面に沿って１層だけ配列された状態で流されるようにすると良い。そのようにした場合には、前記第１液Ｌ１及び前記第２液Ｌ２の濃度にかかわらず蛍光粒子３を前記蛍光粒子計数部Ｅにより正確に測定できる。したがって、特許文献１のように、測定対象である液体の光吸収特性や光学的特性に応じて光路を切り換えたりする必要が無く、計数作業や装置の構造を簡素化することができる。即ち、流出路Ｄの、光源１０の光照射方向の厚さ（蛍光粒子３の層厚）が、カメラで撮影できるほどに薄く形成されることになるため、血小板製剤と全血／赤血球製剤の透過率の差が、液体中に残存する蛍光色素から励起されるバックグランド光としての蛍光の量の多寡に影響を与えることが極力防止されるので、そうしたバックグランド光の影響を防止するために、光源から流出路Ｄまでの光路を切り替える必要が無くなるものである。また、上記従来装置のように、遠心処理を行って蛍光粒子を整列させたりする必要も無いため、計数作業を簡素化でき（検査員の精神的・肉体的苦痛を低減でき）、計数精度も向上できる。ヒューマン・エラーによる情報誤認識を排除でき、検査員の精神的・肉体的苦痛を低減できる。もちろん、焦点深度の深い光学系を用いた場合には、この白血球核の整列処理を行う必要が無いので、図１に示したよりももっと単純な流路パターンを採用することができる。

一方、前記第１流入路Ｂ１には、採血装置や血液バッグが装着可能な接続部（アダプタ）４を設けておくと良い。その場合、採血装置や血液バッグを前記接続部４に接続するだけで白血球の計数ができ、上記従来装置のように別容器（例えば、図４に示す撮像用容器１００）に測定用試料を移し換えたりする必要が無いため、計数作業を簡素化することができる（検査員の精神的・肉体的苦痛を低減できる）。なお、白血球数が基準を上回っているものについては、白血球除去フィルタ等により白血球除去を行えば良い。上述のように計数作業が簡素化されるため、採取した血液の全数検査を行ったり抜き取り検査の回数を増やしたりすることも簡単となり、全数検査を行ったり抜き取り検査の回数を増やしたりした場合には、少ない回数の抜き取り検査をする場合に比べて不良品の発生をより確実に防止できる。さらに、採血装置や血液バッグに直接つながっている装置で計数できるので、情報をトレースする必要ないので（つまり、図４に示す撮像用容器１００を用いた場合には、各容器１００にどの試料が入っているかを特定する必要があるが、計数装置に採血装置等を直結した場合にはそのような特定を行う必要が無いので）、ヒューマン・エラーによる情報誤認識を排除でき、検査員の精神的・肉体的苦痛を低減できる。

また、前記流出路Ｄに開口部（出力口）５を設けておいて、該開口部５より吸引し、前記第１液Ｌ１や前記第２液Ｌ２が各流入路で層流状態で流れるようにすると良い。

ところで、上述した蛍光粒子計数部Ｅは、前記流出路Ｄの蛍光粒子３に励起光を照射する光源１０と、該励起光の前記蛍光粒子３への照射により発生した蛍光を捕捉（測定）する蛍光測定手段１１と、により構成すると良い。

この光源１０は、蛍光色素（白血球等の粒子を蛍光染色するための色素）の吸光特性に対応させて選択する必要がある。例えば蛍光色素としてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いた場合は、緑色光（５００〜５５０ｎｍぐらいの波長域の励起光）を発生させる光源が良く、蛍光色素としてエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を用いた場合は、紫外光を発生させる光源が良い。

また、蛍光測定手段１１としては、静止画像を所定時間毎に順次取得するカメラを用いることができ、具体的には、ビデオカメラ、ＣＣＤカメラ、或いはＵＳＢカメラ等のカメラを用いることができる。そのようにした場合には、市販のカメラを使用することができ、専用の蛍光測定手段を作成する必要が無い分だけコストを低減することができる。

なお、蛍光測定手段１１と前記流出路Ｄとの間に、蛍光により生じた光のみを通過させる（他の波長域の光は通過させない）ための光学フィルタ１２や、光を集光させるためのレンズ１３を配置しておくと良い。

一方、前記蛍光測定手段１１にはサンプリング手段１４を接続しておいて、該蛍光測定手段１１の出力を一定時間毎に取得するようにしておくと良い。また、このサンプリング手段１４にはカウント手段１５を接続しておいて、該サンプリング手段１４の出力に基づき蛍光粒子３を計数できるようにすると良い。すなわち、図３(a)に矢印Ｌ５で示すように、蛍光粒子３が流出路Ｄを移動して行くが、その流出路Ｄを横切るようなゲート２０を仮想的に設けておいて、該ゲート２０に沿った１次元的な蛍光強度分布を前記蛍光測定手段１１及び前記サンプリング手段１４により取得する。その結果、同図(b)に示すように１次元的な蛍光強度分布Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，…が一定時間毎に得られるが、このような蛍光強度分布をカウント手段１５が解析して、ゲート２０を通過する蛍光粒子３を計数して行けば良い。例えば、前記蛍光測定手段１１及び前記サンプリング手段１４を備えたカメラで、３０ｆｐｓのビデオレートで動画像を撮影したような場合は、１／３０秒毎に静止画像を得ることができ、各静止画像より図３(b)に示すような蛍光強度分布を得ることができる。得られた蛍光強度分布を解析することにより、蛍光粒子３の数を求めると良い。また、動画像圧縮／解析技術で用いられている動き検出技術を利用して、動画像中に現れる物体をとらえ、その数を数えるようにしても良い。

なお、上述のような１次元的な蛍光強度分布測定に基づいた蛍光粒子３の計数は、ゲート２０を通過する蛍光粒子３の全てが、ゲート２０を通過する瞬間をカメラで１回だけ撮影される必要がある。その理由は、もし、ゲート２０を通過する瞬間を撮影されずに流されていく蛍光粒子があれば、その蛍光粒子はカウントされないこととなり、その分、計数精度が悪くなるからである。また、反対に、カメラの撮影間隔（後にも記載しているように、カメラが一の静止画像を取得してから次の静止画像を取得するまでの時間）が短すぎてゲート２０を通過する瞬間を複数回撮影されてしまった蛍光粒子があれば、その蛍光粒子は重複カウントされてしまって、やはり計数精度が悪くなるからである。全ての蛍光粒子について、ゲート２０を通過する瞬間を１回だけ撮影するようにするには、ビデオカメラのビデオレートと流速（図３(a)の符号Ｌ_５に示すものであって、流出路Ｄを流れる液体の流速）の関係を最適に調整してやる必要がある。

しかしながら、上述のような１次元的な蛍光強度分布測定において蛍光粒子のカウントミスを回避することが困難な場合には、前記カウント手段１５による蛍光粒子の計数を、前記蛍光測定手段１１が取得した各静止画像における所定の蛍光分布測定領域に対して行うようにすると良い。そして、前記所定の蛍光分布測定領域の幅（蛍光粒子が移動する方向の長さ）ｗは、次式を満たすようにすると良い。そのようにした場合には、一定の仮想領域を利用して蛍光粒子を計数するため、領域を利用しない場合に比べてカウントミスを低減でき、計数精度を高めることができる。

かかる蛍光分布測定領域としては、図６に斜線で示すような２次元的な矩形領域Ｋ_１を挙げることができ、該領域の幅ｗ_１は、次式のようにすると良い。

矩形領域Ｋ_１の幅ｗ_１をそのように設定した場合、流出路中を流れる全ての蛍光粒子は、いずれかの静止画像の該領域Ｋ_１に理論的には１回だけ撮影されていることとなり、蛍光粒子の計数ミス（上述したようなカウント漏れや重複カウント）を少なくし、蛍光粒子の計数精度を上げることができる。ただし、図６に示すように、矩形領域Ｋ_１の上流側の辺（縁）２１を通過する瞬間であって、右半分だけが矩形領域Ｋ_１に侵入した状態で撮影された蛍光粒子３_１は、次の撮影タイミングではｗ_１だけ移動して符号３_２に示す位置を取り、結局、２回撮影されてしまうこととなり、両方をカウントすると計数精度が悪くなってしまう。そこで、撮影した全て静止画像においては、矩形領域（蛍光分布測定領域）Ｋ_１の上流側の辺２１を通過する瞬間の蛍光粒子（例えば、符号３_１に示す蛍光粒子）、及び矩形領域Ｋ_１の下流側の辺（縁）２２を通過する瞬間の蛍光粒子（例えば、符号３_２に示す蛍光粒子）の両方を前記カウント手段１５がカウントするのではなく、いずれか一方のみをカウントし、他方をカウントしないようにすると良い。そのようにした場合には、重複カウントを低減して、計数精度を高めることができる。

ところで、図６に示す方法は、流出路Ｄの中央部における流速（図６の符号Ｌ_５１参照）と、壁面近傍部における流速（図６の符号Ｌ_５０参照）とがほぼ等しい場合に有効であるが、実際には、それらの流速に差がある場合の方が多い。すなわち、少し速い流速で流出路Ｄに液体を流そうとすると、壁面２７に近接する部分では該壁面２７の影響を受けて流速が遅くなり、結局、流出路Ｄの中央部における流速Ｌ_５１が壁面近傍部における流速Ｌ_５０よりも速くなって、それらの流速に大きな差が生じてしまう。そのような場合（つまり、前記流出路Ｄを流れる液体の流速が、該流出路Ｄの壁面近傍部から中央部にかけて変化する場合）には、蛍光分布測定領域を図６のように一定幅ｗ_１の矩形状にするのではなく、図７(a)に例示するように、流出路Ｄの中央部における領域幅（符号ｗ_２１参照）を、壁面近傍部における領域幅（符号ｗ_２０参照）よりも広く設定すると良い。そして、流出路Ｄの壁面２７からｘだけ離れたところにおける前記蛍光分布測定領域の幅ｗ_ｘが、次式を満たすようにすると良い。そのようにした場合には、流出路Ｄの壁面近傍部から中央部にかけて流速が変化するような場合においても蛍光粒子の計数精度を高めることができる。

具体的には、次式のようにすると良い。

なお、流出路Ｄの中央部における流速Ｌ_５１と壁面近傍部における流速Ｌ_５０との差が大きくなれば、図７(b)に示すように、流出路Ｄの中央部における領域幅（符号ｗ_３１参照）を、壁面近傍部における領域幅（符号ｗ_３０参照）よりもかなり広く設定すると良い。

ところで、図７(a)に示す領域Ｋ_２においても、該領域Ｋ_２の上流側の辺（縁）２３を通過する瞬間であって、右半分だけが領域Ｋ_２に侵入した状態で撮影された蛍光粒子３_１は、次の撮影タイミングでは符号３_２に示す位置を取り、結局、２回撮影されてしまうこととなり、両方をカウントすると計数精度が悪くなってしまう。そこで、撮影した全ての静止画像においては、領域Ｋ_２の上流側の辺２３を通過する瞬間の蛍光粒子（例えば、符号３_１に示す蛍光粒子）、及び領域Ｋ_２の下流側の縁（境界線）２４を通過する瞬間の蛍光粒子（例えば、符号３_２に示す蛍光粒子）の両方をカウントするのではなく、いずれか一方のみをカウントするようにすると良い。そのようにした場合には、重複カウントを低減して、計数精度を高めることができる。

ところで、図７(a)(b)に示す領域Ｋ_２，Ｋ_３においては、上流側の辺２３，２５が前記流出路Ｄを横切る直線で、下流側の縁２４，２６が該下流側に突出した曲線であって、該領域Ｋ_２，Ｋ_３は、弾丸のような形状（別の表現をすれば、野球のホームベースのような形状）である。上流側の縁２３，２５を直線にした場合には、該縁２３，２５を通過する瞬間の蛍光粒子のカウントが容易であって好ましい。ただし、領域幅ｗ_２０，ｗ_２１についての上記式を満足するならば、該上流側の縁を直線ではなく曲線にしても良い。

図１は、本発明に係るマイクロチップ及び蛍光粒子計数装置の構造の一例を示す模式図である。図２は、第４液の流入により蛍光粒子を整列させる様子を示す模式図である。図３(a)は、蛍光粒子を計数する方法を説明するための模式図であり、図３ (b)は、同図(a)のゲート２０に沿った蛍光強度分布を示す波形図である。図４は、白血球計数装置の従来構造の一例を示すブロック図である。図５は、２種以上の液体を混和させる装置の従来構造の一例を示す模式図である。図６は、蛍光粒子を計数する別の方法を説明するための模式図である。図７は、蛍光粒子を計数するさらに別の方法を説明するための模式図である。

符号の説明

４接続部（アダプタ）
１０光源
１１蛍光測定手段
１４サンプリング手段
１５カウント手段
Ａマイクロチップ
Ｂ１第１流入路
Ｂ２第２流入路
Ｂ３第３流入路
Ｂ４第４流入路
Ｃ混和部
Ｄ流出路
Ｅ蛍光粒子計数部
Ｌ１第１液
Ｌ２第２液
Ｌ４第４液

Claims

計数対象である粒子を含む第１液が流入される第１流入路、蛍光色素を含む第２液が流入される第２流入路、これらの流入路に連通されると共に略ジグザグ状に湾曲するように構成されていてこれらの流入路から流入された前記第１液及び前記第２液を混和して蛍光粒子を生成する混和部、該混和部に連通するように配置されて前記混和された液が流出される流出路、及び、前記混和部の下流側であって前記流出路の上流側に設けられてなる第４液を供給して前記蛍光粒子を整列させるための第４流入路、からなるマイクロチップと、
前記流出路に送り出された蛍光粒子を計数する蛍光粒子計数部と、
を設けて構成した蛍光粒子計数装置。
前記第１液及び前記第２液を希釈するための希釈液を前記混和部の上流側に供給するための第３流入路、
を設けて構成した請求項１に記載の蛍光粒子計数装置。
前記蛍光粒子計数部は、前記流出路の蛍光粒子に励起光を照射する光源と、該励起光の前記蛍光粒子への照射により発生した蛍光を捕捉する蛍光測定手段と、により構成された、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光粒子計数装置。
前記第１流入路は、白血球を含む第１液が流入される流入路であり、
前記第２流入路は、前記白血球の細胞膜を溶解するための界面活性剤及び前記白血球を蛍光染色するための蛍光色素を含む第２液が流入される流入路である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか1項に記載の蛍光粒子計数装置。
前記第１流入路は、採血装置や血液バッグが装着可能な接続部を有する、
ことを特徴とする請求項４に記載の蛍光粒子計数装置。
前記蛍光測定手段の出力を一定時間毎に取得するサンプリング手段と、
前記サンプリング手段の出力に基づき蛍光粒子を計数するカウント手段と、
を設けて構成した請求項３乃至５のいずれか1項に記載の蛍光粒子計数装置。
前記蛍光測定手段は、静止画像を所定時間毎に順次取得するカメラである、
ことを特徴とする請求項３乃至６のいずれか１項に記載の蛍光粒子計数装置。
前記カウント手段による蛍光粒子の計数は、前記蛍光測定手段が取得した各静止画像における所定の蛍光分布測定領域に対して行い、
蛍光粒子が移動する方向における、前記所定の蛍光分布測定領域の幅ｗは、次式を満たす、

ことを特徴とする請求項７に記載の蛍光粒子計数装置。
前記流出路を流れる液体の流速が、該流出路の壁面近傍部から中央部にかけて変化する場合は、該壁面からｘだけ離れたところにおける前記蛍光分布測定領域の幅ｗ_ｘは、次式を満たす、

ことを特徴とする請求項８に記載の蛍光粒子計数装置。
前記蛍光分布測定領域における上流側の縁が前記流出路を横切る直線で、該領域における下流側の縁が該下流側に突出した曲線であって、該領域は、野球のホームベースのような形状である、
ことを特徴とする請求項９に記載の蛍光粒子計数装置。
前記カウント手段は、前記静止画像において、前記蛍光分布測定領域における上流側の縁を通過している瞬間の蛍光粒子、及び該蛍光分布測定領域における下流側の縁を通過している瞬間の蛍光粒子のいずれか一方のみをカウントし、他方をカウントしないように構成された、
ことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の蛍光粒子計数装置。