CN1678908A - 细胞分析分离装置 - Google Patents
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Abstract
细胞分析分离装置,其具有:将以层流导入的含有试料的流体导入试料分级部的流路;在其两侧以对称形式配置的1对只导入流体的流路;只当在试料分级部将观察试料排出时向试料分级部导入外力的装置;配置在导入上述试料的流路的下游的试料回收流路,用于将含有试料的流体流出,以层流只将从试料分级部选择的试料回收;在其两侧以对称形式配置的1对排出不必要的试料的流体的流路,其以试料的微细结构和试料中的荧光分布为基础对试料进行分级,对回收的试料不产生损伤。
Description
技术领域
本发明申请涉及在不对细胞试料产生损伤的情况下,能够简便地进行细胞的分析分离的新型细胞分析分离装置。
背景技术
将培养液中的特定的细胞分离、回收在生物学、医学分析上是重要的技术。当因细胞的比重不同而分离细胞时,可以采用速度沉降法进行分离。但是,当如辨别未致敏细胞和致敏细胞这样,细胞几乎无差异时,必须以用荧光抗体染色的信息或目视的信息为基础将细胞一个个地分离。对于该技术,例如包括细胞分类器(cell sorter)。细胞分类器是通过将荧光染色处理后的细胞以1细胞单位分离滴入具有电荷的液滴中,以该液滴中的细胞有无荧光、光散射量的大小为基础,在液滴下落的过程中在相对于下落方向的法平面方向上以任意方向外加高电场,从而控制液滴的下落方向,分级到置于下部的多个容器中进行回收的技术。对于该技术,Kamarck,M.E.在Methods Enzymol.第151卷第150页~165页(1987年)中报告。
但是,该技术存在价格高,装置大型,需要数千伏的高电场,大量需要试料,在制作液滴的阶段有可能损伤细胞,不能直接观察试料等问题,因此近年来,发明了细胞分类器,其边直接对使用微加工技术制作的微细流路中形成的层流中流动的微粒进行显微镜观察边进行分级,例如,在Micro Total Analysis’98,pp.77-80(KluwerAcademic Publishers,1998)或Analytical Chemistry.70,pp.1909-1915(1998)等中有报告,但相对于观察装置试料分离的应答速度慢,为了实用化,需要不对试料产生损伤并且应答更快的处理方法。此外,本申请的发明者们也进行了解决以往问题的尝试。
发明者们所进行的尝试是要利用荧光观察进行分离,与以往方法相比具有突出的优点,但实际情况是对于光学计测装置、试料的导入装置、分离方法等尚未进行详细的研究。因此,例如,只进行荧光观察就可以识别发出荧光的试料,但不能认识不发出荧光的试料通过,当只回收荧光标识的试料时,有可能错误地将没有发出荧光的试料回收。
因此,本发明申请的课题在于消除以上所述的目前为止存在的问题,提供新型细胞分析分离装置,其以试料的微细结构和试料中的荧光分布为基础将试料分级,在不对回收的试料产生损伤的情况下可以简便地对细胞试料进行分析分离。
发明内容
作为解决上述课题的发明,本发明申请第1,提供细胞分析分离装置,其具有:将以层流导入的含有试料的流体导入试料分级部的流路;在其两侧对称配置的将在试料分级部合流的1对流体导入的流路;只当在试料分级部将观察试料排出时向试料分级部导入外力的装置;配置在导入上述试料的流路的下游的试料回收流路,用于将从试料分级部选择的含有试料的流体以层流流出;在其两侧对称配置的排出不必要试料的1对流体的流路,这样不会对回收的细胞试料产生损伤。
此外,本发明申请第2,为了以试料的微细结构和试料中的荧光分布为基础将试料分级,具有如下装置:在用光学显微镜观察装置中的试料时,能够参照相互的位置关系同时应对至少1个实体显微镜像和1个荧光显微镜像,第3,为了提供在不使用泵等仪器的情况下的装置内产生没有发生脉动的流速慢的流动的装置,具有利用流体的流速,利用导入装置的液滴的高度差、重力产生的流动的装置。
附图说明
图1为表示本发明的细胞分析分离装置的系统构成的1例的模式图。
图2为表示本发明的细胞分析分离装置的光学系统的构成的1例的模式图。
图3为表示本发明的细胞分析分离装置的试料分离部的构成的1例的模式图。
图4为表示本发明的细胞分析分离装置的试料分离部的构成的1例的模式图。
图5为本发明的细胞分析分离芯片的实施例的1个的截面图。
图6说明本发明的细胞分析分离顺序。
图7为使用本发明的细胞分析分离装置进行细胞分离的1例的显微镜照片。
图中的符号表示如下内容。
100:细胞分析分离芯片
101、108:光源
102、109、112、114、231、232、233:带通滤光器
103:集光透镜
104:平台
105、504:物镜
106、110、211、212、262、263:分色镜
111、213、261:镜
113、115、272:照相机
116:图像处理解析部
117:驱动装置
200、201、202、203、506:光的行进方向
221、222、223:狭缝
241、242、243:减光滤光器
251、252、253:光闸(Shutter)
271:透镜
301、302、303、304、305、306、401、402、403、404、405、406:流路
311、411:试料
321、322:超声波源
421、422、423、424:电极
501、503:芯片截面
502:液层
505:流体的流
507:密封
508:针
509:芯片开口部端
510:试料液
具体实施方式
本发明申请具有如上所述的特征,以下对其实施方式进行说明。
图1模式地表示本发明申请的细胞分析分离装置的系统构成的1例。101为实体显微镜的光源,一般使用卤素系的灯。102为只使位相差等实体显微镜观察的光源的光中特定波长的光透过的带通滤光器。103为集光透镜,当进行位相差观察时,导入位相差环,当进行微分干涉观察时,导入偏振器。在104的平台上放置的是100细胞分析分离芯片,通过117的驱动装置使上述平台移动,从而对上述芯片的最佳位置进行观察。上述芯片内的流路内的状态用105物镜进行观察。此时从物镜观察的是从光源101透过的光产生的流路内试料的实体像和、来自108光源的光在109带通滤光器中只有激发光波长的光,通过106分色镜从物镜照射的激发光使试料产生的荧光像。此时,优选用于实体显微镜像观察的光的波长为比观察的荧光波长范围足够短或足够长的波长,并且如果可能,与激发光波长范围不同。通过反射与透过上述102带通滤光器的光同波长的光的110分色镜、和112带通滤光器,用113照相机只观察到流路内的实体显微镜像。另一方面,荧光像通过111镜和114带通滤光器在通过物镜的光中只选择性地透过荧光观察的波长带,用115照相机进行观察。用2个照相机113和115拍摄的像在116图像处理部被解析,通过比较2个像的相对位置关系,可以比较鉴定试料的微细结构和荧光的发光位置。在该实施例中,对1个波长带域的实体像和1个波长带域的荧光像进行观察并比较解析,同样地,可以比较2个以上的波长带域的实体像,也可以比较解析2个以上的荧光像。此外,为此可以在光路中与上述实施例同样地进一步配置1个以上的分色镜和光源、或照相机观测系统。
图2为表示进一步使用1个观测照相机的受光面同时计测多个不同波长的像,本发明申请的细胞分析分离装置的光学体系的构成的1例的模式图。多个分色镜211、212和213镜配置在含有从物镜送来的不同波长的光201、202、203的200光的行进方向上。对通过配置在处于各自相同的光路长的位置的合焦点面上的狭缝221、222、223观察以各自的波长分离的光的视野范围进行选择。然后,通过带通滤光器231、232、233和减光滤光器241、242、243调整具有同程度的强度且要观察的特定波长的光。然后,当想要对特定波长的光进行遮光时,可以通过光闸251、252、253进行遮挡。通过该光闸的光再次通过261镜和分色镜262、263后,通过271透镜结像于272照相机的受光面。这里,各镜261、262、263为可动,可以任意选择在照相机的受光面的哪个区域结像。这里,在以上的实施例中,叙述了3个不同波长的光的分析手法,同样对于4个以上不同波长的光也可以使用。此外,如该实施例所示,通过使用1个照相机的受光面,没有必要准备多个高价的高灵敏度照相机。此外,如高速照相机那样,当多个照相机的同期难时,通过只对在1个受光面获得的数据进行解析,可以同时解析实态显微镜像和荧光显微镜像等多个在不同波长下的图像。
图3为表示本发明的细胞分析分离装置的试料分级部的构成的1例的模式图。302为含有试料的流体流入试料分级部的流路,流路301和303为没有含试料的流体流入试料分级部的流路,321、322为用于对3个流路合流的试料分级部照射超声波,使超声波产生的外力作用于上述试料分级部内的试料311的超声波源。从流路301、302、303导入的流体无脉动,调整为流速一致,因此在试料分级部保持层流,从流路302导入试料分级部的试料311只要不受外力,向流路305行进。相反,当作用超声波产生的外力时,废弃到流路304或流路305。此时,导入试料的流路302和回收试料的流路305相对于流动的方向配置在一直线上,以关于该流路的轴对称的形式,配置1对只将流体导入试料分级部的流路301和303,同样地,以相对于流路305轴对称的形式配置将不要的试料废弃的1对的流路304和306。这里,至少相对于流路301和303的流的截面积相等,而且相对于流路304和306的流的截面积相等。
图4为与图3同样地表示试料分级部的构成的1例的模式图。这里,列示了对代替超声波而使用静电力对试料施加外力的诱导手法的实施例。含有从流路402导入的试料411的流体同样导入试料分级部,以采用光学计测手法得到的计测结果为基础判断是回收还是废弃。回收的情况下,没有加入外力而直接使其在流路405上行进,进行回收。此外,废弃的情况下,对于电极421和电极422外加电场,将试料诱导到流路404或406。此时,电极423和424被接地以成为参照电极。一般地,在水溶液中物质在与其水溶液的界面处保持Z(ゼ-タ)电位,具有来自其的电荷。因此,通过使电场作用,可以对废弃的试料施加外力。特别在该场合下,也可以使用具有正电荷和具有负电荷的物质各自分离到流路404或406中。此外,当气泡等混在试料中而导入时,由于气泡不具有表面电荷,因此虽然不受电场产生的作用,但常常在光学上与核蛋白体等识别困难。但是,通过使用该手法,也可以识别气泡和试料微粒。
图5为本发明申请的细胞分析分离芯片的实施例的1个截面图。501、503为芯片截面,均对于进行观察的波长的光有足够的透过性。为了维持结构,上述501的厚度可以为mm量级的厚度,对于与物镜504连接,对液层502中的流体的流505进行观察的芯片截面503,根据物镜的倍率,限制最大厚度。例如,当将开口数1.35、100倍的物镜用于物镜504时,优选使截面的厚度为0.2mm以下。试料液的导入部和回收部的芯片开口部端509进行防水处理,进行处理以使开口部的液体不扩散。在试料导入部载置试料液510,用针508刺密封507,使密封破裂,以对应于试料液510的液面的高度的流速使试料液开始流动。此时,通过严密地控制试料液的量,可以作出流速得以严密控制的无脉动的流。此外,在该手法中,不必特别使用泵等装置。
图6说明本发明申请的细胞分析分离顺序。与前面的实施例中所述那样,对导入流路的试料进行显微镜观察,选择分级回收的试料和废弃的试料。然后,对于回收的试料,不使外力作用而直接进行到回收流路中进行回收。此时,试料在层流中行进,由于没有外加一切外力,因此认为可以尽可能无损伤的试料回收。其次,当废弃时,由于对细胞产生损伤并不特别成为问题,因此可以使任意的外力作用于试料进行排除。
图7为使用本发明申请的细胞分析分离装置对实际上具有不同的荧光的试料进行图像解析、分离的例子的显微镜照片。各个流路的尺寸,作为其截面,为宽20μm×高(深)20μm,各个的流量比为1∶1∶1。此外,细胞的种类为马红血球,使用生理用食盐水(0.9%NaCl、pH7.4)作为流体。此外,使用电场(介电电泳动力)作为外力。在照片1到4中,表示将以发红色荧光的大小3微米的细胞回收的过程。同样地,在照片5到8中,表示将以发绿色荧光的大小3微米的细胞废弃的过程。
如以上详述的那样,根据本发明申请,可以以不受损伤的形式,识别微小的试料,进行分级回收。
Claims (3)
1.细胞分析分离装置,其特征在于具有:将以层流导入的含有试料的流体导入试料分级部的流路;在其两侧对称配置的1对导入在试料分级部合流的流体的流路;只当在试料分级部将观察试料排出时向试料分级部导入外力的装置;配置在导入上述试料的流路的下游的试料回收流路,其是用于将从试料分级部选择的含有试料的流体以层流流出;在其两侧对称配置的1对排出不必要试料的流体的流路。
2.权利要求1所述的细胞分析分离装置,其特征在于,具有如下装置:在用光学显微镜观察试料时,能够参照相互的位置关系同时应对至少1个实体显微镜像和1个荧光显微镜像。
3.权利要求1所述的细胞分析分离装置,其特征在于,具有利用流体的流速,利用由导入的液滴的高度差、重力产生的流动的装置。
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