CN101622339B - 具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪以及活细胞分级分离处理方法 - Google Patents

Abstract

一种具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪和活细胞分级分离处理方法，其中，朝向含有活细胞群的样品液流照射测量用激光，接受测量用激光的照射，分别获取由样品液流的各个活细胞分别所发出的散射光和荧光中的至少一种光信息，根据所获取的光信息，分别判别出与各个光信息相对应的活细胞是不需要的活细胞还是目标活细胞，根据判别结果，仅对在样品液的活细胞群中被判别为不需要的活细胞的活细胞施加脉冲电压，使不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。

Description

具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪以及活细胞分级分离处理方法

技术领域

本发明涉及对混合有多个不需要的活细胞和多个目标活细胞的活细胞群中的特定活细胞进行处理的流式细胞仪、以及从上述活细胞群中分级分离出目标活细胞并对其进行回收的活细胞分级分离处理方法。 

背景技术

例如，在研究例如癌等对细胞或染色体进行分析时，以往使用的是显微镜。但是，在利用显微镜进行分析时，收集大量数据以进行统计性研究需要较多的劳力和时间。目前，大多情况下，进行细胞或染色体分析时，使用能够在短时间内对很多样品(细胞或染色体)进行分析以获得可靠性较高的统计数据的流式细胞仪。在流式细胞仪中，形成样品液流，即形成含有抗体已被荧光染色的细胞等样品粒子的样品液的流动，并将激光朝向该样品液照射，然后对从流动的大量样品粒子的每一个样品粒子中放出的荧光和散射光进行测量，由此能够获得可靠性高的统计数据。这样的流式细胞仪被广泛应用在医学领域中的研究。 

然而，在今后的医疗领域中抱有较大期望的是：利用被称为再生细胞的干细胞(stem cell)来进行治疗。干细胞是指构成活体的细胞在进行生理性增殖和分化等过程中，同时具有自我增殖能力和分化成具有特定功能的细胞的能力的细胞。即，干细胞是自身就具有自我复制能力和发育成其它细胞的能力的细胞。干细胞包括从胚胎中提取的胚胎干细胞(ES细胞)、从成人身体提取的成体干细胞、从胎儿身体提取的胎儿干细胞等各种类型。若能够使该干细胞分化为因受伤或疾病而受损的器官等细胞，则可通过移植来进行修复，因此利用干细胞的研究在再生医疗领域等中盛行。 

从胚胎干细胞或胎儿干细胞等提取干细胞时，理论上存在必须破坏胚胎(杀死胚胎)的问题。因此，有关现代再生医疗的研究大部分涉及的是能够从 活着的人(儿童或成人)身上以不损伤其身体的方式提取干细胞的成体干细胞研究。在成体干细胞的研究中，理所当然地需要成体细胞。成体干细胞虽然是能够在骨髓、血液、眼角膜和视网膜、肝脏、皮肤等中找到的细胞，但很少能找到，通常来讲，在提取的大量细胞样品中只能找到极微量的成体干细胞。例如，在骨髓间质中存在能够分化成骨骼、软骨、脂肪、肌肉、腱、神经等很多组织的、被称为间叶系干细胞的细胞，其在针对疾病或外伤引起的组织缺损的再生医疗方面备受瞩目。但是该细胞在骨髓中仅以10万分之1的比例存在。因此为了使缺损组织再生，需要在体外进行培养而增加细胞。为此必须从该骨髓中的多个细胞中分离和提取出极微量的干细胞。为了尽量在短时间内从大量的细胞样品中分离和提取出极微量的成体干细胞，目前所利用的是使用了上述流式细胞仪的、对细胞进行分离和回收的系统(细胞分选器)。 

例如，在下述非专利文献1中记载有与这样的细胞分选器相关的一个例子。图4为对下述非专利文献1所记载的细胞分选器100进行说明的概略构成图。在细胞分选器100中，从喷嘴103中射出作为喷射流104的、含有大量细胞样品102的样品液。在这些大量细胞样品102中含有少量的干细胞，且在大量细胞样品102中实施荧光标记以表征这样的干细胞。细胞分选器100中，将测量用激光106照射在该喷射流104上，以将激光106依次照射在大量细胞样品102上。并且，通过包括光电增倍管108和光电增倍管110的、未图示的评价单元来获得由每个细胞样品102所发出的各种散射光和荧光的信息。而且在未图示的评价单元中，判别出照射了激光106的细胞样品是否为干细胞样品(另外，在下述非专利文献1中，对含有很多干细胞的样品细胞的集团部分进行特定)。至此，虽然其为通常的流式细胞仪的构成，但在细胞分选器100中具有对特定了的细胞进行分离(分选)的功能。在细胞分离器100中，例如通过未图示的压电元件等使喷嘴103在高频下发生振动，由此使喷射流104强制性地变成液滴112。当形成该液滴112时，干细胞样品等特定细胞样品进入液滴的瞬间，对该特定液滴施加正(+)电荷或负(-)电荷(图示例中为正电荷)(充电)。 

液滴112依次通过由两个电场形成电极板114、116来形成的、水平方向上的电场118之间。此时，只有被充电了的液滴112才会通过该水平方向 上的电场来改变下降方向(偏转)而落下来，并回收在所需试管120中。由此，只有干细胞样品等特定细胞样品102才回收在试管120中。而没被充电的其它细胞样品102垂直落下并回收在废液容器122中。 

非专利文献1：“利用超高速细胞分选器MoFloTM的干细胞的新分析和新分离方法”，[在线]，[平成19年2月19日检索]，互联网<URL：http://www.takarabio.co.jp/goods/bioview/pdfs/42/42_15-16.pdf> 

发明内容

然而，如上述非专利文献1所述，为了使样品液成为喷射流，必须显著变小喷嘴出口部分的直径，例如设定为25μm。在上述非专利文献1的例子中，直径为几μm～20μm程度的细胞由于通过该狭窄的出口部分时受到物理剪切力，因此连所需的干细胞也受到损伤的可能性高。此外，干细胞也可能通过强制成为液滴时的高频振动而受到损伤。此外，向含有细胞样品的液滴充电且施加高电场的情况下，连干细胞等所需细胞也受到电击，从而存在连该所需细胞也受到损伤的问题。即使利用这样的细胞分选器分离出干细胞样品，以使其分化成所需器官等的细胞，若所分离出的干细胞样品受到损伤，则也无法完全排除发生多种且危险问题的可能性，例如不能良好地进行分化或者表现为不良细胞(例如癌细胞)等。因此，不能使细胞受到损伤的、需慎重处理的研究领域中，依然无法使用这样的高速细胞分选器。 

这样，在细胞处理方面需慎重处理的领域中，过去是按照例如在规定时刻移动上述细胞分选器100的试管120的方式对包含在液滴112进行下降的特定细胞样品进行分离和回收的。但是，试管120自身的移动速度与喷射流104被液滴化后所形成的液滴112的下降速度相比，只能达到明显低的速度。在高速流动大量样品的情况下，相对于大量的细胞样品只能获得极少量的特定细胞样品。另外，根据试管120的移动速度而显著降低样品流的速度时，细胞的分离和提取需要较长时间。 

本发明着眼于上述以往的问题点，其目的在于：提供一种具有活细胞分级分离功能的流式细胞仪，其使目标活细胞不受到任何损伤，能够从含有大量活细胞的活细胞群中短时间内且高精度地分级分离出不需要的活细胞并进行处理。此外，其目的在于：提供一种活细胞分级分离处理方法，通过该 方法，能够从含有大量活细胞的活细胞群中仅分级分离出目标活细胞并对其进行回收。此外，其目的在于：提供一种活细胞分级分离处理方法，通过该方法，能够从含有大量活细胞的活细胞群中仅分级分离出目标活细胞并对其进行培养。 

为了解决所述问题，本发明提供一种活细胞分级分离处理方法，其特征在于，包括：形成样品液流的步骤，所述样品液流中含有由多个不需要的活细胞和多个目标活细胞混合而形成的活细胞群，且所述活细胞群的各个活细胞分别相互隔开而在一条直线上流动；朝向所述样品液流照射测量光的步骤；接受所述测量光的照射，并分别获取由所述样品液流的各个活细胞分别所发出的散射光和荧光中的至少一种光信息的步骤；根据通过所述获取步骤而获得的光信息，分别判别出与各个光信息相对应的所述活细胞是所述不需要的活细胞还是所述目标活细胞的步骤；根据所述判别步骤中的判别结果，使脉冲电场发生在与所述样品液流中所述不需要的活细胞相对应的部分，由此使所述不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞的步骤。 

此时，在变为所述死细胞的步骤中，优选使脉冲电场作用于所述不需要的活细胞上，由此使所述不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞的方式。而且，此时，在变为所述死细胞的步骤中，作用于所述不需要的活细胞的脉冲电场的脉冲宽度优选按照下述方式设定：电场施加于所述不需要的活细胞的细胞核，并使所述细胞核内部的DNA受到损伤。此时，所述脉冲宽度优选比1.0×10^-6秒短的脉冲宽度。 

此时，在变为所述死细胞的步骤中，优选下述方式：使脉冲电场作用于所述不需要的活细胞，并在所述不需要的活细胞内产生脉冲电流，通过由所述脉冲电流产生的焦耳热，在所述不需要的活细胞上诱发细胞凋亡。 

此外，在变为所述死细胞的步骤中，作用于所述不需要的活细胞的脉冲电场的脉冲宽度和峰值电压优选按照下述方式设定：施加在所述不需要的活细胞细胞膜的电场大于施加在所述不需要的活细胞细胞核的电场，且所述细胞膜不可逆地被破坏。此时，所述脉冲宽度优选与1.0×10^-6秒相等或比1.0×10^-6秒长的脉冲宽度。优选施加在所述不需要的活细胞细胞膜上的电场为1kV/cm以上，且所述峰值电压为10V以上。 

另外，优选还包括：将含有因所述脉冲电压的施加而受到损伤的所述死细胞和所述目标细胞的、被施加了所述脉冲电压后的所述样品液回收在回收容器内的步骤；在所述样品液中，将附着在所述回收容器内壁面上的细胞作为所述目标活细胞来回收，且将没有附着在所述回收容器的内壁面上而是浮游在所述样品液上的细胞作为所述死细胞来进行分级分离并回收的步骤。 

另外，优选还包括：将含有因所述脉冲电压的施加而受到损伤的所述死细胞和所述目标细胞的、被施加了所述脉冲电压后的所述样品液回收在回收容器内的步骤；通过对所述回收容器中的所述样品液实施可培养出活细胞的培养处理，且仅培养出所述样品液中的所述目标活细胞，使所述样品液中的所述死细胞的比例减少的步骤。 

此外，本发明提供一种具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪，其特征在于，包括：流动池，样品液在其内部流动，其中所述样品液含有由多个不需要的活细胞和目标活细胞混合而形成的活细胞群；电场发生部，在所述流动池内的特定区域产生脉冲电场；测量光照射部，朝向所述流动池内的所述样品液流照射测量光；光信息获取部，接受所述测量光的照射，并分别获取由所述样品液流的各个活细胞分别所发出的散射光和荧光中的至少一种光信息；活细胞判别部，根据通过所述光信息获取部而获得的光信息，分别判别出与各个光信息相对应的所述活细胞是所述不需要的活细胞还是所述目标活细胞；控制部，根据上述所述活细胞判别部中的判别结果，通过上述所述电场发生部来控制上述所述脉冲电场的发生时间；其中，上述所述控制部在上述所述不需要的活细胞经过上述所述流动池内的上述所述特定区域的时刻，通过上述所述电场发生部在所述特定区域产生所述电场，使所述不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。 

此时，所述电场发生部优选包括：两个电极，其按照夹着所述流动池的特定区域的方式布置；脉冲电压施加部，其在所述两个电极之间施加脉冲电压。 

本发明的具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪，能够使作为目标的活细胞不受到任何损伤，且从含有大量活细胞的细胞群中短时间内且高精度地分级分离出不需要的活细胞，并使该不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。此外，本发明的活细胞分级分离处理方法，能够使作为目标的活细胞不受到任何损伤，且从含有大量活细胞的细胞群中短时间内且高精度地分级分离出目标活细胞并对其进行回收。此外，本发明的活细胞分级分离处理方法，能够使作为目标的活细胞不受到任何损伤，且从含有大量活细胞的细胞群中短时间内且高精度地分级分离出目标活细胞并对其进行培养。 

附图说明

图1为对本发明的具有细胞分离分级处理功能的流式细胞仪中的一例进行说明的概略立体图； 

图2为表示对图1所示的流式细胞仪的光学单元和电压施加单元的结构及动作进行更详细说明的概略侧视图； 

图3(a)和图3(b)为表示对设置在图1中的流式细胞仪的流动池上的电极和其附近部分进行放大的概略侧视图； 

图4为对作为现有的具有细胞分级分离功能的流式细胞仪的一例的细胞分选器进行说明的概略构成图。 

符号说明 

10流式细胞仪 

11活细胞群 

12分析样品 

12a干细胞 

12b不需要的活细胞 

13死细胞 

15鞘流 

17样品液流 

20液流形成单元 

22液体供给装置 

25分析样品液槽 

27鞘液槽 

32流动池 

34外部管道 

36样品液流管 

40  光学单元 

42  测量激光照射部 

44、46  受光部 

50  分析单元 

52  数据获取部 

54  数据处理和判别部 

60  电压施加单元 

62  脉冲电压发生器 

64a、64b  电极 

70  控制装置 

72  供电时间控制部 

82  细胞膜 

84  细胞质 

86  核膜 

88  细胞核 

100  细胞分选器 

102  细胞样品 

103  喷嘴 

104  喷射流 

106  激光 

108、110  光电增倍管 

112  液滴 

114、116  电场形成电极板 

120  试管 

具体实施方式

以下，基于附图所示的优选实施例对本发明的具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪以及细胞分级分离处理方法进行详细说明。图1是对作为本发明的具有细胞分离分级处理功能的流式细胞仪的一例的流式细胞仪10进行说明的概略立体图。 

流式细胞仪10包括：液流形成单元20、光学单元40、分析单元50、电压施加单元60、控制各部动作顺序的控制装置70、回收容器80。流式细胞仪10是按照下述方式构成的装置：在大量不需要的活细胞(干细胞之外的细胞)中，对仅含有少量作为目标活细胞的干细胞的活细胞群中的每个细胞进行其是否为干细胞的判别，且仅对判别为不是干细胞(即，不需要的活细胞)的活细胞施加脉冲电压以使不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。流式细胞仪10还包括用于对施加了脉冲电压之后的、含有死细胞和干细胞的样品液进行回收的回收容器80，且具有如下功能：其将没有附着在回收容器80的内壁面而是浮游在样品液上的细胞作为死细胞来进行分级分离并将其进行回收；通过对回收容器80中的样品液实施可培养出活细胞的培养处理，且仅分级分离出样品液中的干细胞并进行培养，由此减少样品液中死细胞的比例。 

流式细胞仪10是例如从下述活细胞群中，即在由人的骨髓中提取的活细胞群等的大量活细胞中比例虽然为极小但含有干细胞(含有的可能性高)的活细胞群中分级分离出干细胞的、具有所谓分选功能的装置(分选系统)。在本实施方式中，如此通过使用流式细胞仪10例如从下述活细胞群中，即在由人的骨髓中提取的活细胞群等的大量活细胞中比例虽然为极小但含有干细胞(含有的可能性高)的活细胞群中分级分离出干细胞以实施各种处理。另外，本发明中的目标活细胞并不限定在干细胞。 

如上所述，人的骨髓中被称为间叶系干细胞的细胞仅以十万分之一的比例存在。在利用流式细胞仪10来进行的细胞分级分离处理中，通过预先对这样的活细胞群利用荧光色素实施均匀的染色处理(荧光标签)来赋予能够识别出干细胞与其他不需要的活细胞的特点。干细胞在所谓的MDR(Multi Drug Resistance)作用下具有将获取到细胞内的色素排出的性质。在特定条件下通过使用特定的荧光色素对活细胞群进行染色处理时，通过该MDR的功能使得干细胞处在几乎无法染色(排出色素)的状态。在流式细胞仪10所进行的细胞分级分离处理中，如此使用根据细胞中的荧光色素的不同的染色状态而赋予能够识别出干细胞12a与其他不需要的活细胞12b特点的活细胞群11。将活细胞群11导入流式细胞仪10的时刻，理所当然地不清楚活细胞群11中的每个细胞是干细胞12a还是不需要的活细胞12b。本说明书中，将干细胞12a和不需要的活细胞12b(特别是，在不知其是干细胞还是不需要的细胞的状态中)均以分析样品12来记载。 另外，在本实施方式中，是通过干细胞所具有的MDR功能赋予了可识别出干细胞与其他不需要的活细胞的特点，但在本发明中，对通过荧光色素赋予可识别出目标细胞和其他不需要的活细胞的特点的方式并没有特别的限定。 

液流形成单元20包括液体供给装置22和流管部30。液体供给装置22和流管部30是通过配管24来连接的。在液体供给装置22内包括蓄留分析样品液的分析样品液槽25和蓄留鞘液的鞘液槽27。流管部30包括：流动池32，样品液被鞘液包围而在其内部流动；外部管道34，其向流动池32供给鞘液且与流动池32相连；样品液流管36，其被设置在外部管道34的内部，向流动池32供给样品液。液体供给装置22的样品液槽25和鞘液槽27通过配管24分别与样品液流管36和外部管道34相连接，在流动池32的出口处设置有回收容器80。 

该液体供给装置22中每一个槽均包括未图示的气泵。在流式细胞仪10中，通过利用未图示的气泵向鞘液槽27内部加压来朝向外部管道34内部供给鞘液，从而形成在外部管道34和流动池32内从图1的上侧朝向下侧流动的鞘流15(参照图2)。另外，通过利用未图示的气泵向样品液槽25加压来朝向样品液流管36内部供给样品液，并将样品液从位于样品液流管36的图中下侧的开口端的排出口38朝向鞘流15排出。 

在流动池32中，样品液形成下述样品液流17：在被排出到鞘流15的阶段发生流体力学性聚焦，被鞘流15包围的样品液的流动变得非常细，且每个分析样品12沿流动方向相间隔而排成一列。在本实施方式的流式细胞仪10中，液体供给装置22等的动作(气泵的压力等)按照样品液流等分析样品12分别以大致均等且按规定间隔(例如10μm)流动的方式进行调整。即，在流动池32中，分析样品12呈一列并逐一地按照规定速度Vm/秒依次通过流动池32。在该流动池32中，分析样品12通过光学单元40的测量激光照射部42被照射激光，且以横切该激光的方式逐一地依次通过流动池。 

光学单元40包括：测量激光照射部42，其朝向流动池32照射测量用激光；受光部44，接受通过流动池32(包含在样品液流17中流动)的分析样品12所发出的散射光，并输出与接受的散射光相对应的信号；受光部46，接受通过流动池32的分析样品12所发出的荧光，并输出与接受的荧光相对应的信号。受光部44、46分别与分析单元50相连接，输出的光信号被传输到分析单元50。 

图2为对光学单元40和电压施加单元60的构成和动作进行更详细说明的概略侧视图。测量激光照射部42包括：测量激光照射部42，其朝向通过流动池32的样品液流17射出特定波长的激光；激光整形和调整部64，其由透镜等构成，对从测量激光照射部42所射出的测量用激光进行整形并将其导入流动池32内的样品液流17上。测量激光照射部42与未图示的激光电源连接并在控制装置70的控制下，朝向通过流动池32内的、分析样品12排成一列的样品液流17连续射出测量用激光。从测量激光照射部42所射出的测量用激光是使附着在分析样品12上(特别是被不需要的活细胞12b吸收而附着)的荧光色素得到激发而产生特定波长范围的荧光的、特定波长的激光。作为测量激光照射部42可以使用固体激光器或半导体激光器等公知的激光装置。 

受光部44按照夹着流动池32且与测量激光照射部42相对而置的方式进行布置，连续接受基于通过流动池32的分析样品12的激光的前向散射光，并输出与所接受的前向散射光的强度相对应的模拟电信号。另一方面，受光部46相对于测量激光照射部42所射出的激光的射出方向呈垂直且相对于流管部30中的分析样品12的移动方向呈垂直地布置，由此接受由分析样品12接受激光后所发出的荧光，并输出与接受的荧光强度相对应的模拟电信号。在受光部44和受光部46中的光检测和模拟电信号的输出中，例如可以使用PMT(photomultiplier tube)。 

分析单元50包括数据获取部52和数据处理和判别部54。数据获取部52收到由受光部44和受光部46所输出的模拟信号后将该模拟信号变换成AD，并以数字信号的方式输出。数据处理和判别部54处理由数据获取部52所输出的数据信息，例如导出表示各个分析样品12的染色状态(活细胞中的荧光色素量的程度)的信息(染色量信息)。数据处理和判别部54还根据该染色量信息判别出对应于染色量信息的分析样品12是不需要的活细胞还是干细胞。在本实施方式中，如上所述，由于干细胞12a与不需要的活细胞12b相比其染色状态(活细胞中的荧光色素量的程度)较低，因此将与表示染色状态较低的染色量信息(例如，表示染色量的值在规定的阈值以下)相对应的分析样品12判别为干细胞12a。 

数据处理和判别部54将判别结果发送到控制装置70的供电时间控制部72(时间控制部72)上。另外，分析单元50与显示器或打印机等的未图示的输出 装置相连，可以显示和输出数据处理和判别部54中的分析结果。另外，在本实施方式中，通过从光信息导出细胞的染色状态程度，由此判别出其为干细胞还是不需要的活细胞，但对本发明中的活细胞进行判别时所使用的、目标活细胞和不需要的活细胞之间的判别标准并没有特别的限定。对本发明中的活细胞进行判别时所使用的、对所获得的荧光信息等光信息实施的处理内容和为了特定目标细胞而实施的算法等并没有特别的限定。 

电压施加单元60的构成包括：脉冲电压发生器62；电极64a和电极64b，它们分别以相对而置的方式被设置在流动池32的管壁上且分别与脉冲电压发生器62的输出端相连。脉冲电压发生器62在控制装置70的供电时间控制部72的控制下，在电极64a和电极64b之间施加脉冲电压。脉冲电压发生器62是能够以例如，1.0×10^-9秒～1.0×10^-6秒程度的脉冲宽度来输出脉冲电压的、公知的脉冲电压发生装置。 

电极64a和电极64b布置在从测量激光的照射位置A(参照图2)向样品液流17的流动方向的下游侧充分相隔开的位置(例如，相隔1.0mm以上的位置)上。例如，假设对应于电极64a和电极64b的中央部分的电极位置B(参照图2)与测量激光的照射位置A之间相隔开预先设定好的距离Dm，且样品液流17的速度即分析样品12的移动速度为Vm/秒，则一个分析样品12从接受测量激光照射的时刻开始经过T＝D/V秒后能够通过电极位置B。在分析单元50中，获得光信息之后至少在经过该T秒前判别出与所获取的光信息相对应的分析样品是不需要的活细胞还是干细胞，并将判别结果发送到供电时间控制部72。 

当供电时间控制部72从分析单元50的数据处理和判别部54处所收到的判别结果为，被测量激光照射的分析样品12为不需要的活细胞12b时，控制脉冲电压发生器62的动作使得脉冲电压施加在该不需要的活细胞12b上。相反地，当从分析单元50的数据处理和判别部54处所收到的判别结果为，被测量激光照射的分析样品12为干细胞12a时，控制脉冲电压发生器62的动作使得脉冲电压无法施加在干细胞12a上。 

具体来讲，当供电时间控制部72从分析单元50的数据处理和判别部54处所收到的判别结果为，被测量激光照射的分析样品12为不需要的活细胞12b时，在规定的时间范围(所对应的分析样品12可靠地通过后述的有效电场区域E的时间范围)内使电压施加在脉冲电压发生器62上(即，在电极64a和电极64b 之间施加脉冲电压)。此外，当供电时间控制部72从分析单元50的数据处理和判别部54处所收到的判别结果为，被测量激光照射的分析样品12为干细胞12a时，在规定的时间范围(所对应的分析样品12可靠地通过有效电场区域E的时间范围)内脉冲电压发生器62按照不施加脉冲电压的方式进行控制。 

对于上述规定的时间范围可以预先进行设定，例如，在供电时间控制部72中可以设定上述T＝D/V秒的信息或也可以设定后述的有效电场区域E(参照图3)的大小信息，当供电时间控制部72具有比较高的处理能力的情况等时，也可以按照如下方式对脉冲电压的施加进行控制。例如，供电时间控制部72从接收所发送过来的判别结果的时刻开始，加上分析单元50中各处理时间的影响，确定与该判别结果相对应的分析样品12(即，干细胞12a)通过测量激光的照射位置A的时间。另外，当供电时间控制部72收到其为干细胞12a的判别结果时，至少确定出从该确定的时刻到经过T＝D/V秒的时刻(即，上述相应的分析样品12通过电极位置B的时刻)。而且，根据有效电场区域E的大小可求出含有通过电极位置B时刻的规定的时间范围(所对应的一个分析样品12通过有效电场区域E的时间范围)。当供电时间控制部72收到其为干细胞12a的判别结果时，按照至少在该规定的时间范围(所对应的分析样品12可靠地通过后述的有效电场区域E的时间范围)之内脉冲电压发生器62不施加脉冲电压的方式进行控制。 

图3(a)和图3(b)是在流动池32内移动的不需要的活细胞12b所实施的脉冲电压的施加进行说明的图，且为对图2所示的流动池32的电极64a和64b附近进行放大的图。电极64a和64b被固定在流动池32的管壁上。电极64a和64b例如若接触到鞘流15的鞘液，则鞘液或样品液发生激烈的电解，有可能连流动池32内的所需活细胞(即，干细胞12a)也受到损伤，因此电极64a和64b不直接接触鞘液或样品液，而是通过绝缘物来进行接触。图3(a)和图3(b)中，电极64a和64b的一部分以嵌入在流动池32的管壁上的方式被固定，且在鞘液与电极64a、64b之间布置例如由石英等绝缘物构成的流动池32的管壁的一部分。 

在本实施方式中，如图3(a)所示，用来施加脉冲电压的电极呈所谓的偶极结构，且由相对而置的两个电极64a和64b来构成。若利用脉冲电压发生器62对电极64a和64b之间施加脉冲电压，则电极64a和64b之间产生电场。鞘流15的鞘液和样品液流17的样品液均具有导电性，且在流动池32内部产生电场。例如，如果为了使电极64a的电位更高、电极64b的电位更低，以1.0×10^-9秒～ 1.0×10^-6秒程度的脉冲宽度施加脉冲电压，则产生脉冲宽度为1.0×10^-9秒～1.0×10^-6秒左右且可用从电极64a到电极64b的电力线来表示的电场(脉冲电场)。 

例如，在图3(a)所示的偶极结构的电极之间施加有电场的情况下，在将活细胞变为死细胞方面具有足够强度的有效电场区域E按照以电极位置B为中心具有一定程度扩展的方式形成于流动池32内。有效电场区域E形成为非常小的区域，使得一个分析样品12在通过该有效电场区域E时，其他的分析样品12不存在于有效电场区域E内。例如，将分析样品12的移动速度，即样品液流17的流速设定为5.0m/秒、将一秒钟内通过的分析样品12的数量设定为5000个时，样品液流17中分析样品12之间的平均距离约为1.0×10^-3m。此时，通过调整电极64a和64b的大小、外加电场的大小，使得有效电场区域E的、沿样品液的流动方向扩展的距离充分小于1.0×10^-3m。另外，在本发明中，为了抑制有效电场区域E中沿样品液的流动方向的扩展，如图3(b)所示，也可以形成在用来施加脉冲电压的电极64a和64b的基础上再设置电场调整用电极66a和66b的、所谓的多电极结构。 

若非常大强度的脉冲电压作用在移动于流动池32内的不需要的活细胞上，则不需要的活细胞12b受到损伤而变成死细胞。通过脉冲电场作用在不需要的活细胞12b上(即，通过施加脉冲电压)，使不需要的活细胞变为死细胞的方式主要有两种。第一方式为：通过施加脉冲宽度为1.0×10^-6秒以上的、具有比较宽的脉冲宽度的脉冲电压，使电场集中在不需要的活细胞12b的细胞膜82上，并在该细胞膜82上产生无法修复的孔，由此使不需要的活细胞12b变为死细胞。如果在细胞膜82上产生无法修复的孔，则细胞质84向细胞外流出，不需要的活细胞12b被致死。另外，第二方式为：通过施加脉冲宽度比1.0×10^-6秒短的、具有比较窄的脉冲宽度的脉冲电压，使电场作用至不需要的活细胞12b的细胞核88上(换句话讲，使电场进入)，使细胞核88所含有的DNA(deoxyribonucleicacid)受到损伤，由此使不需要的活细胞12b变为死细胞。根据第二方式，例如会诱发在DNA上最初被程序化了的细胞凋亡，由此使不需要的活细胞12b变为死细胞。此时，由于非常大强度的脉冲电场作用在不需要的活细胞12b上，因此对应于脉冲电场的脉冲电流进入到不需要的活细胞12b内特别是进入到细胞核88内，通过脉冲电流所产生的焦耳热使DNA受到损伤，由此导致细胞凋 亡。 

作为一般细胞的不需要的活细胞12b和干细胞12a按照核与细胞质84被细胞膜82包围的方式构成，其中核以细胞核88被核膜86包围的方式构成。在细胞核88中存在含DNA的染色体。若将这样的不需要的活细胞12b用等效电路来表示，则细胞膜82和核膜86部分可以用电阻和电容器来表示，且电容器的介电常数较高。即，在这样的不需要的活细胞12b的等效电路中，细胞膜82和核膜88部分主要是起电容器的作用。若在这样的整个等效电路上所施加的脉冲宽度大(即，外加电压的频率低)，则电容器存储电荷且比较大的电压作用于等效电路中。另一方面，脉冲宽度越小(即，外加电压的频率高)电荷越不会存储在电容器内，且电压作用于整个等效电路上。不需要的活细胞12b的情况也与上述相同，若施加脉冲宽度为1.0×10^-6秒以上的、具有比较宽的脉冲宽度的脉冲电压，则如上述第一方式所述，电场集中在不需要的活细胞12b的细胞膜82上。相反地，若施加脉冲宽度比1.0×10^-6秒短的、具有比较窄的脉冲宽度的脉冲电压，则如上述第二方式所述，电场还作用到不需要的活细胞12b的细胞核88上(换句话讲，使电能进入)。 

在此，如第一方式所述，即使是将电场集中在细胞膜82上形成孔的情况下，若电场比较小，则细胞膜82通过自己所具有的自我修复功能，在短时间内修复所形成的孔。即，如第一方式所述，在细胞膜82上形成孔的情况下，若作用于细胞膜82上的电场比较小，则无法使不需要的细胞12b变为死细胞。如第一方式所述，当在细胞膜82形成孔以使不需要的细胞12b变为死细胞时，必须形成通过细胞的自我修复功能无法进行修复的孔。为了形成这样的孔，必须施加能够达到充分破坏细胞膜82组织的、非常强的电场。在本发明中，当施加脉冲宽度为1.0×10^-6秒以上的、具有比较宽的脉冲宽度的脉冲电压时，优选作用于细胞膜82的电场为1kV/cm以上的、足够强的电场。通常的流动池的直径为100～400μm，用来施加脉冲电压的电极间距离也可以是100～400μm，因此脉冲电压的峰值，例如优选为10V以上。另外，如果施加在样品液或鞘液的电场过强，则会引起冲击波，或者样品液或鞘液突然沸腾，流动池有可能被破坏掉。为了防止这种装置的损坏，脉冲电压的峰值优选为1000V以下。即，在本发明中，当施加脉冲宽度为1.0×10^-6秒以上的、具有比较宽的脉冲宽度的脉冲电压时，脉冲电压的峰值例如优选为10V以上且1000V以下。 

如上所述，在第二方式中，例如诱发在DNA上最初被程序化了的细胞凋亡，使不需要的活细胞12b变为死细胞。细胞凋亡是指构成多细胞生物体的细胞的一种死亡方式，是一种为了使个体更好地保持良好的状态而积极诱导的、受管理和调节的细胞的自杀方式。相对于该细胞凋亡，因基于血液循环不良、外伤等细胞内外的环境恶化而引起的细胞死亡被称为细胞坏死(necrosis)或坏死。如上所述的第一方式，因在细胞膜上形成不可逆的孔而引起的细胞死亡属于上述细胞坏死。 

为了使细胞发生细胞凋亡必须使DNA受到损伤。在第二方式中，通过施加脉冲宽度比1.0×10^-6秒短的、具有比较窄的脉冲宽度的脉冲电压，使电场作用至不需要的活细胞12b的细胞核88(换句话讲，使电场进入)上，由此使被细胞核88所含有的DNA受到损伤。在第二方式中，为了尽量给细胞核88施加大的电场，换句话讲，为了使电能尽量侵入到不需要的活细胞12b的较深部分，优选尽量使用脉冲宽度短的脉冲电压，例如低于1.0×10^-7秒。 

在通过脉冲电压使活细胞受到损伤而变为死细胞的本发明中，例如，通过施加一个1.0×10^-9秒～1.0×10^-6秒程度的、具有极其短的脉冲宽度的脉冲电压，能够使一个细胞变为死细胞。即，每一个脉冲能够使一个细胞变为死细胞。例如，以1.0×10^-9秒的脉冲宽度施加脉冲电压的情况下，最多在一秒钟内可使1.0×10⁹个细胞变成死细胞。通过脉冲电压发生装置连续输出脉冲电压时，脉冲宽度越短，即，频率越高，每个脉冲电压越低地被抑制。如上所述，在流式细胞仪10中，在直径为100μm～400μm的非常细的流动池32的管壁上设置有电极64a和64b，且在电极间距离为100μm～400μm的非常靠近的电极64a和电极64b之间施加脉冲电压。由此，即使每个电压被抑制得较低，产生在电极间的电场强度也足够大得能够使细胞变为死细胞。 

在流式细胞仪10中，当供电时间控制部72从分析单元50的数据处理和判别部54处接收到被测量激光照射的分析样品12为不需要的活细胞12b的判别结果时，通过控制脉冲电压发生器62的动作，使脉冲电压被施加在该不需要的活细胞12b上，由此活细胞群11中的不需要的活细胞12b能可靠地变为死细胞。此外，相反地，当从分析单元50的数据处理和判别部54处接收到被测量激光照射的分析样品12为干细胞12a的判别结果时，通过控制脉冲电压发生器62的动作，使脉冲电压不施加在干细胞12a上，由此活细胞群11中的干细胞12a 不受到任何损伤，可靠地通过有效电场区域E。 

通过了有效电场区域E的分析样品12落入到回收容器80内。例如，活细胞通常具有附着(着床)在所接触的物体上的性质。因此，回收容器80的壁面呈现出仅附着有通过脉冲电压的施加并没有变为死细胞13的分析样品12即干细胞12a的状态。通过脉冲电压的施加而变为死细胞13的细胞呈现出浮游在回收容器80内的样品液上的状态。通过将该浮游状态的死细胞13(曾经为不需要的活细胞12b的细胞)除去，能够在回收容器80内仅分离出作为目标活细胞的干细胞12a以进行回收。流式细胞仪10优选具有这种的、将没有附着在回收容器80的内壁面而是浮游在样品液上的细胞作为死细胞13以进行分级分离并回收，且在回收容器80内仅分离和回收作为目标活细胞的干细胞12a的分离和回收机构。 

此外，若对回收容器80中的样品液实施可培养出活细胞的培养处理，则不能培养(增殖)出样品液中的死细胞(曾经为不需要的活细胞12b的细胞)，而是仅培养(增殖)出样品液中的活细胞。这样，由于通过脉冲电压将活细胞群11中的不需要的活细胞12b可靠地变为死细胞，因此通过对样品液实施培养处理，能够仅分级分离出活细胞群11中的干细胞12a，并能够减少在样品液中的死亡细胞13的比例。通过这样的培养处理，能够得到几乎所有的细胞由干细胞12a构成的细胞群。流式细胞仪10优选具有这样的、能够对回收容器80中的样品液实施可培养出活细胞的培养处理的培养装置。流式细胞仪10具有如上所述的构成。 

根据本发明的具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪，能够使作为目标的活细胞不受到任何损伤，且从含有大量活细胞的细胞群中短时间内且高精度地分级分离出不需要的活细胞，并使该不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。此外，根据本发明的活细胞分级分离处理方法的另一种方式，能够使作为目标的活细胞不受到任何损伤，且从含有大量活细胞的细胞群中短时间内且高精度地分级分离出目标活细胞并对其进行回收。此外，根据本发明的活细胞分级分离处理方法的其他方式，能够使作为目标的活细胞不受到任何损伤，且从含有大量活细胞的细胞群中短时间内且高精度地分级分离出目标活细胞并对其进行培养。 

上述实施方式中，通过在电极间施加脉冲电压，使脉冲电场作用于细胞而使其变为死细胞。在本发明中，也可以在与样品液流中的不需要的活细胞相对应的部分产生脉冲电场，例如使电场作用于样品液自身。例如，在上述流式细胞仪10中，当将在电极64a和64b之间产生的电场强度极大地设为1.0×10³V～1.0×10⁴V时，在鞘液或样品液内发生放电，例如在样品液内发生冲击波。如果不需要的活细胞12b的细胞膜因该冲击波而被破坏(不可逆破坏)，则不需要的活细胞12b将变为死细胞。此外，若极大的电场作用于样品液，则样品液呈等离子状态而产生紫外线。该紫外线导致不需要的活细胞12b的细胞核88、甚至DNA也受到损伤。在本发明中，由此通过使脉冲电场作用于样品液自身，也可以使不需要的活细胞变为死细胞。 

如上所述，对具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪和细胞分级分离方法进行了详细的说明，但本发明并不限定在上述实施例，在不脱离本发明主题的范围内所进行的各种改良或改变均包括在本发明中。 

Claims (12)

1.一种活细胞分级分离处理方法，其特征在于，包括：

形成样品液流的步骤，所述样品液流中含有由多个不需要的活细胞和多个目标活细胞混合而形成的活细胞群，且所述活细胞群的各个活细胞分别相互隔开而在一条直线上流动；

朝向所述样品液流照射测量光的步骤；

接受所述测量光的照射，并分别获取由所述样品液流的各个活细胞分别所发出的散射光和荧光中的至少一种光信息的步骤；

根据通过所述获取步骤而获得的光信息，分别判别出与各个光信息相对应的所述活细胞是所述不需要的活细胞还是所述目标活细胞的步骤；

根据所述判别步骤中的判别结果，使脉冲电场发生在与所述样品液流中所述不需要的活细胞相对应的部分，由此使所述不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞的步骤，

在变为所述死细胞的步骤中，通过设置在用于产生所述脉冲电场的电极的外侧的电场调整用电极，抑制所述脉冲电场的扩展。

2.如权利要求1所述的活细胞分级分离处理方法，其中，在变为所述死细胞的步骤中，使脉冲电场作用于所述不需要的活细胞上，由此使所述不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。

3.如权利要求2所述的活细胞分级分离处理方法，其中，在变为所述死细胞的步骤中，作用于所述不需要的活细胞的脉冲电场的脉冲宽度按照下述方式设定：电场施加于所述不需要的活细胞的细胞核，并使所述细胞核内部的DNA受到损伤。

4.如权利要求3所述的活细胞分级分离处理方法，其中，所述脉冲宽度比1.0×10^-6秒短。

5.如权利要求4所述的活细胞分级分离处理方法，其中，在变为所述死细胞的步骤中，使脉冲电场作用于所述不需要的活细胞，并在所述不需要的活细胞内产生脉冲电流，通过由所述脉冲电流产生的焦耳热，在所述不需要的活细胞上诱发细胞凋亡。

6.如权利要求2所述的活细胞分级分离处理方法，其中，在变为所述死细胞的步骤中，作用于所述不需要的活细胞的脉冲电场的脉冲宽度和峰值电压按照下述方式设定：施加在所述不需要的活细胞细胞膜的电场大于施加在所述不需要的活细胞细胞核的电场，且所述细胞膜不可逆地被破坏。

7.如权利要求6所述的活细胞分级分离处理方法，其中，所述脉冲宽度与1.0×10^-6秒相等或比1.0×10^-6秒长。

8.如权利要7所述的活细胞分级分离处理方法，其中，施加在所述不需要的活细胞细胞膜上的电场为1kV/cm以上，且所述峰值电压为10V以上。

9.如权利要求1～8中任一项所述的活细胞分级分离处理方法，还包括：

将含有因所述脉冲电场的作用而受到损伤的所述死细胞和所述目标细胞的、所述脉冲电场作用后的所述样品液流回收在回收容器内的步骤；

在所述样品液流中，将附着在所述回收容器内壁面上的细胞作为所述目标活细胞来回收，且将没有附着在所述回收容器的内壁面上而是浮游在所述样品液流上的细胞作为所述死细胞来进行分级分离并回收的步骤。

10.如权利要求1～8中任一项所述的活细胞分级分离处理方法，还包括：

将含有因所述脉冲电场的作用而受到损伤的所述死细胞和所述目标细胞的、所述脉冲电场作用后的所述样品液流回收在回收容器内的步骤；

通过对所述回收容器中的所述样品液流实施可培养出活细胞的培养处理，且仅培养出所述样品液流中的所述目标活细胞，使所述样品液流中的所述死细胞的比例减少的步骤。

11.如权利要求1所述的活细胞分级分离处理方法，其特征在于，

所述样品液流形成在管壁为绝缘物的流动池内，

在变为所述死细胞的步骤中，通过至少一部分嵌入所述管壁的所述电极来产生所述脉冲电场。

12.一种具有细胞分级分离处理功能的流式细胞仪，其特征在于，包括：

流动池，样品液流在其内部流动，其中所述样品液流含有由多个不需要的活细胞和目标活细胞混合而形成的活细胞群；

电场发生部，在所述流动池内的特定区域产生脉冲电场；

测量光照射部，朝向所述流动池内的所述样品液流照射测量光；

光信息获取部，接受所述测量光的照射，并分别获取由所述样品液流的各个活细胞分别所发出的散射光和荧光中的至少一种光信息；

活细胞判别部，根据通过所述光信息获取部而获得的光信息，分别判别出与各个光信息相对应的所述活细胞是所述不需要的活细胞还是所述目标活细胞；

控制部，根据所述活细胞判别部中的判别结果，通过所述电场发生部来控制所述脉冲电场的发生时间；其中，

所述电场发生部包括：两个电极，其按照夹着所述特定区域的方式布置；脉冲电压施加部，其在所述两个电极之间施加脉冲电压；两个电场调整用电极，其按照夹着所述两个电极的方式布置，抑制所述脉冲电场的扩展，

所述控制部在所述不需要的活细胞经过所述流动池内的所述特定区域的时刻，通过所述电场发生部在所述特定区域产生所述脉冲电场，使所述不需要的活细胞受到损伤而变为死细胞。

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