JP2576478B2

JP2576478B2 - 細胞識別収集装置

Info

Publication number: JP2576478B2
Application number: JP61272414A
Authority: JP
Inventors: 好志十川; 靖高三浦
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1986-11-14
Filing date: 1986-11-14
Publication date: 1997-01-29
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: JPS63126480A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）細胞融合や遺伝子導入などの操作の行なわれた細胞懸
濁液は必要とする細胞と不要な細胞をともに含んだ細胞
集団であるが、本発明はそのような細胞集団から必要と
する細胞のみを生存状態で収集するための装置に関する
ものである。

（従来の技術）第７図に示される装置がフローサイトメータ又はセル
ソータの名称で実用化されている（代謝VOL.21臨時増刊
号「免疫'84」第189〜198（中山書店、1984年）参
照）。

２はノズルであり、細胞懸濁液４はノズル２の中央に
位置決めされ、細胞懸濁液４の外側に水流鞘６を流すこ
とによって、細胞がノズル２の中心を正確に通過するよ
うにしている。８はピエゾ電気結晶であり、ピエゾ電気
結晶８でノズル２を振動させることによって、ノズル２
の先端からの細胞流３から水滴3aとなる位置を一様にす
る。

10はレーザであり、レーザビームはレンズ12によって
細胞流３に集光される。レーザビーム照射によって細胞
から発した蛍光光はレンズ14によってレーザビームと直
交する方向に集められ、ダイクロニックミラー16により
蛍光の波長によって分岐される。分岐された一方の蛍光
光は第１の光電子増倍管18で検出され、他方の蛍光光は
第２の光電子増倍管20で検出される。

一方、細胞によるレーザビームの散乱光は前方散乱光
として光スキャター検知管22によって検出され、細胞の
大きさに対応した信号として出力される。

光電子増倍管18,20の検出信号F1,F2と光スキャター検
知管22の信号Ｓによって細胞流３中の細胞が識別され
る。これらの信号F1,F2,Sに基づいて水流鞘６に＋100V
もしくは−100Vの電圧を印加するか、又は電圧を印加し
ないかが決められる。水流鞘６に電圧が印加された場合
には、水滴3aが帯電する。

ノズル２の先端の下方の位置には偏向板24が設けら
れ、数千Ｖの電圧が印加されている。ノズル２の先端か
ら滴下する細胞を含んだ水滴3aは、帯電の有無及びその
正負によって偏向板24で滴下方向が変えられて分取され
る。

（発明が解決しようとする問題点）第７図に示されるような装置には、以下に示される問
題点がある。

（１）出力の大きいレーザ装置10の他に、ノズル２とピ
エゾ電気結晶８を含む水滴発生部、及び偏向板24を基本
構成部材としているため、装置が高価になり、かつ、大
型化する。

（２）細胞搬送時に高圧力を加えているため、ノズル出
口から大気圧に開放される際に細胞が破壊される虞れが
ある。

（３）単独の細胞をA,Bとした場合、必要な細胞は融合
細胞ABであるにも拘わらず、細胞Ａ及び細胞Ｂも分取す
る機能を過分に備えているため、装置の複雑化を招いて
いる。

（４）無菌処理が可能な閉鎖系になっていない。

本発明は、レーザ装置、水滴発生部及び分取用偏向板
を持たず、また、融合細胞以外の細胞を死滅させること
によって融合細胞のみを収集し、かつ、無菌処理が可能
な閉鎖系とした細胞識別収集装置を提供することを目的
とするものである。

（問題点を解決するための手段）実施例を示す第１図を参照して説明すると、本発明の
細胞識別収集装置では、１個の細胞のみが通過可能な内
径をもつ透明通路（30）の一端に細胞懸濁液の収容容器
（32）が取りつけられ、他端に細胞懸濁液の回収容器
（44）が取りつけられて無菌フィルタ（38,50）によっ
て外部と遮断された閉鎖系と、収容容器（32）から透明
通路（30）を経て回収容器（44）へ細胞懸濁液を送る送
液機構（40）と、収容容器（32）に取りつけられた超音
波振動子による撹拌機構（52,54）と、透明通路（30）
を挟んで設けられ、細胞の通過を検出する光学検出部
（56,58,60,62）と、透明通路（30）に光照射を行なう
光学系（62,64,66）と、この光学系（62,64,66）からの
光照射による細胞からの透過光又は蛍光を検出し、細胞
の種類を識別する検出・識別部（70,72,74,76,78,80）
と、透明通路（30）内に設けられ、細胞が通過可能な間
隙をもつ一対の電極（82,84）と、検出・識別部（80）
の出力信号により、高電圧電源から一対の電極（82,8
4）間に細胞を死滅させうる高電圧パルスを印加する高
電圧パルス発生部（90,92）とを備え、閉鎖系（30,32,3
8,44,50）を送液機構（40）、撹拌機構（52,54）、光学
検出部（56,58,60,62）、光学系（62,64,66）、検出・
識別部（70,72,74,76,78,80）及び高電圧パルス発生部
（90,92）に着脱可能に装着した。

（作用）細胞（68）を識別し収集するとき、閉鎖系は無菌フィ
ルタ（38,50）によって外部から遮断された状態にして
おく。送液機構（40）によって、細胞懸濁液を収容容器
（32）から透明通路（30）を経て回収容器（44）へ送り
ながら、光学検出部（56,60）で細胞（68）の通過を検
出し、光学系（62,64,66）と検出・識別部（70,72,74,7
6,78,80）によってその細胞（68）が単一細胞であるか
融合細胞であるかを識別していく。

その細胞が単一細胞である場合には、光学検出部（5
8,62）によってその細胞（68）が電極（82,84）間に来
たことを検出し、高電圧パルス発生部（90,92）から電
極（82,84）間に高電圧パルスを印加してその細胞を死
滅させる。一方、その細胞が融合細胞である場合には、
電極（82,84）間に高電圧パルスを印加せず、その細胞
を生きたままで回収容器（44）に収集する。

全ての細胞懸濁液の識別収拾作業が終了すると、閉鎖
系を、外部と遮断された状態のままで他の構成部分から
切り離し、無菌条件下で回収容器から細胞を取り出す。

（実施例）第１図は本発明の一実施例を概略的に表わしたもので
ある。

30は透明ガラスや透明樹脂にてなる透明な通路であ
り、１個の細胞のみが通過可能な内径をもっている。

透明通路30の一端には収容容器32が取りつけられ、収
容容器32は細胞懸濁液を入れるための密閉可能な開口部
34を備えている。収容容器32にはまた、細胞懸濁液を搬
送する加圧空気を供給する供給管36が設けられ、供給管
36は無菌フィルタ38によって外部と遮断されている。

透明通路30の他端には識別され収集された細胞を回収
する回収容器44が取りつけられ、回収容器44には細胞を
取り出すための密閉可能な開口部46と、細胞搬送用の空
気を排出させる排出管48が設けられている。排出管48は
無菌フィルタ50によって外部と遮断されている。

透明通路30の端部の収容容器32の開口部34と回収容器
44の開口部46が密閉可能であり、また、収容容器32の加
圧空気供給管36と回収容器44の排出管48がそれぞれ無菌
フィルタ38,50によって外部から遮断されることによ
り、この系は閉鎖系となっている。

40は送液機構としての空気送出ポンプであり、配管接
続部42によって供給管36に着脱可能に接続されている。

収容容器32の底面には、収容容器32中の細胞懸濁液内
で細胞が沈澱するのを防止するために、撹拌機構として
の超音波振動子52が密着して取りつけられている。54は
超音波振動子52の駆動部である。

細胞の位置を検出するために透明通路30の一方の側に
光源56,58が設けられ、透明通路30の反対側に受光器60,
62が設けられている。光源56から受光器60への光路はレ
ンズ66からレンズ72への光路の中心を通るように設置さ
れ、光源58から受光器62への光路は電極82と電極84の間
の中心を通るように設置されている。光源56,58及び受
光器60,62は光学検出部を構成する。

62は細胞の光スペクトルを測定するための光源であ
り、紫外領域から可視領域に及ぶ広範囲の光を発生す
る。64は光源62の光を導く光ファイバ、66は光ファイバ
64からの光を集光して透明通路30内の細胞68に照射する
レンズである。光源62、光ファイバ64及びレンズ66は光
学系を構成する。

70は分光器（プリズム又は回折格子）、72は細胞68を
透過した光を集光するレンズ、74はその光を導く光ファ
イバ、76は光ファイバ74からの光を集光して分光器70に
導くレンズである。78は１次元光ダイオードアレイであ
り、分光器70によって分光された光を入光し、電気信号
に変換して判別器80に送る。判別器80は光ダイオードア
レイ78からのスペクトルによって細胞が単一のものであ
るのか融合されたものであるのかを判別する。判別器80
は、例えば後述のようにコンピュータによる処理を含ん
でいる。レンズ72,76、光ファイバ74、分光器70、光ダ
イオードアレイ78及び判別器80は検出・識別部を構成す
る。

82,84は透明通路30内に設けられた電極であり、これ
らの電極82,84の間隙は１個の細胞が通過可能な大きさ
をもっている。電極82,84には電気接触子86及び88によ
って高電圧電源90とスイッチ92の直列回路が接続されて
いる。高電圧電源90とスイッチ92は高電圧パルス発生部
を構成する。

高電圧電源90は細胞を死滅させる高電圧をもってい
る。スイッチ92は判別器80の信号によって、電極82,84
の間を不要な細胞が通過するときにオンとなり、その細
胞を死滅させる。

配管接続部42を外すことによって、透明通路30、収容
容器32及び回収容器44を含む閉鎖系は、無菌フィルタ3
8,50によって外部と遮断された状態のままで、他の構成
部分から切り離すことができる。

第２図に単一の細胞と融合した細胞のスペクトルを示
す。

一方の単一細胞のスペクトルが破線94で示されるもの
であり、他方の単一細胞のスペクトルが鎖線96で示され
るものであるとすると、融合した細胞のスペクトルは実
線98で示されるようになる。

２種類の単一細胞がそれぞれ第２図に示されるように
固有の色調を帯びており、かつ、それらの色調に差異が
ある場合には、細胞に染色をする必要はない。細胞が固
有の色調を帯びていない場合には、色素によって染色す
ることにより、第２図に示されるようなスペクトルの差
を設ける。

第１図の実施例において、開口部34から細胞懸濁液を
注入し、開口部34を密閉して空気送出ポンプ40によって
収容容器32から透明通路30に細胞を１個ずつ送出してい
く。

光源62からの光照射によって細胞68のスペクトルが分
光器70から光ダイオードアレイ78に入射される。受光器
60によって細胞68が検出されると、細胞68のスペクトル
情報が光ダイオードアレイ78から判別器80に収集され、
判別器80によりそのスペクトルが第２図に示される破線
94のものであるが、鎖線96のものであるか、又は実線98
のものであるかによって、細胞68が単一のものが融合さ
れたものかが識別される。

識別された細胞68が電極82,84の間を通過する時刻を
受光器62からの信号によって検出し、その細胞68が単一
のものである場合には、判別器80からの信号によりスイ
ッチ92を閉じることによって細胞に高電圧パルスを印加
して死滅させる。一方、その細胞68が融合されたもので
ある場合には、スイッチ92は閉じず、細胞68を生きたま
まで回収容器44に収集する。

収容容器32内の全ての細胞懸濁液について識別収集操
作が終了すると、配管接続部42を取り外すことによって
収容容器32、透明通路30及び回収容器44を含む密閉系を
他の構成部分から切り離し、クリーンベンチ内において
開口部46を開けて回収容器46から細胞を取り出す。

第１図の実施例における判別器80を第３図に示す。

判別器80は、光ダイオードアレイ78からスペクトル情
報を収集する動作を制御し、そのスペクトル情報から細
胞68の種類を識別するCPU100の他、光ダイオードアレイ
78の出力であるアナログ信号のビデオ信号をデジタル信
号に変換するA/Dコンバータ102、A/Dコンバータ102の出
力と予め設定されたスペクトルを記憶するメモリ104、
及びメモリ104の記憶位置を指定するメモリ番地管理手
段106などを含んでいる。

受光器60から細胞68を検出した信号が出力されると、
その信号はCPU100に入力開始信号として入力される。CP
U100は入力開始信号を入力すると、光ダイオードアレイ
78にビデオ信号の出力を要請するクロック波を出力す
る。これにより、光ダイオードアレイ78からはビデオ信
号が出力され、A/Dコンバータ102はCPU100からのクロッ
ク波をA/D開始クロックとしてビデオ信号をデジタル信
号に変換していく。A/Dコンバータ102の出力は、クロッ
ク波のタイミングでメモリ番地管理手段106によってメ
モリ104の所定の番地へ記憶されていく。

光ダイオードアレイ78の各光ダイオードとメモリ104
の番地の対応関係は第４図に示されるようになる。分光
器70によって分光されたスペクトルの波長a₁〜anが１番
目からｎ番目の光ダイオードによってそれぞれ検出さ
れ、A/Dコンバータ102によってデジタル値に変換されて
メモリ104の１番目からｎ番目の番地にそれぞれ記憶さ
れる。

光ダイオードアレイ78からのビデオ信号は、第５図に
示されるようにアナログ信号として出力されるので、CP
U100からのクロック波のタイミングでA/Dコンバータ102
が動作してデジタル信号に変換していく。

第６図に、判別器80による細胞識別の手順を示す。

まず、単独細胞のスペクトル情報94,96（第２図）を
収集し、メモリ104に記憶させておく（ステップS1,S
2）。

第１図の装置により実験細胞68を流してその実験細胞
68のスペクトルを入力する（ステップS3）。実験細胞68
のスペクトルがスペクトル94又はスペクトル96に近いも
のであれば、スイッチ92をオンにする判別を下し（ステ
ップS4→S6又はS4→S5→S6）、実験細胞68のスペクトル
がスペクトル94及びスペクトル96のいずれとも異なって
おれば、スイッチ92をオフにする判定を下す（ステップ
S4→S5→S7）。

本発明はまた、遺伝子導入が行なわれた細胞を取り出
す装置としても利用することができる。その場合、光源
62として水銀ランプを使用し、遺伝形質転換物質に蛍光
マーカを付与しておき、その遺伝形質転換物質が受容細
胞に導入された細胞と導入されない細胞とを蛍光光の有
無によって判別するようにしてもよい。

第７図に示される従来の装置において、偏向板24によ
って細胞を選択する代りに、レーザ照射による光情報に
よって不要な細胞を電気パルスによって死滅させるよう
にすることができる。

（発明の効果）本発明の装置では、閉鎖系としたので無菌処理が可能
になる。

レーザや水滴発生部及び分取用の偏向部を設けず、必
要とする融合細胞のみを収集するようにしたので、装置
の構造が簡単になる。

また、従来のようにノズルから細胞を放出するのに比
べて、本発明の装置では通路内を搬送させるので、細胞
が破壊されることが少なくなる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す概略図、第２図は細胞
のスペクトルを示す図、第３図は判別器を示すブロック
図、第４図は光ダイオードアレイとメモリの対応関係を
示すブロック図、第５図はA/Dコンバータの動作を示す
波形図、第６図は判別器の識別動作を示すフローチャー
ト、第７図は従来の装置を示す概略図である。 30……透明通路、 32……収容容器、 38,50……無菌フィルタ、 40……空気送出ポンプ、 42……配管接続部、 44……回収容器、 52……超音波振動子、 56,58……光源、 60,62……受光器、 62……光源、 70……分光器、 78……光ダイオードアレイ、 80……判別器、 82,84……電極、 90……高電圧電源、 92……スイッチ。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】１個の細胞のみが通過可能な内径をもつ透
明通路の一端に細胞懸濁液の収容容器が取りつけられ、
他端に細胞懸濁液の回収容器が取りつけられて無菌フィ
ルタによって外部と遮断された閉鎖系と、前記収容容器
から前記透明通路を経て前記回収容器へ細胞懸濁液を送
る送液機構と、前記収容容器に取りつけられた超音波振
動子による撹拌機構と、前記透明通路を挟んで設けら
れ、細胞の通過を検出する光学検出部と、前記透明通路
に光照射を行なう光学系と、この光学系からの光照射に
よる細胞からの透過光又は蛍光を検出し、細胞の種類を
識別する検出・識別部と、前記透明通路内に設けられ、
細胞が通過可能な間隙をもつ一対の電極と、前記検出・
識別部の出力信号により、高電圧電源から前記一対の電
極間に細胞を死滅させうる高電圧パルスを印加する高電
圧パルス発生部とを備え、前記閉鎖系を前記送液機構、
撹拌機構、光学検出部、光学系、検出・識別部及び高電
圧パルス発生部に着脱可能に装着した細胞識別収集装
置。