JPS63126480A

JPS63126480A - 細胞識別収集装置

Info

Publication number: JPS63126480A
Application number: JP61272414A
Authority: JP
Inventors: Koji Sogawa; 十川　好志; Yasutaka Miura; 三浦　靖高
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1986-11-14
Filing date: 1986-11-14
Publication date: 1988-05-30
Anticipated expiration: 2012-01-29
Also published as: JP2576478B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）細胞融合や遺伝子導入などの操作の行なわれた細胞懸濁
液は必要とする細胞と不要な細胞をともに含んだ細胞集
団であるが、本発明はそのような細胞集団から必要とす
る細胞のみを生存状態で収集するための装置に関するも
のである。

（従来の技術）第７図に示される装置がフローサイトメータ又はセルソ
ータの名称で実用化されている（代謝ＶＯＬ、２１臨時
増刊号「免疫′８４」第１８９〜１９８（中山香店、１
９８４年）参照）。

２はノズルであり、細胞懸濁液４はノズル２の中央に位
置決めされ、Ｎ＆胞懸濁液４の外側に水流績６を流すこ
とによって、細胞がノズル２の中心を正確に通過するよ
うにしている。８はピエゾ電気結晶であり、ピエゾ電気
結晶８でノズル２を振動させることによって、ノズル２
の先端からの細胞流３から水滴３ａとなる位置を一様に
する。

１０はレーザであり、レーザビームはレンズ１２によっ
て細胞流３に集光される。レーザビーム照射によって細
胞から発した蛍光光はレンズ１４によってレーザビーム
と直交する方向に集められ、ダイクロニックミラー１６
により蛍光の波長によって分岐される０分岐された一方
の蛍光光は第１の光電子増倍管１８で検出され、他方の
蛍光光は第２の光電子増倍管２０で検出される。

一方、細胞によるレーザビームの散乱光は前方散乱光と
して光スキャター検知管２２によって検出され、細胞の
大きさに対応した信号として出力される。

光電子増倍管１８，２０の検出信号Ｆｌ、Ｆ２と光スキ
ャター検知管２２の信号Ｓによって細胞流３中の細胞が
識別される。これらの信号Ｆｌ。

Ｆ２．Ｓに基づいて水滴量６に＋１００Ｖもしくは一１
ｏｏｖの電圧を印加するか、又は電圧を印加しないかが
決められる。水滴量６に電圧が印加された場合には、水
滴３ａが帯電する。

ノズル２の先端の下方の位置には偏向板２４が設けられ
、数千Ｖの電圧が印加されている。ノズル２の先端から
滴下する細胞を含んだ水滴３ａは、帯電の有無及びその
正負によって偏向板２４で滴下方向が変えられて分取さ
れる。

（発明が解決しようとする問題点）第７図に示されるような装置には、以下に示される問題
点がある。

（１）出力の大きいレーザ装置１０の他に、ノズル２と
ピエゾ電気結晶８を含む水滴発生部、及び偏向板２４を
基本構成部材としているため、装置が高価になり、かつ
、大型化する。

（２）細胞搬送時に高圧力を加えているため、ノズル出
口から大気圧に開放される際に細胞が破壊される虞れが
ある。

（３）単独の細胞をＡ、Ｂとした場合、必要な細胞は融
合細胞ＡＢであるにも拘わらず、細胞Ａ及び細胞Ｂも分
取する機能を過分に備えているため、装置の複雑化を招
いている。

（４）無菌処理が可能な閉鎖系になっていない。

本発明は、レーザ装置、水滴発生部及び分取用偏向板を
持たず、また、融合細胞以外の細胞を死滅させることに
よって融合細胞のみを収集し、かつ、無菌処理が可能な
閉鎖系とした細胞識別収集装置を提供することを目的と
するものである。

（問題点を解決するための手段）実施例を示す第１図を参照して説明すると、本発明の細
胞識別収集装置では、１個の細胞のみが通過可能な内径
をもつ透明通路（３０）の一端に細胞懸濁液の収容容器
（３２）が取りつけられ、他端に細胞懸濁液の回収容器
（４４）が取りつけられて無菌フィルタ（３８，５０）
によって外部と遮断された閉鎖系と、収容容器（３２）
から透明通路（３０）を経て回収容器（４４）へ細胞懸
濁液を送る送液機構（４０）と、収容容器（３２）に取
りつけられた超音波振動子による攪拌機構（５２，５４
）と、透明通路（３０）を挟んで設けられ、細胞の通過
を検出する光学検出部（５６゜５８．６０．６２）と、
透明通路（３０）に光照射を行なう光学系（６２，６４
，６６）と、この光学系（６２，６４，６６）からの光
照射による細胞からの透過光又は蛍光を検出し、細胞の
種類を識別する検出・識別部（７０，７２，７４，７６
，７８，８０）と、透明通路（３０）内に設けられ、細
胞が通過可能な間隙をもつ一対の電極（８２，８４）と
、検出・識別部（８０）の出力信号により、高電圧電源
から一対の電極（８２゜８４）間に細胞を死滅させうる
高電圧パルスを印加する高電圧パルス発生部（９０，９
２）とを備え、閉鎖系（３０，３２，３８，４４，５０
）を送液機構（４０）、攪拌機構（５２，５４）、光学
検出部（５６，５８，６０，６２）、光学系（６２，６
４，６６）、検出・識別部（７０，７２，７４，７６，
７８，８０）及び高電圧パルス発生部（９０，９２）に
着脱可能に装着した。

（作用）細胞（６８）を識別し収集するとき、閉鎖系は無菌フィ
ルタ（３８，５０）によって外部から遮断された状態に
しておく。送液機構（４０）によって、細胞懸濁液を収
容容器（３２）から透明通路（３０）を経て回収容器（
４４）へ送りながら、光学検出部（５６，６０）で細胞
（６８）の通過を検出し、光学系（６２，６４，６６）
と検出・識別部（７０，７２，７４，７６，７８，８０
）によってその細胞（６８）が単一細胞であるか融合細
胞であるかを識別していく。

その細胞が単一細胞である場合には、光学検出部（５８
，６２）によってその細胞（６８）が電極（８２，８４
）間に来たことを検出し、高電圧パルス発生部（９０，
９２）から電極（８２，８４）間に高電圧パルスを印加
してその細胞を死滅させる。一方、その細胞が融合細胞
である場合には、電極（８２，８４）間に高電圧パルス
を印加せず、その細胞を生きたままで回収容器（４４）
に収集する。

全ての細胞懸濁液の識別収拾作業が終了すると、閉鎖系
を、外部と遮断された状態のままで他の構成部分から切
り離し、無菌条件下で回収容器から細胞を取り出す。

（実施例）第１図は本発明の一実施例を概略的に表わしたものであ
る。

３０は透明ガラスや透明樹脂にてなる透明な通路であり
、１個の細胞のみが通過可能な内径をもっている。

透明通路３０の一端には収容容器３２が取りつけられ、
収容容器３２は細胞懸濁液を入れるための密閉可能な開
口部３４を備えている。収容容器３２にはまた、細胞懸
濁液を搬送する加圧空気を供給する供給管３６が設けら
れ、供給管３６は無菌フィルタ３８によって外部と遮断
されている。

透明通路３０の他端には識別され収集された細胞を回収
する回収容器４４が取りつけられ、回収容器４４には細
胞を取り出すための密閉可能な開口部４６と、細胞搬送
用の空気を排出させる排出管４８が設けられている。排
出管４８は無菌フィルタ５０によって外部と遮断されて
いる。

透明通路３０の端部の収容容器３２の開口部３４と回収
容器４４の開口部４６が密閉可能であり、また、収容容
器３２の加圧空気供給管３６と回収容器４４の排出管４
８がそれぞれ無菌フィルタ３８．５０によって外部から
遮断されることにより、この系は閉鎖系となっている。

４０は送液機構としての空気送出ポンプであり、配管接
続部４２によって供給管３６に着脱可能に接続されてい
る。

収容容器３２の底面には、収容容器３２中の細胞懸濁液
内で細胞が沈澱するのを防止するために、攪拌機構とし
ての超音波振動子５２が密着して取りつけられている。

５４は超音波振動子５２の駆動部である。

細胞の位置を検出するために透明通路３０の一方の側に
光源５６．５８が設けられ、透明通路３０の反対側に受
光器６０．６２が設けられている。

光源５６から受光器６０への光路はレンズ６６からレン
ズ７２への光路の中心を通るように設置され、光源５８
から受光器６２への光路は電極８２と電極８４の間の中
心を通るように設置されている。光源５６．５８及び受
光器６０．６２は光学検出部を構成する。

６２は細胞の光スペクトルを測定するための光源であり
、紫外領域から可視領域に及ぶ広範囲の光を発生する。

６４は光源６２の光を導く光ファイバ、６６は光ファイ
バ６４からの光を集光して透明通路３０内の細胞６８に
照射するレンズである。光源６２、光ファイバ６４及び
レンズ６６は光学系を構成する。

７０は分光器（プリズム又は回折格子）、７２は細胞６
８を透過した光を集光するレンズ、７４はその光を導く
光ファイバ、７６は光ファイバ７４からの光を集光して
分光器７０に導くレンズである。７８は１次元光ダイオ
ードアレイであり、分光器７０によって分光された光を
入光し、電気信号に変換して判別器８０に送る０判別器
８０は光ダイオードアレイ７８からのスペクトルによっ
て細胞が単一のものであるのか融合されたものであるの
かを判別する。判別器８０は、例えば後述のようにコン
ピュータによる処理を含んでいる。

レンズ７２，７６、光ファイバ７４、分光器７０゜光ダ
イオードアレイ７８及び判別器８０は検出・識別部を構
成する。

８２．８４は透明通路３０内に設けられた電極であり、
これらの電極８２．８４の間隙は１個の細胞が通過可能
な大きさをもっている。電極８２゜８４には電気接触子
８６及び８８によって高電圧電源９０とスイッチ９２の
直列回路が接続されている。高電圧電源９０とスイッチ
９２は高電圧パルス発生部を構成する。

高電圧電源９０は細胞を死滅させる高電圧をもっている
。スイッチ９２は判別器８０の信号によって、電極８２
．８４の間を不要な細胞が通過するときにオンとなり、
その細胞を死滅させる。

配管接続部４２を外すことによって、透明通路３０、収
容容器３２及び回収容器４４を含む閉鎖系は、無菌フィ
ルタ３８．５０によって外部と遮断された状態のままで
、他の構成部分から切り離すことができる。

第２図に単一の細胞と融合した細胞のスペクトルを示す
。

一方の単一細胞のスペクトルが破線９４で示されるもの
であり、他方の単一細胞のスペクトルがｆＩＡ４＄９６
で示されるものであるとすると、融合した細胞のスペク
トルは実ａ９８で示されるようになる。

２種類の単一細胞がそれぞれ第２図に示されるように固
有の色調を帯びており、かつ、それらの色調に差異があ
る場合には、細胞に染色をする必要はない。細胞が固有
の色調を帯びていない場合には、色素によって染色する
ことにより、第２図に示されるようなスペクトルの差を
設ける。

第１図の実施例において、開口部３４から細胞懸濁液を
注入し、開口部３４を密閉して空気送出ポンプ４０によ
って収容容器３２から透明通路３０に細胞を１個ずつ送
出していく。

光源６２からの光照射によって細胞６８のスペクトルが
分光器７０から光ダイオードアレイ７８に入射される。

受光器６０によって細胞６８が検出されると、細胞６８
のスペクトル情報が光ダイオードアレイ７８から判別器
８０に収集され、判別器８０によりそのスペクトルが第
２図に示される破線９４のものであるか、鎖線９６のも
のであるか、又は実ｆｉ９８のものであるかによって、
細胞６８が単一のものか融合されたものかが識別される
。

識別された細胞６８が電極８２，８４の間を通過する時
刻を受光器６２からの信号によって検出し、その細胞６
８が単一のものである場合には、判別器８ｏからの信号
によりスイッチ９２を閉じることによって細胞に高電圧
パルスを印加して死滅させる。一方、その細胞６８が融
合されたものである場合には、スイッチ９２は閉じず、
細胞６８を生きたままで回収容器４４に収集する。

収容容器３２内の全ての細胞懸濁液について識別収集操
作が終了すると、配管接続部４２を取り外すことによっ
て収容容器３２、透明通路３０及び回収容器４４を含む
密閉系を他の構成部分から切り離し、クリーンベンチ内
において開口部４６を開けて回収容器４６から細胞を取
り出す。

第１図の実施例における判別器８０を第３図に示す。

判別器８０は、光ダイオードアレイ７８からスペクトル
情報を収集する動作を制御し、そのスペクトル情報から
細胞６８の種類を識別するＣＰＵ１００の他、光ダイオ
ードアレイ７８の出力であるアナログ信号のビデオ信号
をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ１０２、Ａ
／Ｄコンバータ１０２の出力と予め設定されたスペクト
ルを記憶するメモリ１０４、及びメモリ１０４の記憶位
置を指定するメモリ番地管理手段１０６などを含んでい
る。

受光器６０から細胞６８を検出した信号が出力されると
、その信号はＣＰＵ１００に入力開始信号として入力さ
れる。ＣＰＵ１００は入力開始信号を入力すると、光ダ
イオードアレイ７８にビデオ信号の出力を要請するクロ
ック波を出力する。

これにより、光ダイオードアレイ７８からはビデオ信号
が出力され、Ａ／Ｄコンバータ１０２はＣＰＵ１００か
らのクロック波をＡ／Ｄ開始クロッりとじてビデオ信号
をデジタル信号に変換していく。Ａ／Ｄコンバータ１０
２の出力は、クロック波のタイミングでメモリ番地管理
手段１０６によってメモリ１０４の所定の番地へ記憶さ
れていく。

光ダイオードアレイ７８の各光ダイオードとメモリ１０
４の番地の対応関係は第４図に示されるようになる。分
光器７０によって分光されたスペクトルの波長ａ１〜ａ
ｎが１番目からｎ番目の光ダイオードによってそれぞれ
検出され、Ａ／Ｄコンバータ１０２によってデジタル値
に変換されてメモリ１０４の１番目からｎ番目の番地に
それぞれ記憶される。

光ダイオードアレイ７８からのビデオ信号は、第５図に
示されるようにアナログ信号として出力されるので、Ｃ
ＰＵ１００からのクロック波のタイミングでＡ／Ｄコン
バータ１０２が動作してデジタル信号に変換していく。

第６図に、判別器８０による細胞識別の手順を示す。

まず、単独細胞のスペクトル情報９４．９６（第２図）
を収集し、メモリ１０４に記憶させておく（ステップＳ
ｌ、Ｓ２）。

第１図の装置により実験細胞６８を流してその実験細胞
６８のスペクトルを入力する（ステップＳ３）、実験細
胞６８のスペクトルがスペクトル９４又はスペクトル９
６に近いものであれば、スイッチ９２をオンにする判定
を下しくステップＳ４→Ｓ６又はＳ４→Ｓ５→Ｓ６）、
実験細胞６８のスペクトルがスペクトル９４及びスペク
トル９６のいずれとも異なっておれば、スイッチ９２を
オフにする判定を下す（ステップＳ４→Ｓ５→Ｓ７）。

本発明はまた、遺伝子導入が行なわれた細胞を取り出す
装置としても利用することができる。その場合、光源６
２として水銀ランプを使用し、遺伝形質転換物質に蛍光
マーカを付与しておき、その遺伝形質転換物質が受容細
胞に導入された細胞と導入されない細胞とを蛍光光の有
無によって判別するようにしてもよい。

第７図に示される従来の装置において、偏向板２４によ
って細胞を選択する代りに、レーザ照射による光情報に
よって不要な細胞を電気パルスによって死滅させるよう
にすることができる。

（発明の効果）本発明の装置では、閉鎖系としたので無菌処理が可能に
なる。

レーザや水滴発生部及び分取用の偏向部を設けず、必要
とする融合細胞のみを収集するようにしたので、装置の
構造が簡単になる。

また、従来のようにノズルから細胞を放出するのに比べ
て、本発明の装置では通路内を搬送させるので、細胞が
破壊されることが少なくなる。

【図面の簡単な説明】第１図は本発明の一実施例を示す概略図、第２図は細胞
のスペクトルを示す図、第３図は判別器を示すブロック
図、第４図は光ダイオードアレイとメモリの対応関係を
示すブロック図、第５図はＡ／Ｄコンバータの動作を示
す波形図、第６図は判別器の識別動作を示すフローチャ
ート、第７図は従来の装置を示す概略図である。３０・・・・・・透明通路、３２・・・・・・収容容器、３８．５０・・・・・・無菌フィルタ、４０・・・・・
・空気送出ポンプ、４２・・・・・・配管接続部、４４・・・・・・回収容器、５２・・・・・・超音波振動子、５６．５８・・・・・・光源、６０．６２・・・・・・受光器、６２・・・・・・光源、７０・・・・・・分光器、７８・・・・・・光ダイオードアレイ、８０・・・・・
・判別器、８２．８４・・・・・・電極、９０・・・・・高電圧電源、９２・・・・・・スイッチ。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）１個の細胞のみが通過可能な内径をもつ透明通路
の一端に細胞懸濁液の収容容器が取りつけられ、他端に
細胞懸濁液の回収容器が取りつけられて無菌フィルタに
よって外部と遮断された閉鎖系と、前記収容容器から前
記透明通路を経て前記回収容器へ細胞懸濁液を送る送液
機構と、前記収容容器に取りつけられた超音波振動子に
よる攪拌機構と、前記透明通路を挟んで設けられ、細胞
の通過を検出する光学検出部と、前記透明通路に光照射
を行なう光学系と、この光学系からの光照射による細胞
からの透過光又は蛍光を検出し、細胞の種類を識別する
検出・識別部と、前記透明通路内に設けられ、細胞が通
過可能な間隙をもつ一対の電極と、前記検出・識別部の
出力信号により、高電圧電源から前記一対の電極間に細
胞を死滅させうる高電圧パルスを印加する高電圧パルス
発生部とを備え、前記閉鎖系を前記送液機構、攪拌機構
、光学検出部、光学系、検出・識別部及び高電圧パルス
発生部に着脱可能に装着した細胞識別収集装置。