KR101113167B1 - 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터, 및 생세포 분별 처리 방법 - Google Patents

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Abstract

생세포군을 포함하는 샘플액류에 측정용 레이저광을 조사하고, 측정용 레이저광의 조사를 받아, 샘플액류의 각 생세포 각각으로부터 발하는, 산란광 및 형광의 적어도 어느 일방(一方)의 광 정보 각각을 취득하고, 취득된 광 정보에 기초하여, 각 광 정보에 대응하는 생세포가, 불요 생세포 또는 목적 생세포의 어느 쪽인지를 각각 판별하고, 판별 결과에 따라, 샘플액 중의 생세포군 중 불요 생세포라고 판별된 생세포에 대해서만 펄스 전압을 인가하여, 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 한다.
세포 분별 처리 기능, 플로우 사이토미터, 생세포, 사세포, 세포핵

Description

세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터, 및 생세포 분별 처리 방법{FLOW CYTOMETER HAVING CELL-FRACTIONATION FUNCTION AND METHOD OF FRACTIONATING LIVING CELLS}
본 발명은, 복수의 불요 생세포와 복수의 목적 생세포가 혼합하여 이루어지는 생세포군 중, 특정의 생세포에 처리를 행하는 플로우 사이토미터(flow cytometer), 및, 상기 생세포군으로부터 목적 생세포를 분별하여 회수하는 생세포 분별 처리 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 암 등의 연구에 있어서의 세포나 염색체의 해석에는, 종래는 현미경이 이용되고 있었다. 그러나 현미경에 의한 해석에서는, 대량의 데이터를 모아 통계적으로 검토하는데, 매우 많은 수고와 시간을 요하고 있었다. 현재, 대부분의 경우, 세포나 염색체의 해석에는, 단시간에 많은 샘플(세포나 염색체)을 해석하고, 신뢰성이 높은 통계 데이터를 얻는 것을 가능하게 하는, 플로우 사이토미터가 이용되고 있다. 플로우 사이토미터에서는, 항체가 형광 염색된 세포 등의 샘플 입자를 포함하는 샘플액의 흐름인 샘플액류를 형성하고, 이 샘플액류에 레이저광을 조사하여, 흐르는 대량의 샘플 입자의 하나하나로부터 방출되는 형광이나 산란광을 측정하여, 신뢰성이 높은 통계 데이터를 얻을 수 있다. 이와 같은 플로우 사이토미터 는, 의료 분야에 있어서의 연구 등에 넓게 이용되고 있다.
그런데, 차후의 의료 분야에 있어서 큰 기대가 걸려 있는 것은, 재생 세포라고도 불리는 간세포(stem cell; 줄기 세포)를 이용한 치료이다. 간세포란, 생체를 구성하는 세포의 생리적인 증식?분화 등의 과정에 있어서, 자기 증식 능력과, 특정의 기능을 가지는 세포로 분화하는 능력을 함께 가지는 세포이다. 즉, 간세포는, 자기 자신이 증가하는 복제 능력과, 다른 세포가 되는 능력을 구비하고 있는 세포이다. 간세포에는, 배(胚)로부터 골라내지는 배성 간세포(ES 세포; embryonic stem cells), 성인으로부터 골라내지는 성체 간세포, 태아로부터 골라내지는 태아성 간세포 등, 여러 종류가 있다. 이 간세포를, 부상이나 병으로 손상된 장기 등의 세포로 분화시킬 수 있으면, 이식하여 수복(修復)에 사용할 수 있는 것이기 때문에, 재생 의료의 분야 등에서 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
배성 간세포나 태아성 간세포 등으로부터 간세포를 골라내는 것에는, 배를 파괴하여 버릴(죽여 버릴) 필요가 있다고 한 윤리적인 문제를 가지고 있다. 이 때문에, 현재의 재생 의료에 관한 연구의 대부분은, 살아 있는 사람(아이 또는 성인)으로부터, 그 몸을 손상시키는 것 없이 간세포를 채취할 수 있는 성체 간세포에 관한 것으로 되어 있다. 성체 간세포의 연구에는, 당연히, 성체 간세포가 필요하다. 성체 간세포는, 골수나 혈액, 눈의 각막이나 망막, 간장, 피부 등에서 발견되는 것이지만, 발견되는 일은 매우 드물고, 통상, 채취한 대량의 세포 샘플 중에서, 극히 미량밖에 발견할 수 없다. 예를 들어, 골수 간질(間質) 중에는, 뼈, 연골, 지방, 근육, 힘줄, 신경 등 많은 조직으로 분화할 수 있는 간엽계 간세포라고 불리는 세포가 존재하고 있고, 병이나 외상 등에 의한 조직 결손에 대한 재생 의료에 있어서 주목받고 있다. 그렇지만, 이 세포는 골수 중에는 10만개에 1개의 비율로밖에 존재하고 있지 않다. 그 때문에 결손 조직의 재생을 행하기 위해서는 한 번 체외에서 배양하여 세포를 늘릴 필요가 있다. 그렇게 하기 위해서는, 이 골수 중의 복수의 세포 중에서, 극히 미량의 간세포를 분리?추출할 필요가 있다. 대량의 세포 샘플 중에서, 가능한 한 단시간에, 극히 미량의 성체 간세포를 분리?추출하기 위하여, 현재, 상기 플로우 사이토미터를 이용한 세포의 분리?회수 시스템(셀 소터; cell sorter)이 이용되고 있다.
예를 들어, 하기 비특허 문헌 1에는, 이와 같은 셀 소터의 일례에 관하여 기재되어 있다. 도 4는, 하기 비특허 문헌 1에 기재된 셀 소터(100)에 관하여 설명하는 개략 구성도이다. 셀 소터(100)에서는, 대량의 세포 샘플(102)을 포함한 샘플액을, 노즐(103)로부터 제트류(104)로서 출사(出射)한다. 이들 대량의 세포 샘플(102)에는, 적지만 간세포가 포함되어 있고, 대량의 세포 샘플(102)에는, 이와 같은 간세포를 특징짓기 위한 형광 라벨링이 행하여져 있다. 셀 소터(100)는, 이 제트류(104)에 측정용의 레이저광(106)을 조사하여, 대량의 세포 샘플(102)에 대하여 순차로 레이저광(106)을 조사한다. 그리고 광전자 증배관(108) 및 광전자 증배관(110)을 가지는, 도시하지 않는 평가 수단에 의하여, 개개의 세포 샘플(102)로부터 발하여지는 각종 산란광이나 형광의 정보를 취득한다. 그리고 도시하지 않는 평가 수단에 있어서, 레이저광(106)을 조사한 세포 샘플이, 간세포 샘플인지 여부를 판정한다(덧붙여, 하기 비특허 문헌 1에서는, 간세포를 많이 포함한 샘플 세포의 집단 부분을 특정하고 있다). 여기까지는, 일반적인 플로우 사이토미터의 구성이지만, 셀 소터(100)에서는, 특정한 세포를 분리(소팅; sorting)하는 기능을 가지고 있다. 셀 소터(100)에서는, 예를 들어 도시하지 않는 압전 소자 등에 의하여 노즐(103)을 고주파로 진동시키고, 제트류(104)를 강제적으로 액적(液滴, 112)으로 한다. 이 액적(112)을 형성할 때, 간세포 샘플 등의 특정의 세포 샘플이 액적으로 들어간 순간에, 이 특정 액적에 대하여, 플러스(+) 또는 마이너스(-)(도시예에서는 플러스)의 전하를 가한다(충전한다).
액적(112)은, 2매의 전장(電場) 형성 전극판(114, 116)에 의하여 형성된 수평 방향의 전장(118)의 사이를 순차 통과한다. 이때, 충전된 액적(112)만이, 이 수평 방향의 전장에 의하여 낙하 방향을 바꾸어(편향(偏向)하여) 낙하하여, 소망의 시험관(120)에 회수된다. 이와 같이 하여, 간세포 샘플 등의 특정의 세포 샘플(102)만이, 시험관(120)에 회수된다. 충전되지 않은 그 외의 세포 샘플(102)은 연직으로 낙하하여, 폐액 받이(122)에 회수된다.
[비특허 문헌 1] "초고속 셀 소터 MoFloTM에 의한 간세포의 새로운 분석?분리 방법", [online], [평성19년(2007년) 2월 19일 검색], 인터넷<URL: http://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/42/42_15-16.pdf>
그러나 상기 비특허 문헌 1과 같이, 샘플액을 제트류로 하기 위해서는, 노즐의 출구 부분의 직경을 예를 들어 25(μm)로 현저하게 작게 할 필요가 있다. 상기 비특허 문헌 1의 예에서는, 직경이 수(μm) ~ 20(μm) 정도의 세포가, 이 좁은 출구 부분을 통과할 때에 물리적 전탄력(剪彈力; shear force)을 받기 때문에, 필요한 간세포까지도 손상을 받아 버릴 가능성이 높았다. 또한, 강제적으로 액적으로 할 때의 고주파 진동에 의해서도, 손상을 받아 버릴 가능성이 있었다. 또한, 세포 샘플이 포함되는 액적을 충전하여, 게다가 고전장(高電場)을 가한 경우, 간세포 등의 필요한 세포에까지 전기적인 충격이 가하여지고, 이 필요한 세포까지 손상을 받아 버리게 된다고 한 문제도 있었다. 이와 같은 셀 소터를 이용하여 간세포 샘플을 분리하여, 소망의 장기 등의 세포로 분화시킨다고 하여도, 분리한 간세포 샘플이 손상을 받고 있는 경우, 잘 분화하지 않거나, 혹은 불량 세포(예를 들어 암 세포)가 발현하여 버리는 등, 다양하고 또한 위험한 문제가 발생할 가능성을 완전하게는 배제할 수 없다. 이 때문에, 세포에 손상을 줄 수 없는 것과 같은, 신중을 요하는 연구 분야에서는, 여전히 이와 같은 고속 셀 소터를 이용할 수 없었다.
이와 같이, 세포의 취급에 신중을 요하는 분야에서는, 예를 들어, 상기 셀 소터(100)의 시험관(120) 자체를 소정의 타이밍에서 이동시키는 것으로, 액적(112)에 포함되어 낙하하는 특정 세포 샘플을 분리?회수하고 있었다. 그러나 시험관(120) 자체의 이동 속도는, 제트류(104)가 액적화된 액적(112)의 낙하 속도에 비하여 현저하게 작은 속도밖에 달성할 수 없다. 대량의 샘플을 고속도로 흐르게 한 경우, 대량의 세포 샘플에 대하여, 극히 약간의 특정 세포 샘플밖에 취득하는 것밖에 할 수 없다. 또한, 시험관(120)의 이동 속도에 따라, 샘플의 유속도를 현저하게 낮게 한 경우는, 세포의 분리?추출에 많은 시간을 요한다.
본 발명은, 상기 종래의 문제점에 착목(着目)하여 이루어진 것이며, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도(高精度)로, 불요 생세포를 분별하여 처리하는 것을 가능하게 하는, 생세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 목적 생세포만을 분별하여 회수하는 것을 가능하게 하는, 생세포 분별 처리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 목적 생세포만을 분별하여 배양하는 것을 가능하게 하는, 생세포 분별 처리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 생세포 분별 처리 방법이고, 복수의 불요 생세포와 복수의 목적 생세포가 혼합하여 이루어지는 생세포군의 각 생세포가 각각 이간(離間)하여 일직선 상에 흐르는 샘플액류를 형성하는 스텝과, 상기 샘플액류에 측정광을 조사하는 스텝과, 상기 측정광의 조사를 받아, 상기 샘플액류의 각 생세포 각각으로부터 발하는, 산란광 및 형광의 적어도 어느 일방(一方)의 광 정보 각각을 취득하는 스텝과, 상기 취득하는 스텝에 의하여 취득된 광 정보에 기초하여, 각 광 정보에 대응하는 상기 생세포가, 상기 불요 생세포 또는 상기 목적 생세포의 어느 쪽인지를 각각 판별하는 스텝과, 상기 판별하는 스텝에 있어서의 판별 결과에 따라, 상기 샘플액류 중의 상기 불요 생세포에 대응하는 부분에 펄스 전계(電界)를 발생시키는 것으로, 상기 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 스텝을 가지고, 상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 펄스 전계를 발생시키는 전극의 외측에 설치된 전계 조정용 전극에 의하여 상기 펄스 전계의 넓어짐을 억제하는 것을 특징으로 하는 생세포 분별 처리 방법을 제공한다.
그때, 상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 불요 생세포에 펄스 전계를 작용시켜, 상기 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 것이 바람직하다. 나아가, 그때, 상기 사세포로 하는 스텝에 있어서 상기 불요 생세포에 작용시키는 펄스 전계는, 상기 불요 생세포의 세포핵에 전계가 걸려, 상기 세포핵 내부의 DNA(deoxyribonucleic acid)가 손상을 받도록, 펄스 폭이 설정되어 있는 것이 바람직하다. 이때, 상기 펄스 폭은 1.0×10-9(초) 이상 1.0×10-6(초) 미만인 것이 바람직하다.
그때, 상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 불요 생세포에 펄스 전계를 작용시켜 상기 불요 생세포 내에 펄스 전류를 생기게 하고, 상기 펄스 전류에 의한 줄열(Joule's heat)에 의하여 상기 불요 생세포에 아포토시스(apoptosis)를 일으키게 하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 사세포로 하는 스텝에 있어서 상기 불요 생세포에 작용시키는 펄스 전계는, 상기 불요 생세포의 세포핵과 비교하여 상기 불요 생세포의 세포막에 보다 높은 전계가 걸려, 상기 세포막이 불가역 파괴되도록, 펄스 폭 및 피크 전압이 설정되어 있는 것이 바람직하다. 그때, 상기 펄스 폭은, 1.0×10-6(초) 이상이고, 또한, 상기 불요 생세포가 상기 펄스 전계를 통과하는 시간 이하인 것이 바람직하다. 상기 피크 전압은 10V 이상 1000V 이하인 것이 바람직하다.
또한, 상기 샘플액류는, 관 벽이 절연물인 플로우 셀 내에 형성되고, 상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 관 벽에 적어도 일부가 매입된 상기 전극에 의하여, 상기 펄스 전계를 발생시키는 것이 바람직하다.
나아가, 상기 펄스 전압의 인가에 의하여 손상을 받은 상기 사세포와 상기 목적 생세포가 포함되는, 상기 펄스 전압이 인가된 후의 상기 샘플액을 회수 용기에 회수하는 스텝과, 상기 샘플액 중, 상기 회수 용기의 내벽면에 부착한 세포를, 상기 목적 생세포로서 회수하는 것과 함께, 상기 회수 용기의 내벽면에 부착하지 않고 상기 샘플액에 부유하는 세포를, 상기 사세포로서 분별하여 회수하는 스텝을 가지는 것이 바람직하다.
나아가, 상기 펄스 전압의 인가에 의하여 손상을 받은 상기 사세포와 상기 목적 생세포가 포함되는, 상기 펄스 전압이 인가된 후의 상기 샘플액을 회수 용기에 회수하는 스텝과, 상기 회수 용기 중의 상기 샘플액에 대하여 생세포를 배양 가능한 배양 처리를 행하여, 상기 샘플액 중의 상기 목적 생세포만을 배양하는 것으로, 상기 샘플액 중의 상기 사세포의 비율을 감소시키는 스텝을 가지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터이고, 복수의 불요 생세포와 복수의 목적 생세포가 혼합하여 이루어지는 생세포군의 각 생세포가 각각 이간하여 일직선 상에 흐르는 샘플액류가 내부를 흐르는 플로우 셀과, 상기 각 생세포를 하나씩 내부에 존재시키도록 형성된, 상기 플로우 셀 내의 영역에 펄스 전계를 발생시키는 전계 발생부와, 상기 플로우 셀 내의 상기 샘플액류에 측정광을 조사하는 측정광 조사부와, 상기 측정광의 조사를 받아, 상기 샘플액류의 각 생세포 각각으로부터 발하는, 산란광 및 형광의 적어도 어느 일방의 광 정보 각각을 취득하는 광 정보 취득부와, 상기 광 정보 취득부에 의하여 취득된 광 정보에 기초하여, 각 광 정보에 대응하는 상기 생세포가, 상기 불요 생세포 또는 상기 목적 생세포의 어느 쪽인지를 각각 판별하는 생세포 판별부와, 상기 생세포 판별부에 있어서의 판별 결과에 따라, 상기 전계 발생부에 의한 상기 펄스 전계의 발생 타이밍을 제어하는 제어부를 가지고, 상기 전계 발생부는, 상기 영역을 사이에 두도록 배치된 2개의 전극과, 상기 2개의 전극 간에 펄스 전압을 인가하는 펄스 전압 인가부와, 상기 2개의 전극을 사이에 두도록 배치된 2개의 전계 조정용 전극을 가지고, 상기 제어부가, 상기 플로우 셀 내의 상기 영역을 상기 불요 생세포가 통과하는 타이밍에서, 상기 전계 발생부에 의하여 상기 영역에 상기 전계를 발생시켜, 상기 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 것을 특징으로 하는, 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터를 제공한다.
삭제
<발명의 효과>
본 발명의 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터는, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도로 불요 생세포를 분별하고, 이 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 생세포 분별 처리 방법에서는, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도로, 목적 생세포를 분별하여 회수할 수 있다. 또한, 본 발명의 생세포 분별 처리 방법에서는, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도로, 목적 생세포를 분별하여 배양할 수 있다.
도 1은 본 발명의 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터의 일례에 관하여 설명하는 개략 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 광학 유닛 및 전압 인가 유닛의 구성 및 동작에 관하여 보다 상세하게 설명하는 개략 측면도이다.
도 3의 (a) 및 (b)는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 플로우 셀에 설치된 전극 및 그 근방을 확대하여 도시하는 개략 측면도이다.
도 4는 종래의 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터의 일례인 셀 소터에 관하여 설명하는 개략 구성도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
10 : 플로우 사이토미터 11 : 생세포군
12 : 분석 샘플 12a : 간세포
12b : 불요 생세포 13 : 사망 세포
15 : 시스류 17 : 샘플액류
20 : 액류 형성 유닛 22 : 액체 공급 장치
25 : 분석 샘플액 탱크 27 : 시스액 탱크
32 : 플로우 셀 34 : 외부 관로
36 : 샘플액류관 40 : 광학 유닛
42 : 측정 레이저광 조사부 44, 46 : 수광부
50 : 분석 유닛 52 : 데이터 취득부
54 : 데이터 처리?판별부 60 : 전압 인가 유닛
62 : 펄스 전압 발생기 64a, 64b : 전극
70 : 제어 장치 72 : 인가 타이밍 제어부
82 : 세포막 84 : 세포질
86 : 핵막 88 : 세포핵
100 : 셀 소터 102 : 세포 샘플
103 : 노즐 104 : 제트류
106 : 레이저광 108, 110 : 광전자 증배관
112 : 액적 114, 116 : 전장 형성 전극판
120 : 시험관
이하, 본 발명의 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터, 및 세포 분별 처리 방법에 관하여, 첨부의 도면에 도시되는 호적 실시예를 기초로 상세하게 설명한다. 도 1은, 본 발명의 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터의 일례인 플로우 사이토미터(10)에 관하여 설명하는 개략 사시도이다.
플로우 사이토미터(10)는, 액류 형성 유닛(20), 광학 유닛(40), 분석 유닛(50), 전압 인가 유닛(60), 각 부의 동작 시퀀스(sequence)를 제어하는 제어 장치(70), 회수 용기(80)를 가지고 구성되어 있다. 플로우 사이토미터(10)는, 대량의 불요 생세포(간세포 이외의 세포)에, 목적 생세포인 간세포가 극히 약간만 포함되는 생세포군에 관하여, 각 세포마다 간세포인지 여부를 판별하여, 간세포가 아니라고(즉 불요 생세포) 판별된 생세포에 대해서만 펄스 전압을 인가하여, 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 장치이다. 플로우 사이토미터(10)는, 또한, 펄스 전압이 인가된 후의, 사세포와 간세포가 포함되는 샘플액을 회수하기 위한 회수 용 기(80)를 구비하고 있고, 회수 용기(80)의 내벽면에 부착하지 않고 샘플액에 부유하는 세포를, 사세포로서 분별하여 회수하는 기능이나, 회수 용기(80) 중의 샘플액에 대하여 생세포를 배양 가능한 배양 처리를 행하여, 샘플액 중의 간세포만을 분별하여 배양하는 것으로, 샘플액 중의 사세포의 비율을 감소시키는 기능도 가진다.
플로우 사이토미터(10)는, 예를 들어, 사람의 골수로부터 추출한 생세포군 등, 대량의 생세포 중에, 극히 적은 비율이면서 간세포를 포함한(포함할 가능성이 높은) 생세포군으로부터, 간세포를 분별하는, 이른바 소팅 기능을 가지는 장치(소팅 시스템)이다. 본 실시예에서는, 이와 같이, 플로우 사이토미터(10)를 이용하여, 예를 들어, 사람의 골수로부터 추출한 생세포군 등, 대량의 생세포 중에, 극히 적은 비율이면서 간세포를 포함한(포함할 가능성이 높은) 생세포군으로부터, 간세포를 분별하여, 각종의 처리를 행한다. 덧붙여, 본 발명에 있어서의 목적 생세포는 간세포인 것에 한정되지 않는다.
상술한 바와 같이, 사람의 골수 중에는, 간엽계 간세포라고 불리는 세포가, 10만개에 1개의 비율로밖에 존재하고 있지 않다. 플로우 사이토미터(10)를 이용하여 행하는 세포 분별 처리에 있어서는, 이와 같은 생세포군에 대하여, 미리, 형광 색소를 이용하여 똑같이 염색 처리(형광 라벨)를 행하는 것으로, 간세포와 그 외의 불요 생세포를 식별 가능하게 특징지어 둔다. 간세포는, 이른바 MDR(Multi Drug Resistance)의 기능으로, 세포 내에 받아들인 색소를 내보내는 성질을 가지고 있다. 특정의 형광 색소를 이용하여, 소정의 조건에서 생세포군을 염색 처리한 경우, 이 MDR의 기능에 의하여, 간세포에 관해서는 거의 염색되지 않는(색소를 내보낸) 상태로 된다. 플로우 사이토미터(10)에서 행하는 세포 분별 처리에는, 이와 같이, 세포에 있어서의 형광 색소의 염색 상태의 차이에 의하여, 간세포(12a)와 그 외의 불요 생세포(12b)를 식별 가능하게 특징지은 생세포군(11)을 이용한다. 생세포군(11)에 있어서, 각 세포가, 각각 간세포(12a)인지 불요 생세포(12b)인지에 관해서는, 생세포군(11)을 플로우 사이토미터(10)에 도입하는 시점에서는 불명한 것은 말할 것도 없다. 본 명세서에서는, 간세포(12a)와 불요 생세포(12b)를, (특히, 간세포인지 불요 생세포인지 불명한 상태에 있어서) 모두 분석 샘플(12)로서 기재한다. 덧붙여, 본 실시예에서는, 간세포가 가지는 MDR 기능을 이용하여, 간세포와 그 외의 불요 생세포를 식별 가능하게 특징짓고 있지만, 본 발명에 있어서, 형광 색소에 의하여 목적 세포와 그 외의 불요 생세포를 식별 가능하게 특징짓는 수법은, 특별히 한정되지 않는다.
액류 형성 유닛(20)은, 액체 공급 장치(22)와 유관부(流管部, 30)를 가지고 구성되어 있다. 액체 공급 장치(22)와 유관부(30)는 배관(24)에 의하여 접속되어 있다. 액체 공급 장치(22) 내에는, 분석 샘플액을 저류(貯留)하여 두는 분석 샘플액 탱크(25), 시스액을 저류하여 두는 시스액 탱크(27)를 가지고 있다. 유관부(30)는, 샘플액이 시스액(sheath fluid)에 둘러싸여 내부를 흐르는 플로우 셀(32)과, 플로우 셀(32)로 시스액을 공급하는, 플로우 셀(32)과 연속한 외부 관로(34)와, 외부 관로(34)의 내부에 설치되어 플로우 셀(32)로 샘플액을 공급하는 샘플액류관(36)을 가지고 있다. 액체 공급 장치(22)의 샘플액 탱크(25)는 샘플액류관(36)에, 시스액 탱크(27)는 외부 관로(34)에, 배관(24)을 통하여 각각 접속되어 있다. 플로우 셀(32)의 출구에는 회수 용기(80)가 설치되어 있다.
이 액체 공급 장치(22)는, 도시하지 않는 에어 펌프를 각 탱크마다 구비하고 있다. 플로우 사이토미터(10)에서는, 시스액 탱크(27) 내부를 도시하지 않는 에어 펌프에 의하여 가압하는 것으로 외부 관로(34) 내부로 시스액을 공급하고, 외부 관로(34) 및 플로우 셀(32) 내를 도 1 중 상측으로부터 하측으로 향하여 흐르는 시스류(15, sheath flow)(도 2 참조)를 형성한다. 그리고 샘플액 탱크(25)를 도시하지 않는 에어 펌프에 의하여 가압하는 것으로, 샘플액류관(36)의 내부로 샘플액을 공급하고, 샘플액류관(36)의 도면 중 하측의 개구단(開口端)인 토출구(38)로부터, 시스류(15) 중으로 샘플액을 토출한다.
플로우 셀(32)에서는, 샘플액은, 시스류(15) 중으로 토출된 단계에서 유체 역학적 집속(Hydrodynamic Focusing)이 생기고, 시스류(15)에 둘러싸인 샘플액의 흐름은 매우 좁아져, 분석 샘플(12) 각각이 흐름의 방향으로 이간하여 1열로 늘어선, 샘플액류(17)를 형성한다. 본 실시예의 플로우 사이토미터(10)에서는, 샘플액류 등의 분석 샘플(12) 각각이, 거의 균등하게 소정의 간격(예를 들어 10μm)만큼 이간하여 흐르도록, 액체 공급 장치(22) 등의 동작(에어 펌프의 압력 등)이 조정되고 있다. 즉, 플로우 셀(32)에서는, 분석 샘플(12)은 1열로 되고, 1개씩 차례로 소정의 속도 V(m/초)로 플로우 셀(32) 안을 흐른다. 이 플로우 셀(32)에는, 광학 유닛(40)의 측정 레이저광 조사부(42)에 의하여 레이저광이 조사되고 있고, 이 레이저광을 횡단하도록 하여 분석 샘플(12)은 1개씩 차례로 흐른다.
광학 유닛(40)은, 플로우 셀(32)을 향하여 측정용의 레이저광을 조사하는 측 정 레이저광 조사부(42)와, 플로우 셀(32)을 흐르는(샘플액류(17)에 포함되어 흐르는) 분석 샘플(12)에 의한 산란광을 수광하고, 수광한 산란광에 따른 신호를 출력하는 수광부(44)와, 플로우 셀(32)을 흐르는 분석 샘플(12)로부터 발광한 형광을 수광하고, 수광한 형광에 따른 신호를 출력하는 수광부(46)를 가지고 있다. 수광부(44) 및 수광부(46)는 분석 유닛(50)에 접속되어 있고, 출력된 광 신호는 분석 유닛(50)으로 보내진다.
도 2는, 광학 유닛(40) 및 전압 인가 유닛(60)의 구성 및 동작에 관하여 보다 상세하게 설명하는 개략 측면도이다. 측정 레이저광 조사부(42)는, 플로우 셀(32)을 흐르는 샘플액류(17)를 향하여 특정 파장의 레이저광을 출사하는 측정 레이저광 조사부(42)와, 측정 레이저광 조사부(42)로부터 출사된 측정용 레이저광을 정형(整形)하여 플로우 셀(32) 내의 샘플액류(17)로 이끄는, 렌즈 등으로 이루어지는 레이저광 정형?조정부(64)를 구비하여 구성되어 있다. 측정 레이저광 조사부(42)는, 도시하지 않는 레이저 전원에 접속되어 있고, 제어 장치(70)의 제어 하에, 플로우 셀(32) 내를 흐르는, 분석 샘플(12)이 1열로 늘어선 샘플액류(17)를 향하여, 측정용 레이저광을 연속적으로 출사한다. 측정 레이저광 조사부(42)로부터 출사되는 측정용 레이저광은, 분석 샘플(12)에 부착된(특히 불요 생세포(12b) 내에 받아들여져 부착하여 있는) 형광 색소를 여기(勵起)시켜 특정 파장 범위의 형광을 발생시키는, 특정 파장의 레이저광이다. 측정 레이저광 조사부(42)로서는, 고체 레이저나 반도체 레이저 등의, 주지의 레이저 장치를 이용하면 된다.
수광부(44)는, 플로우 셀(32)을 사이에 두고 측정 레이저광 조사부(42)와 대향하도록 배치되어 있고, 플로우 셀(32)을 통과하는 분석 샘플(12)에 의한 레이저광의 전방(前方) 산란광을 연속하여 수광하고, 수광한 전방 산란광의 강도에 따른 아날로그 전기 신호를 출력한다. 한편, 수광부(46)는, 측정 레이저광 조사부(42)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 수직 방향이고, 또한, 유관부(30) 중의 분석 샘플(12)의 이동 방향에 대하여 수직 방향으로 배치되어 있어, 레이저광을 받아 분석 샘플(12)로부터 발하여진 형광을 수광하여, 수광한 형광의 강도에 따른 아날로그 전기 신호를 출력한다. 수광부(44) 및 수광부(46)에 있어서의 광 검출 및 아날로그 전기 신호의 출력에는, 예를 들어 PMT(photomultiplier tube)를 이용하면 된다.
분석 유닛(50)은, 데이터 취득부(52)와 데이터 처리?판별부(54)를 가지고 구성되어 있다. 데이터 취득부(52)는, 수광부(44) 및 수광부(46)로부터 출력된 아날로그 신호를 받아, 이 아날로그 신호를 AD 변환하여 디지털 신호로서 출력한다. 데이터 처리?판별부(54)는, 데이터 취득부(52)로부터 출력된 디지털 정보를 처리하여, 예를 들어, 각 분석 샘플(12)의 염색 상태(생세포 중의 형광 색소량의 정도)를 나타내는 정보(염색량 정보)를 도출한다. 데이터 처리?판별부(54)는, 나아가, 이 염색량 정보에 기초하여, 염색량 정보에 대응하는 분석 샘플(12)이, 불요 생세포 또는 간세포의 어느 쪽인지 판별한다. 본 실시예에서는, 상술과 같이, 불요 생세포(12b)에 비하여, 간세포(12a)는 염색 상태(생세포 중의 형광 색소량의 정도)가 낮기 때문에, 비교적 염색 상태가 낮은 것을 나타내는 염색량 정보(예를 들어, 염색량이 나타내는 값이 소정의 역치 이하 등)에 대응하는 분석 샘플(12)을, 간세 포(12a)라고 판별한다.
데이터 처리?판별부(54)는, 판별 결과를, 제어 장치(70)의 인가 타이밍 제어부(72)(타이밍 제어부(72))로 송신한다. 덧붙여, 분석 유닛(50)에는, 디스플레이나 프린터 등, 도시하지 않는 출력 장치가 접속되어 있고, 데이터 처리?판별부(54)에 있어서의 해석 결과를 표시 출력하는 것이 가능해져 있다. 덧붙여, 본 실시예에서는, 광 정보로부터 세포의 염색 상태의 정도를 도출하는 것으로, 간세포인지 불요 생세포인지를 판별하고 있었지만, 본 발명의 생세포의 판별 시에 이용하는, 목적 생세포와 불요 생세포의 판별 기준에 관해서는, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 생세포의 판별 시에 이용하는, 취득한 형광 정보 등의 광 정보에 행하는 처리의 내용이나, 목적 세포를 특정하기 위한 알고리즘 등은, 특별히 한정되지 않는다.
전압 인가 유닛(60)은, 펄스 전압 발생기(62)와, 플로우 셀(32)의 관 벽에 각각 대향하여 설치된, 펄스 전압 발생기(62)의 출력 단자와 각각 접속된 전극(64a) 및 전극(64b)을 가지고 구성되어 있다. 펄스 전압 발생기(62)는, 제어 장치(70)의 인가 타이밍 제어부(72)의 제어 하에, 전극(64a) 및 전극(64b)과의 사이에 펄스 전압을 인가한다. 펄스 전압 발생기(62)는, 예를 들어 1.0×10-9(초) ~ 1.0×10-6(초) 정도의 펄스 폭으로 펄스 전압을 출력하는 것이 가능한, 공지의 펄스 전압 발생 수단이다.
전극(64a) 및 전극(64b)은, 측정 레이저광의 조사 위치(A)(도 2 참조)로부터, 샘플액류(17)의 흐름 방향의 하류 측으로 충분히 이간한 위치(예를 들어, 1.0mm 이상 이간한 위치)에 배치되어 있다. 예를 들어, 전극(64a) 및 전극(64b)의 중앙 부분에 대응하는 전극 위치(B)(도 2 참조)와 측정 레이저광의 조사 위치(A)는, 미리 설정된 거리 D(m)만큼 이간하고 있다고 하고, 샘플액류(17)의 속도, 즉 분석 샘플(12)의 이동 속도 V(m/초)라고 하였을 때, 1개의 분석 샘플(12)은, 측정 레이저광의 조사를 받은 타이밍으로부터 T=D/V(초)만큼 경과한 타이밍에서, 전극 위치(B)를 통과하게 된다. 분석 유닛(50)에서는, 광 정보를 취득하고 나서, 적어도 이 T(초) 경과할 때까지의 동안에, 취득한 광 정보에 대응하는 분석 샘플이, 불요 생세포인지 간세포인지를 판별하여, 인가 타이밍 제어부(72)로 판별 결과를 송신한다.
인가 타이밍 제어부(72)는, 분석 유닛(50)의 데이터 처리?판별부(54)로부터, 측정 레이저광에 조사된 분석 샘플(12)이 불요 생세포(12b)라고 하는 판별 결과를 받은 경우, 이 불요 생세포(12b)에 펄스 전압이 인가되도록, 펄스 전압 발생기(62)의 동작을 제어한다. 반대로, 분석 유닛(50)의 데이터 처리?판별부(54)로부터, 측정 레이저광에 조사된 분석 샘플(12)이 간세포(12a)라고 하는 판별 결과를 받은 경우, 이 간세포(12a)에는 펄스 전압이 인가되지 않도록, 펄스 전압 발생기(62)의 동작을 제어한다.
구체적으로는, 인가 타이밍 제어부(72)는, 분석 유닛(50)의 데이터 처리?판별부(54)로부터, 측정 레이저광에 조사된 분석 샘플(12)이 불요 생세포(12b)라고 하는 판별 결과를 받으면, 소정의 시간 범위(대응하는 분석 샘플(12)이, 후술하는 유효 전계 영역(E)을 확실히 통과하는 시간 범위)만큼, 펄스 전압 발생기(62)에 전 압을 인가시킨다(즉, 전극(64a)과 전극(64b)의 사이에 펄스 전압을 인가시킨다). 또한, 인가 타이밍 제어부(72)는, 분석 유닛(50)의 데이터 처리?판별부(54)로부터, 측정 레이저광에 조사된 분석 샘플(12)이 간세포(12a)라고 하는 판별 결과를 받는 것과 동시에, 소정의 시간 범위(대응하는 분석 샘플(12)이, 후술하는 유효 전계 영역(E)을 확실히 통과하는 시간 범위)에 있어서는, 펄스 전압 발생기(62)가 펄스 전압을 인가하지 않도록 제어한다.
상기 소정의 시간 범위는 미리 설정되어 있어도 무방하고, 예를 들어, 인가 타이밍 제어부(72)에 상기 T=D/V(초)의 정보나, 후술하는 유효 전계 영역(E, 도 3을 참조)의 크기의 정보도 설정되어 있고, 인가 타이밍 제어부(72)가 비교적 높은 처리 능력을 가지는 경우 등, 이하와 같이 하여 펄스 전압의 인가를 제어하면 된다. 예를 들어, 인가 타이밍 제어부(72)는, 송신된 판별 결과를 받은 타이밍으로부터, 분석 유닛(50)에 있어서의 각 처리 시간의 영향을 가미하여, 이 판별 결과에 대응하는 분석 샘플(12)(즉, 간세포(12a))이 측정 레이저광의 조사 위치(A)를 통과한 타이밍을 결정한다. 나아가, 인가 타이밍 제어부(72)는, 간세포(12a)라고 하는 판별 결과를 받은 경우는, 적어도, 이 결정한 타이밍으로부터 T=D/V(초)만큼 경과한 타이밍(즉, 상기 대응하는 분석 샘플(12)이, 전극 위치(B)를 통과하는 타이밍)을 결정한다. 나아가, 유효 전계 영역(E)의 크기에 기초하여, 전극 위치(B)를 통과하는 타이밍을 포함하는 소정의 시간 범위(대응하는 1개의 분석 샘플(12)이, 유효 전계 영역(E)을 통과하고 있는 시간 범위)를 구한다. 인가 타이밍 제어부(72)는, 간세포(12a)라고 하는 판별 결과를 받은 경우는, 적어도, 이 소정의 시간 범위(대 응하는 분석 샘플(12)이, 후술하는 유효 전계 영역(E)을 확실히 통과하는 시간 범위)에서는, 펄스 전압 발생기(62)가 펄스 전압을 인가하지 않도록 제어한다.
도 3의 (a) 및 (b)는, 플로우 셀(32) 내를 이동하는 불요 생세포(12b)에 대한 펄스 전압의 인가에 관하여 설명하는 도면이고, 도 2에 도시하는 플로우 셀(32)의 전극(64a) 및 전극(64b) 근방을 확대하여 도시하는 도면이다. 전극(64a) 및 전극(64b)은, 플로우 셀(32)의 관 벽에 고정되어 있다. 전극(64a) 및 전극(64b)이, 예를 들어 시스류(15)의 시스액에 접촉하면, 시스액이나 샘플액이 격렬하게 전기 분해를 일으켜, 플로우 셀(32) 내의 필요한 생세포(즉, 간세포(12a))까지 손상을 줄 가능성이 있기 때문에, 전극(64a) 및 전극(64b)은, 시스액이나 샘플액에 직접은 접촉하지 않고, 절연물을 통하여 접촉하고 있다. 도 3의 (a) 및 (b)에서는, 전극(64a) 및 전극(64b)의 일부가 플로우 셀(32)의 관 벽에 매입되는 형으로 고정되어 있고, 예를 들어 석영 등의 절연물인 플로우 셀(32)의 관 벽의 일부를, 시스액과 전극(64a) 및 전극(64b)과의 사이에 배치하는 구성으로 하고 있다.
본 실시예에서는, 도 3의 (a)에 도시하는 바와 같이, 펄스 전압을 인가하기 위한 전극은, 이른바 다이폴(dipole) 구조로 되어 있고, 대향하는 2개의 전극(64a) 및 전극(64b)으로 구성되어 있다. 펄스 전압 발생기(62)에 의하여, 전극(64a) 및 전극(64b)과의 사이에 펄스 전압이 인가되면, 전극(64a) 및 전극(64b)과의 사이에 전계가 발생한다. 시스류(15)의 시스액 및 샘플액류(17)의 샘플액은 함께 도전성을 가져, 플로우 셀(32) 내부에는 전계가 생긴다. 예를 들어, 전극(64a)이 보다 높은 전위, 전극(64b)이 보다 낮은 전위로 되도록, 1.0×10-9(초) ~ 1.0×10-6(초) 정도의 펄스 폭으로 펄스 전압이 인가되었다고 하면, 1.0×10-9(초) ~ 1.0×10-6(초) 정도의 펄스 폭으로, 전극(64a)으로부터 전극(64b)으로 향하는 전기력선으로 나타내지는 전계(펄스 전계)가 발생한다.
예를 들어, 도 3의 (a)에 도시하는 다이폴 구조의 전극 간에 전계가 인가된 경우, 생세포를 사세포로 하는 데에 충분한 강도를 가지는 유효 전계 영역(E)은, 전극 위치(B)를 중심으로 한 어느 정도의 넓어짐을 가지고 플로우 셀(32) 내에 형성된다. 유효 전계 영역(E)은, 1개의 분석 샘플(12)이, 이 유효 전계 영역(E)을 통과하고 있는 도중에, 밖의 분석 샘플(12)이 유효 전계 영역(E)에 존재하지 않도록, 충분히 작게 형성되어 있다. 예를 들어 분석 샘플(12)의 이동 속도, 즉 샘플액류(17)의 유속을 5.0(m/초), 1초간에 흐르게 하는 분석 샘플(12)의 수를 5000개로 하면, 샘플액류(17) 중에 있어서의 분석 샘플(12) 간의 거리는, 평균으로 약 1.0×10-3(m)로 된다. 이 경우, 유효 전계 영역(E)의, 샘플액의 흐름 방향을 따른 방향의 넓어짐이 1.0×10-3(m)보다 충분히 작아지도록, 전극(64a) 및 전극(64b)의 크기나, 인가 전계의 크기가 조정되고 있다. 덧붙여, 본 발명에서는, 유효 전계 영역(E)의, 샘플액의 흐름 방향을 따른 방향의 넓어짐을 억제하기 위하여, 도 3의 (b)에 도시하는 바와 같이, 펄스 전압을 인가하기 위한 전극(64a) 및 전극(64b)에 더하여 전계 조정용 전극(66a) 및 전계 조정용 전극(66b)을 설치하여, 이른바 다중 전극 구 조로 하여도 무방하다.
플로우 셀(32) 내를 이동하는 불요 생세포(12b)에 대하여, 충분히 큰 강도의 펄스 전계가 작용하면, 불요 생세포(12b)는 손상을 받아 사세포로 된다. 불요 생세포(12b)에 펄스 전계가 작용하는 것으로(즉, 펄스 전압을 인가하는 것으로), 불요 생세포(12b)가 사세포로 되는 것에는, 주로 2개의 형태가 있다. 제1 형태는, 펄스 폭이 1.0×10-6(초) 이상으로, 비교적 넓은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하는 것으로, 불요 생세포(12b)의 세포막(82)에 전계를 집중시키고, 이 세포막(82)에 수복 불가능한 구멍을 생기게 하는 것으로, 불요 생세포(12b)를 사세포로 하는 형태이다. 세포막(82)에 수복 불가능한 구멍이 생기면, 세포질(84)은 세포 밖으로 흘러나와, 불요 생세포(12b)는 죽음에 이른다. 또한, 제2 형태는, 펄스 폭이 1.0×10-6(초)보다 짧은, 비교적 좁은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하는 것으로, 불요 생세포(12b)의 세포핵(88)에도 전계를 작용시켜(바꾸어 말하면, 전계를 진입시켜), 세포핵(88)에 포함되는 DNA(deoxyribonucleic acid)에 손상을 주어, 불요 생세포(12b)를 사세포로 하는 형태이다. 제2 형태에 의하면, 예를 들어, DNA에 원래 프로그래밍되어 있는 아포토시스를 일으켜, 불요 생세포(12b)를 사세포로 할 수 있다. 이 경우, 불요 생세포(12b)에 대하여, 충분히 큰 강도의 펄스 전계가 작용하기 때문에, 펄스 전계에 대응한 펄스 전류가, 불요 생세포(12b) 내의 특히 세포핵(88)에 흐르고, 펄스 전류에 의한 줄열에 의하여 DNA에 손상을 주어, 아포토시스를 일으킨다.
일반적인 세포인 불요 생세포(12b)나 간세포(12a)는, 세포핵(88)이 핵막(86)으로 싸여 이루어지는 핵과 세포질(84)이, 세포막(82)에 싸인 구조로 되어 있다. 세포핵(88)에는, DNA가 포함되는 염색체가 존재하고 있다. 이와 같은 불요 생세포(12b)를 등가 회로로 나타내면, 세포막(82) 및 핵막(86) 부분은, 저항과 캐패시터(capacitor)로 표현되고, 캐패시터의 유전률은 비교적 높다. 즉, 이와 같은 불요 생세포(12b)의 등가 회로에 있어서, 세포막(82) 및 핵막(86) 부분은, 주로 캐패시터로서 작용한다. 이와 같은 등가 회로 전체에 인가되는 펄스 폭이 크면(즉, 인가 전압의 주파수가 낮으면), 캐패시터는 전하를 축적하고, 비교적 큰 전압이 작용한다. 한편, 펄스 폭이 작을(즉, 인가 전압의 주파수가 높을)수록, 캐패시터에는 전하는 축적되지 않고, 등가 회로 전체에 전압이 작용한다. 불요 생세포(12b)의 경우도 마찬가지이고, 펄스 폭이 1.0×10-6(초) 이상으로, 비교적 넓은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하면, 상기 제1 형태와 같이, 불요 생세포(12b)의 세포막(82)에 전계가 집중한다. 반대로, 펄스 폭이 1.0×10-6(초)보다 작은, 비교적 좁은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하면, 상기 제2 형태와 같이, 불요 생세포(12b)의 세포핵(88)에도 전계가 작용한다(바꾸어 말하면, 전기 에너지가 진입한다).
여기서, 제1 형태와 같이, 세포막(82)에 전계를 집중시켜 구멍을 형성하여도, 전계가 비교적 작은 경우, 세포막(82)이 가지는 자기 수복 기능에 의하여, 형성한 구멍은 단시간에 수복하여 버린다. 즉, 제1 형태와 같이 세포막(82)에 구멍을 형성하는 경우, 세포막(82)에 작용하는 전계가 비교적 작으면, 불요 생세포(12b)를 사세포로 할 수 없다. 제1 형태와 같이 세포막(82)에 구멍을 형성하여 불요 생세포(12b)를 사세포로 하는 경우, 세포의 자기 수복 기능에 의하여 수복할 수 없는 구멍을 형성할 필요가 있다. 이와 같은 구멍을 형성하려면, 세포막(82)의 조직을 충분히 파괴할 수 있을 정도의, 충분히 강한 전계를 인가하는 것이 필요하다. 본원 발명에서는, 펄스 폭이 1.0×10-6(초) 이상으로, 비교적 넓은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하는 경우, 세포막(82)에 작용하는 전계는 1kV/cm 이상으로 충분히 강한 것이 바람직하다. 일반적인 플로우 셀의 직경은 100 ~ 400(μm)이고, 펄스 전압을 인가하기 위한 전극 간 거리도, 동등의 100 ~ 400(μm)로 할 수 있기 때문에, 펄스 전압의 피크값은, 예를 들어 10(V) 이상으로 하는 것이 바람직하다. 덧붙여, 샘플액이나 시스액에 걸리는 전계가 지나치게 너무 강하면, 충격파가 생기거나 샘플액이나 시스액이 돌연 비등하거나 하여, 플로우 셀이 파괴되어 버릴 가능성도 있다. 이와 같은 장치의 손괴(損壞)를 방지하기 위하여, 펄스 전압의 피크값은 1000(V) 이하인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서는, 펄스 폭이 1.0×10-6(초) 이상으로, 비교적 넓은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하는 경우, 펄스 전압의 피크값은, 예를 들어 10(V) 이상, 1000(V) 이하로 하는 것이 바람직하다.
상술과 같이, 제2 형태에서는, 예를 들어, DNA에 원래 프로그래밍되어 있는 아포토시스를 일으켜, 불요 생세포(12b)를 사세포로 한다. 아포토시스란, 다세포 생물의 몸을 구성하는 세포의 죽는 방법의 일종으로, 개체를 보다 좋은 상태로 유지하기 위하여 적극적으로 일으켜지는, 관리?조절된 세포의 자살을 말한다. 이 아 포토시스에 대하여, 혈행 불량, 외상 등에 의한 세포 내외의 환경의 악화에 의하여 일어나는 세포사는, 네크로시스(necrosis) 또는 괴사(壞死)라고 불린다. 상기 제1 형태와 같이, 세포막에 불가역적으로 구멍이 형성되어 일어나는 세포의 죽음은, 이 네크로시스에 해당한다.
세포에 아포토시스를 생기게 하려면, DNA에 손상을 주는 것이 필요하다. 제2 형태에서는, 펄스 폭이 1.0×10-6(초)보다 작은, 비교적 좁은 펄스 폭의 펄스 전압을 인가하는 것으로, 불요 생세포(12b)의 세포핵(88)에도 전계를 작용시켜(바꾸어 말하면, 전계를 진입시켜), 세포핵(88)에 포함되는 DNA(deoxyribonucleic acid)에 손상을 준다. 제2 형태에서는, 세포핵(88)에 가능한 한 큰 전계가 걸리도록, 바꾸어 말하면, 불요 생세포(12b)의 가능한 한 심부(深部)에까지 전기 에너지가 침입하도록, 펄스 폭은 1.0×10-7(초) 미만으로, 가능한 한 작은 것이 바람직하다.
펄스 전압에 의하여 생세포를 손상하여 사세포로 하는 본원 발명에서는, 예를 들어 1.0×10-9(초) ~ 1.0×10-6(초) 정도로, 충분히 작은 펄스 폭의 펄스 전압의 하나에 의하여, 1개의 세포를 사세포로 할 수 있다. 즉, 1 펄스마다 1개의 세포를 사세포로 할 수도 있다. 예를 들어, 1.0×10-9(초)의 펄스 폭으로 펄스 전압을 인가하는 경우, 최대로, 1초간에 1.0×109개쯤의 세포를, 사세포로 할 수 있다. 펄스 전압 발생 장치에 의하여 펄스 전압을 연속하여 출력할 때, 펄스 폭이 짧아질수록, 즉 주파수가 높아질수록, 하나하나의 펄스 전압은 낮게 억제된다. 상술과 같이, 플 로우 사이토미터(10)에서는, 직경 100(μm) ~ 400(μm)라고 한 매우 가는 플로우 셀(32)의 관 벽에 전극(64a) 및 전극(64b)을 설치하고, 전극 간 거리 100(μm) ~ 400(μm)로 매우 근접한 전극(64a) 및 전극(64b)의 사이에 펄스 전압을 인가한다. 이것에 의하여, 하나하나의 펄스 전압은 낮게 억제되었다고 하여도, 전극 간에 발생하는 전계의 강도는, 세포를 사세포로 할 정도로 충분히 크게 할 수 있다.
플로우 사이토미터(10)에서는, 인가 타이밍 제어부(72)가, 분석 유닛(50)의 데이터 처리?판별부(54)로부터, 측정 레이저광에 조사된 분석 샘플(12)이 불요 생세포(12b)라고 하는 판별 결과를 받은 경우, 이 불요 생세포(12b)에 펄스 전압이 인가되도록, 펄스 전압 발생기(62)의 동작을 제어하는 것으로, 생세포군(11) 중의 불요 생세포(12b)는, 확실히 사망 세포로 된다. 또한, 반대로, 분석 유닛(50)의 데이터 처리?판별부(54)로부터, 측정 레이저광에 조사된 분석 샘플(12)이 간세포(12a)라고 하는 판별 결과를 받은 경우, 이 간세포(12a)에는 펄스 전압이 인가되지 않도록, 펄스 전압 발생기(62)의 동작을 제어하기 때문에, 생세포군(11) 중의 간세포(12a)는, 손상을 일절 받는 것 없이, 확실히 유효 전계 영역(E)을 통과한다.
유효 전계 영역(E)을 통과한 분석 샘플(12)은, 회수 용기(80) 내에 낙하한다. 예를 들어, 생세포는, 일반적으로, 접촉한 물체에 부착(착상)하는 성질을 가지고 있다. 이 때문에, 회수 용기(80)의 벽면에는, 펄스 전압의 인가에 의하여 사망 세포(13)로 되어 있지 않는 분석 샘플(12), 즉 간세포(12a)만이 부착하고 있는 상태로 된다. 펄스 전압의 인가에 의하여 사망 세포(13)로 된 세포는, 회수 용기(80) 내의 샘플액에 부유하고 있는 상태로 된다. 이 부유 상태의 사망 세포(13)(불요 생 세포(12b)였던 것)를 제거하는 것으로, 회수 용기(80) 내에 목적 생세포인 간세포(12a)만을 분리하여, 회수할 수 있다. 플로우 사이토미터(10)는, 이와 같은, 회수 용기(80)의 내벽면에 부착하지 않고 샘플액에 부유하는 세포를, 사망 세포(13)로서 분별하여 회수하고, 회수 용기(80) 내에 목적 생세포인 간세포(12a)만을 분리?회수하는 분리?회수 기구를 가지고 있는 것이 바람직하다.
또한, 회수 용기(80) 중의 샘플액에 대하여 생세포를 배양 가능한 배양 처리를 행하면, 샘플액 중의 사망 세포(불요 생세포(12b)였던 것)는 배양되는(증식하는) 것 없이, 샘플액 중의 생세포만이 배양된다(증식한다). 이와 같이, 생세포군(11) 중의 불요 생세포(12b)를, 펄스 전압에 의하여 확실히 사망 세포로 하고 있기 때문에, 샘플액에 배양 처리를 행하는 것으로, 생세포군(11) 중의 간세포(12a)만을 분별하여 배양할 수 있고, 샘플액 중의 사망 세포(13)의 비율을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 배양 처리에 의하여, 거의 모든 세포가 간세포(12a)로 이루어지는 세포군을 얻을 수 있다. 플로우 사이토미터(10)는, 이와 같은, 회수 용기(80) 중의 샘플액에 대하여 생세포를 배양 가능한 배양 처리를 행할 수 있는 배양 장치를 가지고 있는 것이 바람직하다. 플로우 사이토미터(10)는, 이상과 같은 구성으로 되어 있다.
본 발명의 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터에 의하면, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도로 불요 생세포를 분별하고, 이 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 생세포 분별 처리 방법의 일 태양(態樣)에 의하면, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도로, 목적 생세포를 분별하여 회수할 수 있다. 또한, 본 발명의 생세포 분별 처리 방법의 다른 태양에 의하면, 목적으로 하는 생세포에는 일절의 손상을 주는 것 없이, 대량의 생세포가 포함되는 생세포군으로부터, 단시간 또한 고정도로, 목적 생세포를 분별하여 배양할 수 있다.
상기 실시예에서는, 전극 간에 펄스 전압을 인가하는 것으로, 세포에 펄스 전계를 작용시켜 사세포로 하였다. 본 발명에서는, 샘플액류 중의 불요 생세포에 대응하는 부분에 펄스 전계를 발생시키고, 예를 들어 샘플액 자체에 전계를 작용시켜도 무방하다. 예를 들어, 상기 플로우 사이토미터(10)에 있어서, 전극(64a)과 전극(64b)의 사이에 발생하는 전계 강도를, 1.0×103(V) ~ 1.0×104(V)로 극단적으로 크게 한 경우, 시스액이나 샘플액 내에서 방전이 생기며, 예를 들어 샘플액 내에 충격파가 생긴다. 이 충격파에 의하여, 불요 생세포(12b)의 세포막이 파괴(부가역 파괴)되면, 불요 생세포(12b)는 사세포로 된다. 또한, 한층 더 극단적으로 큰 전계가 샘플액에 작용하면, 샘플액은 플라즈마 상태로 되어 자외선이 발생한다. 이 자외선에 의하여 불요 생세포(12b)의 세포핵(88), 나아가서는 DNA에까지 손상을 생기게 할 수도 있다. 본원 발명에서는, 이와 같이, 샘플액 자체에 펄스 전계를 작용시키는 것으로, 불요 생세포를 사세포로 하여도 무방하다.
이상, 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터, 및 세포 분별 처리 방법에 관하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정은 되지 않고, 본 발명의 요지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 각종의 개량 및 변경을 행하여도 무방한 것은 물론이다.

Claims (12)

  1. 생세포 분별 처리 방법이고,
    복수의 불요 생세포와 복수의 목적 생세포가 혼합하여 이루어지는 생세포군의 각 생세포가 각각 이간(離間)하여 일직선 상에 흐르는 샘플액류를 형성하는 스텝과,
    상기 샘플액류에 측정광을 조사하는 스텝과,
    상기 측정광의 조사를 받아, 상기 샘플액류의 각 생세포 각각으로부터 발하는, 산란광 및 형광의 적어도 어느 일방(一方)의 광 정보 각각을 취득하는 스텝과,
    상기 취득하는 스텝에 의하여 취득된 광 정보에 기초하여, 각 광 정보에 대응하는 상기 생세포가, 상기 불요 생세포 또는 상기 목적 생세포의 어느 쪽인지를 각각 판별하는 스텝과,
    상기 판별하는 스텝에 있어서의 판별 결과에 따라, 상기 샘플액류 중의 상기 불요 생세포에 대응하는 부분에 펄스 전계(電界)를 발생시키는 것으로, 상기 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 스텝
    을 가지고,
    상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 펄스 전계를 발생시키는 전극의 외측에 설치된 전계 조정용 전극에 의하여 상기 펄스 전계의 넓어짐을 억제하는 것을 특징으로 하는 생세포 분별 처리 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 불요 생세포에 펄스 전계를 작용시켜, 상기 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 생세포 분별 처리 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 사세포로 하는 스텝에 있어서 상기 불요 생세포에 작용시키는 펄스 전계는, 상기 불요 생세포의 세포핵에 전계가 걸려, 상기 세포핵 내부의 DNA(deoxyribonucleic acid)가 손상을 받도록, 펄스 폭이 설정되어 있는 생세포 분별 처리 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 펄스 폭은 1.0×10-9(초) 이상 1.0×10-6(초) 미만인 생세포 분별 처리 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 불요 생세포에 펄스 전계를 작용시켜 상기 불요 생세포 내에 펄스 전류를 생기게 하고, 상기 펄스 전류에 의한 줄열(Joule's heat)에 의하여 상기 불요 생세포에 아포토시스(apoptosis)를 일으키게 하는 생세포 분별 처리 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 사세포로 하는 스텝에 있어서 상기 불요 생세포에 작용시키는 펄스 전계는, 상기 불요 생세포의 세포핵과 비교하여 상기 불요 생세포의 세포막에 보다 높은 전계가 걸려, 상기 세포막이 불가역 파괴되도록, 펄스 폭 및 피크 전압이 설정되어 있는 생세포 분별 처리 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 펄스 폭은 1.0×10-6(초) 이상이고, 또한, 상기 불요 생세포가 상기 펄스 전계를 통과하는 시간 이하인 생세포 분별 처리 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 피크 전압은 10V 이상 1000V 이하인 생세포 분별 처리 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 샘플액류는, 관 벽이 절연물인 플로우 셀 내에 형성되고,
    상기 사세포로 하는 스텝에서는, 상기 관 벽에 적어도 일부가 매입된 상기 전극에 의하여, 상기 펄스 전계를 발생시키는 것을 특징으로 하는 생세포 분별 처리 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    나아가, 상기 펄스 전압의 인가에 의하여 손상을 받은 상기 사세포와 상기 목적 생세포가 포함되는, 상기 펄스 전압이 인가된 후의 상기 샘플액을 회수 용기에 회수하는 스텝과,
    상기 샘플액 중, 상기 회수 용기의 내벽면에 부착한 세포를, 상기 목적 생세포로서 회수하는 것과 함께, 상기 회수 용기의 내벽면에 부착하지 않고 상기 샘플액에 부유하는 세포를, 상기 사세포로서 분별하여 회수하는 스텝
    을 가지는 생세포 분별 처리 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    나아가, 상기 펄스 전압의 인가에 의하여 손상을 받은 상기 사세포와 상기 목적 생세포가 포함되는, 상기 펄스 전압이 인가된 후의 상기 샘플액을 회수 용기에 회수하는 스텝과,
    상기 회수 용기 중의 상기 샘플액에 대하여 생세포를 배양 가능한 배양 처리를 행하여, 상기 샘플액 중의 상기 목적 생세포만을 배양하는 것으로, 상기 샘플액 중의 상기 사세포의 비율을 감소시키는 스텝
    을 가지는 생세포 분별 처리 방법.
  12. 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터(flow cytometer)이고,
    복수의 불요 생세포와 복수의 목적 생세포가 혼합하여 이루어지는 생세포군의 각 생세포가 각각 이간하여 일직선 상에 흐르는 샘플액류가 내부를 흐르는 플로우 셀과,
    상기 각 생세포를 하나씩 내부에 존재시키도록 형성된, 상기 플로우 셀 내의 영역에 펄스 전계를 발생시키는 전계 발생부와,
    상기 플로우 셀 내의 상기 샘플액류에 측정광을 조사하는 측정광 조사부와,
    상기 측정광의 조사를 받아, 상기 샘플액류의 각 생세포 각각으로부터 발하는, 산란광 및 형광의 적어도 어느 일방의 광 정보 각각을 취득하는 광 정보 취득부와,
    상기 광 정보 취득부에 의하여 취득된 광 정보에 기초하여, 각 광 정보에 대응하는 상기 생세포가, 상기 불요 생세포 또는 상기 목적 생세포의 어느 쪽인지를 각각 판별하는 생세포 판별부와,
    상기 생세포 판별부에 있어서의 판별 결과에 따라, 상기 전계 발생부에 의한 상기 펄스 전계의 발생 타이밍을 제어하는 제어부,를 가지고,
    상기 전계 발생부는, 상기 영역을 사이에 두도록 배치된 2개의 전극과, 상기 2개의 전극 간에 펄스 전압을 인가하는 펄스 전압 인가부와, 상기 2개의 전극을 사이에 두도록 배치된 2개의 전계 조정용 전극을 가지고,
    상기 제어부가, 상기 플로우 셀 내의 상기 영역을 상기 불요 생세포가 통과하는 타이밍에서, 상기 전계 발생부에 의하여 상기 영역에 상기 전계를 발생시켜, 상기 불요 생세포에 손상을 주어 사세포로 하는 것을 특징으로 하는, 세포 분별 처리 기능을 가지는 플로우 사이토미터.
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