WO2004019033A1 - 細胞分析分離装置 - Google Patents

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WO2004019033A1
WO2004019033A1 PCT/JP2003/010760 JP0310760W WO2004019033A1 WO 2004019033 A1 WO2004019033 A1 WO 2004019033A1 JP 0310760 W JP0310760 W JP 0310760W WO 2004019033 A1 WO2004019033 A1 WO 2004019033A1
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Takanori Ichiki
Kenji Yasuda
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1468—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N15/147—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream
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    • G01N15/1484—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers microstructural devices
    • G01N15/149—

Definitions

  • the invention of this application relates to a new cell analysis / separation apparatus which enables easy analysis / separation of cells without damaging a cell sample.
  • the invention of this application solves the above-mentioned problems as described above, fractionates the sample based on the microstructure of the sample and the fluorescence distribution in the sample, and does not damage the sample to be recovered. It is an object of the present invention to provide a new cell analysis / separation apparatus that can easily analyze and separate a cell sample. Disclosure of the invention
  • a fluid channel containing a sample-containing fluid to be introduced into the sample fractionating section by laminar flow is provided.
  • a cell analysis and separation device having a pair of fluid flow paths, Do not damage the cell sample to be recovered.
  • the invention of the present application provides at least one sample at the same time as observing the sample in the apparatus with an optical microscope in order to fractionate the sample based on the microstructure of the sample and the fluorescence distribution in the sample.
  • a means for associating the stereomicroscope image and one fluorescence microscopic image with reference to each other's positional relationship shall be provided.
  • the third means is to use a means such as a pump to generate a slow flow without pulsating flow.
  • a means for utilizing the flow generated by gravity due to the difference in the height of the liquid droplets introduced into the apparatus shall be provided.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing one example of a system configuration of the cell analysis / separation device of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the optical system of the cell analysis / separation device of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the sample separation section of the cell analysis / separation device of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the sample separation section of the cell analysis / separation device of the present invention.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of one embodiment of the cell analysis separation chip of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the cell analysis separation procedure of the present invention.
  • FIG. 7 is a micrograph of an example in which cells were separated using the cell analysis separation device of the present invention.
  • FIG. 1 schematically shows an example of a system configuration of the cell analysis / separation device of the invention of the present application.
  • Reference numeral 101 denotes a light source of a stereomicroscope, and a halogen lamp is generally used.
  • Reference numeral 102 denotes a band-pass filter that transmits only light having a specific wavelength from light from a light source for observation by a stereoscopic microscope such as a phase difference.
  • Reference numeral 103 denotes a condenser lens.
  • a phase difference ring is introduced for phase difference observation, and a polarizer is introduced for differential interference observation.
  • a stage mounted on the stage 104 is a 100-cell analysis / separation chip, and the optimal position of the chip is observed by moving the stage with a driving device 117.
  • the state in the flow path in the chip is observed with a 105 objective lens.
  • the stereoscopic image of the sample in the flow path due to the light transmitted from the light source 101 and the light from the 108 light source excited by the 109 bandpass filter. Only the wavelength is a fluorescence image emitted from the sample by the excitation light irradiated from the objective lens by the 106 dichroic mirror.
  • the wavelength of the light used for the stereoscopic microscope image observation be a wavelength sufficiently shorter or sufficiently longer than the fluorescence wavelength region to be observed and, if possible, different from the excitation light wavelength region.
  • the stereomicroscope image only in the flow path is generated by the 110 dike mirror and the 1 1 2 band pass filter, which reflects light having the same wavelength as that transmitted through the 1 102 band pass filter.
  • the fluorescence image is observed with a 115 camera by selectively transmitting only the wavelength band of the fluorescence observation by the 111-mirror and 114-band pass filters of the light that has passed through the objective lens. .
  • the images taken by the two cameras 1 13 and 1 15 are analyzed in the 1 16 image processing unit, and the relative positions of the two images are compared to determine the fine structure of the sample and the fluorescence emission position. Can be compared and identified. In this embodiment, a real image of one wavelength band and one wavelength band are used.
  • the fluorescence images of the bands were observed and compared and analyzed.
  • the solid images of two or more wavelength bands may be compared, or the fluorescence images of two or more wavelengths may be compared and analyzed.
  • one or more dichroic mirrors, a light source, and a camera observation system may be arranged in the optical path in the same manner as in the above embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the optical system of the cell analysis / separation device of the invention of the present application, which simultaneously measures images of a plurality of different wavelengths using the light receiving surface of one observation camera. Includes light of different wavelengths 201, 202, 203 sent from the objective lens. Mira is located. The light separated at each wavelength selects the visual field region to be observed by the slits 221, 222, and 23 arranged on the focal plane located at the same optical path length. Next, adjust the light of the same wavelength and the specific wavelength that you want to observe with the same intensity as the band pass filter 2 3 1, 2 3 2, 2 3 3 and the neutral density filter 1 4 1, 2, 4 2, 2 4 3. I do.
  • each of the mirrors 26 1, 26 2, 26 3 is movable, and it is possible to arbitrarily select in which area of the light receiving surface of the camera an image is formed.
  • a method of analyzing light of three different wavelengths has been described, but the same can be applied to light of four or more different wavelengths.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of the configuration of the sample separation section of the cell analysis / separation device of the present invention.
  • Reference numeral 302 denotes a flow path through which the fluid containing the sample flows into the sample fractionating section
  • flow paths 301 and 303 denote a flow path through which the fluid not containing the sample flows into the sample fractionating section.
  • 32 1, 32 2 2 Is an ultrasonic source used to irradiate ultrasonic waves to the sample fractionation section where the three flow paths join to apply an external force by ultrasonic waves to the sample 311 in the sample fractionation section. Since the fluid introduced from channels 301, 302, and 303 has no pulsating flow and is adjusted to have the same flow velocity, laminar flow is maintained in the sample fractionation section and channel 3 The sample 311 introduced from 02 into the sample fractionation section proceeds to the flow path 3505 unless an external force is applied.
  • the flow path for introducing the sample 302 and the flow path for recovering the sample 300 are arranged in a straight line with respect to the flow direction, and a pair of the flow paths are symmetric with respect to the axis of the flow path.
  • Channels 301 and 303, which introduce only the fluid into the sample fractionation section, and a pair of channels 304, 306 for discarding unnecessary samples, similarly to channel 305 They are arranged in an axially symmetrical manner.
  • at least the cross-sectional areas of the flow paths 301 and 303 are equal to each other, and the cross-sectional areas of the flow paths 304 and 306 are equal to each other.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing one example of the configuration of the sample separation unit as in FIG.
  • an embodiment of a method for inducing an external force to a sample using electrostatic force instead of ultrasonic waves will be described.
  • the fluid containing the sample 411 introduced from the flow path 402 is similarly introduced into the sample separation unit, and it is determined whether to recover or discard based on the measurement result by the optical measurement method.
  • the flow proceeds to the flow path 405 as it is without applying external force and is recovered.
  • an electric field is applied to the electrode 421 and the electrode 422 to guide the sample to the flow path 404 or 406.
  • electrodes 423 and 424 are grounded so as to be reference electrodes.
  • a substance in an aqueous solution, a substance has a potential at the interface with the aqueous solution and has a charge derived therefrom. Therefore, an external force can be applied to the discarded sample by operating the electric field. In particular, this In this case, those having a positive charge and those having a negative charge can be separated into flow paths 404 and 406, respectively. Furthermore, even when bubbles are mixed into the sample, they are not affected by the electric field because they do not have a surface charge, but they are often difficult to distinguish optically from ribosomes. . However, by using this method, it is also possible to distinguish bubbles from sample particles.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of one embodiment of the cell analysis separation chip of the present invention.
  • Reference numerals 501 and 503 denote chip cross sections, both of which have sufficient transparency to light of a wavelength to be observed.
  • the thickness of the upper surface 501 may be on the order of mm to maintain the structure, but it is in contact with the objective lens 504 and observes the flow 505 of the fluid in the liquid layer 502.
  • the maximum thickness is limited according to the magnification of the objective lens.
  • the cross-sectional thickness is desirably 0.2 mm or less.
  • the chip opening end 509 of the sample liquid introduction part and the collection part is water-repellent so as to prevent the liquid in the opening from diffusing.
  • the sample liquid 510 is placed on the sample introduction part, and the seal 507 is pierced with the needle 508 to break the seal, so that the sample liquid flows at a flow rate corresponding to the liquid level of the sample liquid 510. start.
  • this method does not require a device such as a pump.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the cell analysis separation procedure of the invention of this application.
  • the sample introduced into the dew stream is observed under a microscope, and the sample to be collected or discarded is selected. Then, the sample to be recovered is allowed to proceed to the recovery flow path without any external force and is recovered. At this time, it is considered that the sample proceeds in the laminar flow, and the sample is collected as intact as possible because no external force is applied. Next, in case of disposal, any damage to cells is not a problem, so it is optional. What is necessary is just to remove the external force by acting on the sample.
  • FIG. 7 is a micrograph of an example in which samples having actually different fluorescences were image-analyzed and separated by the cell analysis / separation apparatus of the present invention.
  • the size of each channel is 20 ⁇ mX in height (depth) 20zm in cross section, and the flow ratio of each is 1: 1: 1.
  • the type of cells was red erythrocytes, and physiological fluid (0.9% NaCl: pH 7.4) was used as the fluid.
  • An electric field (dielectrophoretic force) was used as the external force.
  • Photos 1 to 4 show the process of recovering 3 micrometer-sized cells that fluoresce red.
  • Photos 5 to 8 show the process of discarding 3 micrometer sized cells that fluoresce green.
  • the invention of this application makes it possible to identify and separate a minute sample without damage.

Abstract

試料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路と、その両脇に、対称な形で配置された1対の流体のみが導入される流路と、試料分画部において観察試料を排出するときにのみ試料分画部に外力を導入する手段と、試料分画部から選択された試料のみが層流で回収される試料を含む流体が流れ出るよう前記試料を導入する流路の下流に配置された試料回収流路と、その両脇に、対称な形で配置された必要ない試料が排出される1対の流体の流路を有する細胞分析分離装置であり、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えないものとする。

Description

明 細 書 細胞分析分離装置 技術分野
この出願の発明は、 細胞試料に損傷を与えることなしに簡便に細胞の 分析分離を行うことを可能とする新しい細胞分析分離装置に関するも のである。 背景技術
培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学 ·医学的な分析 においては重要な技術である。 細胞の比重の違いで細胞を分離する場合 には速度沈降法によって分離することができる。 しかし、 未感作の細胞 と感作した細胞とを見分けるような、 細胞の違いがほとんど無い場合に は、 蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を 1つ 1つ 分離する必要がある。 この技術についてはたとえばセルソーターがある。 セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に 1細 胞単位で単離して滴下し、 この液滴中の細胞の蛍光の有無、 光散乱量の 大小を基に、 液滴が落下する過程で、 落下方向に対して法平面方向に高 電界を任意の方向に印加することで、 液滴の落下方向を制御して、 下部 に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。 この技術につい て詳しくは、 Kamarck. M. E.が Me thods Enzymo l . 第 15 1 巻第 1 5 0頁 から 1 6 5頁 （ 1 9 8 7年） に報告している。
しかし、 この技術は高価であること、 装置が大型であること、 数千ボ ルトという高電界が必要であること、 試料が多量に必要であること、 液 滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、 直接試料を 観察できないことなどの課題があることから、 近年、 マイクロ加工技術 'を用いて作った微細な流路にできた層流中を流れる微粒子を直接顕微 鏡観察しながら分離するセルソー夕一が発明され、 たとえば Mi cro To tal Analys i s ' 98, pp. 77-80 (Kl uwer Acadeiic Publ i shers, 1998) 、 あるいは Analyt ical Chemi s t ry, 70, pp. 1909-1915 (1998) などに報告 されているが、 観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、 実用化す るためには、 試料に損傷を与えず、 かつ、 より応答の速い処理方法が必 要であった。 また、 この出願の発明者らによっても従来の問題点を解決 する試みがなされてきている。
発明者らによる試みは蛍光観察によって分離を行おうとするもので あって、 従来法に比べて特徴のある有利なものであるが、 光学的計測手 段、 試料の導入手段、 分離方法などについてはまだ詳細な検討が為され ていないのが実情である。 このため、 たとえば、 ただ蛍光観察するのみ では、 蛍光を発する試料が識別することはできるが、 蛍光を発しない試 料が通過することを認識することができず、 蛍光標識した試料のみを回 収する場合に、 誤って蛍光を発しない試料を回収する可能性があった。 そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりのこれまでの問題点を解消 し、 試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、 回収 する試料に損傷を与えることなく、 簡便に細胞試料を分析分離すること のできる新しい細胞分析分離装置を提供することを課題としている。 発明の開示
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものとして、 第 1には、 試 料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路と、 その 両側に、 対称に配置されて試料分画部において合流される 1対の流体が 導入される流路と、 試料分画部において観察試料を排出するときにのみ 試料分画部に外力を導入する手段と、 試料分画部から選択された試料を 含む流体が層流で流れ出るように前記試料を導入する流路の下流に配 置された試料回収流路と、 その両側に対称に配置された必要ない試料が 排出される 1対の流体の流路を有する細胞分析分離装置を提供し、 これ によって回収する細胞試料に損傷を与えることがないようにする。
また、 この出願の発明は、 第 2には、 試料の微細構造と試料中の蛍光 分布に基づいて試料を分画するために、 装置中の試料を光学顕微鏡で観 察するときに同時に少なくとも 1つの実体顕微鏡像と 1つの蛍光顕微 鏡像を、 互いの位置関係を参照して対応付けできる手段を有するものと し、 第 3には、 脈流の生じない流速の遅い流れをポンプ等の手段を用い ることなく装置内に発生させる手段を提供するため、 流体の流速を、 装 置に導入した液滴の高さの差によって、 重力によって生じる流れを利用 する手段を有するものとする。 図面の簡単な説明
図 1は、 この発明の細胞分析分離装置のシステム構成の 1例を示す模 式図である。
図 2は、 この発明の細胞分析分離装置の光学系の構成の 1例を示す模 式図である。
図 3は、 この発明の細胞分析分離装置の試料分離部の構成の 1例を示 す模式図である。
図 4は、 この発明の細胞分析分離装置の試料分離部の構成の 1例を示 す模式図である。
図 5は、 この発明の細胞分析分離チップの実施例の 1つの断面図であ る。
図 6は、 この発明の細胞分析分離手順を説明した図である。
図 7は、 この発明の細胞分析分離装置を用いて細胞を分離した 1例に ついての顕微鏡写真である。
なお、 図中の符号は次のものを示す。
1 0 0 細胞分析分離チップ
1 0 1、 1 0 8 光源
1 0 2、 1 0 9、 1 1 2、 1 1 4 , 2 3 1 、 2 3 2 2 3 3 バンドパスフィル夕
1 0 3 Π
1 04 ステージ
1 0 5 504 対物レンズ
1 0 6 1 1 0、 2 1 1、 2 1 2、 2 6 2、 2 6 3 ダイクロイツクミ ラー
2 1 3、 2 6 1 ミフ一
1 1 3， 1 1 5、 2 7 2 カメラ
1 1 6 画像処理解析部
1 1 7
20 0. 2 0 1 20 2 2 0 3、 50 6 光の進行方向
2 2 1. 2 2 2 22 3 スリツ 卜
24 1. 242 243 減光フィルタ一
2 5 1 2 5 2 2 5 3 シャツタ—
2 7 1 レンズ
3 0 1 3 02 3 03、 3 04 3 0 5 3 0640 1、
40 2 40 3 404、 40 5 40 6 流路
3 1 1 4 1 1 試料
3 2 1 3 2 2 超音波源
42 1 42 2 42 3、 424
50 1 5 0 3 チップ断面
50 2
5 0 5 流体の流れ
5 0 7 シー レ
5 0 8 針
5 0 9 チップ開口部端
5 1 0 試料液 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下にそ の実施の形態について説明する。
図 1に、 この出願の発明の細胞分析分離装置のシステム構成の 1例を 模式的に示す。 1 0 1は実体顕微鏡の光源であり、 一般にハロゲン系の ランプが用いられる。 1 0 2は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光か ら特定の波長のもののみを透過させるパンドパスフィルタである。 1 0 3はコンデンサレンズであり、 位相差観察をする場合は位相差リングを 導入し、 微分干渉観察をする場合は、 偏光子を導入する。 1 0 4のステ —ジ上に載っているのは 1 0 0細胞分析分離チップであり、 1 1 7の駆 動装置によって前記ステージを移動させることで前記チップの最適な 位置を観察する。 前記チップ内の流路内の状態は、 1 0 5対物レンズで 観察される。 このとき対物レンズから観察されるのは、 光源 1 0 1から 透過された光による流路内の試料の実体像と、 1 0 8の光源からの光を 1 0 9バンドパスフィル夕で励起光波長のみ 1 0 6ダイクロイツクミ ラーによって対物レンズから照射された励起光によって試料が発した 蛍光像である。 このとき、 実体顕微鏡像観察に用いる光の波長は、 観察 する蛍光波長領域より十分短いか、あるいは十分長い波長であり、かつ、 可能であれば励起光波長領域とも異なることが望ましい。 前記 1 0 2バ ンドパスフィルタを透過するのと同波 ¾の光を反射する 1 1 0ダイク 口イツクミラーおよび、 1 1 2パンドパスフィルターによって、 流路内 の実体顕微鏡像のみが 1 1 3カメラによって観察される。 他方、 蛍光像 は、 対物レンズを通過した光のうち 1 1 1ミラ一および 1 1 4バンドパ スフィルターによって、 蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、 1 1 5カメラで観察される。 2つのカメラ 1 1 3と 1 1 5で撮った像は， 1 1 6画像処理部において解析され、 2つの像の相対位置関係を比較す ることで、 試料の微細構造と、 蛍光の発光位置を比較同定することがで きる。 なお、 この実施例では、 1つの波長帯域の実体像と、 1つの波長 帯域の蛍光像を観察して比較解析したが、 同様に、 2つ以上の波長帯域 の実体像を比較しても良いし、 2つ以上の蛍光像を比較解析してもよレ^ また、 そのためには、 さらに 1個以上のダイクロイツクミラーおよび、 光源、 あるいはカメラ観測系を光路中に上記実施例と同様に配置すれば よい。
図 2は、 さらに 1つの観測カメラの受光面を用いて複数の異なる波長 の像を同時に計測する、 この出願の発明の細胞分析分離装置の光学系の 構成の 1例を示す模式図である。 対物レンズから送られてきた異なる波 長の光 2 0 1、 2 0 2、 2 0 3が含まれる 2 0 0光の進行方向に複数の ダイクロイツクミラー 2 1 1、 2 1 2および 2 1 3ミラ一が配置されて いる。 それぞれの波長で分離された光はそれぞれ同じ光路長の位置にあ る合焦点面に配置されたスリット 2 2 1、 2 2 2、 2 2 3によって観察 する視野領域を選択する。次に、パンドパスフィルタ一 2 3 1、 2 3 2、 2 3 3および減光フィルタ一 2 4 1、 2 4 2、 2 4 3によって同程度の 強度でかつ観察したい特定の波長の光を調整する。 そして、 シャッター 2 5 1、 2 5 2、 2 5 3によって特定の波長の光を遮光したい場合は遮 ることができる。 このシャッターを通過した光は、 再び、 2 6 1ミラ一 および、 ダイクロイツクミラ一 2 6 2、 2 6 3を通過した後、 2 7 1レ ンズによって 2 7 2カメラの受光面に結像する。 ここで、 各ミラー 2 6 1、 2 6 2 , 2 6 3は可動で、 カメラの受光面のどの領域に結像させる かを任意に選択することができる。 ここで、 以上の実施例では 3つの異 なる波長の光の分析手法を述べたが、 同様に 4つ以上の異なる波長の光 についても用いることができる。 また、 この実施例のように 1つのカメ ラの受光面を用いることで、 高価な高感度カメラを複数用意する必要が 無くなる。 さらにまた、 高速カメラのように複数のカメラの同期が難し い場合に、 1つの受光面で得られたデ一夕を解析するのみで、 実態顕微 鏡像や蛍光顕微鏡像などの複数の異なった波長での画像を同時に解析 することができる。 図 3は、 この発明の細胞分析分離装置の試料分離部の構成の 1例を示 す模式図である。 3 0 2は試料を含む流体が試料分画部に流れ込む流路、 流路 3 0 1 と 3 0 3は試料を含まない流体が試料分画部に流れ込む流 路、 3 2 1 、 3 2 2は前記 3つの流路が合流する試料分画部に超音波を 照射して前記試料分画部内の試料 3 1 1に超音波による外力を作用す るために用いる超音波源である。 流路 3 0 1 、 3 0 2、 3 0 3から導入 される流体は脈流が無く、 流速が一致するように調整されているため、 試料分画部では層流が維持され、 流路 3 0 2から試料分画部に導入され た試料 3 1 1は外力を受けない限り、 流路 3 0 5に進行する。 逆に超音 波による外力が作用した場合には、 流路 3 0 4あるいは流路 3 0 5に廃 棄される。 このとき、 試料を導入する流路 3 0 2と試料を回収する流路 3 0 5は流れの方向に対して一直線上に配置され、 この流路の軸に関し て軸対称な形で 1対の流体のみを試料分画部に導入する流路 3 0 1お よび 3 0 3と、 同様に、 不要な試料を廃棄する 1対の流路 3 0 4と 3 0 6が流路 3 0 5に対して軸対称な形で配置されている。 ここで、 少なく とも流路 3 0 1と 3 0 3の流れに対する断面積は等しく、 また、 流路 3 0 4と 3 0 6の流れに対する断面積は等しい。
図 4は、 図 3と同様に試料分離部の構成の 1例を示す模式図である。 ここでは、 超音波の替わりに静電力を用いた試料への外力の誘導手法の 実施例を示す。 流路 4 0 2から導入された試料 4 1 1を含む流体は、 同 様に試料分離部に導入され、 光学的計測手法による計測結果に基づいて 回収するか、 廃棄するか判断される。 回収する場合は、 外力を加えず、 そのまま流路 4 0 5に進行させて回収する。 そして、 廃棄する場合は、 電極 4 2 1と電極 4 2 2に電界を加えて、 試料を流路 4 0 4あるいは 4 0 6に誘導する。 このとき、 電極 4 2 3および 4 2 4は参照電極となる ように接地される。 一般に、 水溶液中で物質はその水溶液との境界面で ゼ一夕電位を持ち、 それに由来した電荷を持つ。 したがって、 電場を作 用させることで廃棄する試料に外力を加えることができる。 特に、 この 場合には、 正電荷を持つものと、 負電荷を持つもので、 それぞれ流路 4 0 4あるいは 4 0 6に分離することもできる。 さらに、 気泡等が試料に 混ざって導入された場合にも、 気泡は表面電荷を持たないことから、 電 場による作用は受けないが、 光学的にはリボソーム等と識別が困難な場 合が多い。 しかし、 この手法を用いることで、 気泡と試料微粒子とを識 別することも可能である。
図 5は、 この出願の発明の細胞分析分離チップの実施例の 1つの断面 図である。 5 0 1、 5 0 3はチップ断面で、 ともに観察する波長の光に 対して十分な透過性がある。 上面 5 0 1の厚さは構造を維持するために mmオーダーの厚さであっても良いが、 対物レンズ 5 0 4と接して液層 5 0 2中の流体の流れ 5 0 5を観察するチップ断面 5 0 3については、 対物レンズの倍率に応じて最大厚さが制限される。 たとえば、 対物レン ズ 5 0 4に開口数 1 . 3 5で 100 倍のものを用いた場合には、 断面の厚 さは 0 . 2 mm以下とすることが望ましい。 試料液の導入部と回収部の チップ開口部端 5 0 9は撥水処理されており、 開口部の液が拡散しない ように処理されている。 試料導入部に試料液 5 1 0を載せ、 シール 5 0 7を針 5 0 8で刺してシールを破ることで、 試料液 5 1 0の液面の高さ に応じた流速で試料液が流れ始める。 このとき、 試料液の量を厳密に制 御することで流速が厳密に制御された脈流の無い流れを作り出すこと ができる。 また、 この手法においては特にポンプ等の装置を必要としな い。
図 6は、 この出願の発明の細胞分析分離手順を説明した図である。 先 の実施例でも述べたように、 流露に導入された試料は顕微鏡観察され、 回収する試料か、 廃棄する試料か選別される。 そして、 回収する試料に ついては、 外力を一切作用させずそのまま回収流路に進行させて回収す る。 このとき、 試料は層流中を進行し、 外力が一切加えられていないた め可能な限り損傷ない試料が回収されると考えられる。 次に、 廃棄する 場合には、 細胞に損傷を与えることは、 特に問題とならないため、 任意 の外力を試料に作用させて排除すればよい。
図 7は、 実際に異なる蛍光を持つ試料を、 この出願の発明の細胞分析 分離装置で画像解析して分離した例の顕微鏡写真である。 各々の流路の サイズは、 その断面として幅 2 0 ^mX高さ （深さ） 2 0 zmであり、 各々の流量比は 1 ： 1 ： 1である。 また、 細胞の種類はゥマ赤血球であ り、 流体としては生理的食塩水 （0. 9 %N a C l : pH 7. 4) を用 いた。 また、 外力としては電場 （誘電電気泳動力） を用いた。 写真 1か ら 4では赤色に蛍光を発する大きさ 3マイクロメートルの細胞を回収 する過程を示している。 同様に写真 5から 8では緑色に蛍光を発する大 きさ 3マイクロメートルの細胞を廃棄する過程を示している。 産業上の利用可能性
以上詳述したように、 この出願の発明によって、 微小な試料を識別し て損傷を受けないかたちで分離回収することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 試料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路 と、 その両側に対称に配置されて試料分画部において合流される 1対の 流体が導入される流路と、 試料分画部において観察試料を排出するとき にのみ試料分画部に外力を導入する手段と、 試料分画部から選択された 試料を含む流体が層流で流れ出るように前記試料を導入する流路の下 流に配置された試料回収流路と、 その両側に、 対称に配置された必要な い試料が排出される 1対の流体の流路を有することを特徴とした細胞 分析分離装置。
2 . 試料を光学顕微鏡で観察するときに同時に少なくとも 1つの実体 顕微鏡像と 1つの蛍光顕微鏡像を、 互いの位置関係を参照して対応付け できる手段を有することを特徴とする請求項 1の細胞分析分離装置。
3 . 流体の流速を、 導入した液滴の高さの差によって、 重力によって生 じる流れを利用する手段を有することを特徴とする請求項 1の細胞分 析分離装置。，
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