JP2022107070A - 粒子分取装置、粒子分取方法及びコンピュータプログラム - Google Patents
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Abstract
【課題】粒子の検出精度を向上させること。【解決手段】深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置と、レーザー装置から出力された深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる粒子の蛍光を検出する検出部と、検出された蛍光に基づいて、粒子を分取する制御回路と、を備える粒子分取装置。【選択図】図１
Description
本発明は、粒子の検出技術に関する。
従来、極細の水流中を流れる微粒子にレーザーを照射することによって、様々な特性を高速に判別可能なフローサイトメトリーが知られている。フローサイトメトリーは、生物細胞に限らず、様々な微粒子を解析可能であり、例えば粒子のサイズを反映する前方散乱光、粒子の内部構造を反映する側方散乱光、及び測定対象の微粒子にレーザーを当てることで生じる蛍光を粒子毎に高速で取得可能である。取得したデータを基にフィードバック制御を行い、特定の粒子を分取する機構を持つものをセルソーターと呼ぶ。
これまで、生物細胞を特異的に検出するためには、細胞内に存在するＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）、ＲＮＡ（Ribonucleic acid）及びアミノ酸等に特異的に吸着する色素を用いた操作（一般的には、染色と呼ばれる）が行われてきた。この色素には、文字通り色がついたように見え、一般的な顕微鏡によってその存在が特定できる透過観察用の色素と、特定の波長の光を当てることによって色素分子を励起し、長波長側にシフトした光を発し、蛍光顕微鏡などによってその存在を特定する蛍光色素が存在する。より高い検出感度を得ようとする場合には、一般的に蛍光色素を利用して染色することが多く、微生物の染色においても蛍光色素を用いた細胞染色が多々行われてきた。
しかしながら、この染色においては、細胞の中に染色用の色素が浸透する必要があり、例えば胞子等、外界との物質移動を著しく制限しているような生命の場合、例え細胞内に染色対象の生体分子を内包していても染色できないという問題が存在する。また、染色用の色素は、炭素、水素、酸素等の生物細胞を構成する元素と同じ元素で構成されており、色素を細胞内に導入することによって細胞自体の元素組成が変化してしまい、精密な元素分析の妨げとなっていた。
染色による問題を解決するための手法として、染色を行うことなく無機基板（石膏）上の粒子を可視化する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１には、２００ｎｍ－３００ｎｍの深紫外光領域のレーザー又は照明装置を利用して、蛍光又はラマン光の測定を行う方法及び装置が記載されている。特許文献１の技術では、レーザー光が間欠的（パルス発振）であり、１秒間に１－２０回程度の発振、停止が繰り返される。
しかしながら、高速な処理が可能なセルソーターにおいて、特許文献１に記載のレーザーを用いた場合、レーザー発振が停止している時間には粒子を検出することができないため、粒子の検出精度が低下してしまうという問題があった。
上記事情に鑑み、本発明は、粒子の検出精度を向上させることができる技術の提供を目的としている。
本発明の一態様は、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置と、前記レーザー装置から出力された前記深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる前記粒子の蛍光を検出する検出部と、検出された前記蛍光に基づいて、前記粒子を分取する制御回路と、を備える粒子分取装置である。
本発明の一態様は、上記の粒子分取装置であって、前記深紫外光領域のうち無機鉱物による自家蛍光が見られない領域である。
本発明の一態様は、上記の粒子分取装置であって、前記深紫外光領域は、２３０ｎｍ近傍の領域である。
本発明の一態様は、上記の粒子分取装置であって、前記粒子は、ジェットインエアー方式で放出される。
本発明の一態様は、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置から出力された前記深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる前記粒子の蛍光を検出する検出ステップと、検出された前記蛍光に基づいて、前記粒子を分取する分取ステップと、を有する粒子分取方法である。
本発明の一態様は、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置から出力された前記深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる前記粒子の蛍光を検出する検出ステップと、検出された前記蛍光に基づいて、前記粒子を分取する分取ステップと、をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムである。
本発明により、粒子の検出精度を向上させることが可能となる。
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照しながら説明する。
図１は、本実施形態における粒子分取装置１００の構成図である。粒子分取装置１００は、深紫外光領域のレーザー光（以下単に「深紫外光」という。）を粒子に照射することによって得られる粒子の蛍光を検出し、検出した粒子の蛍光に基づいて粒子を分取する装置である。本実施形態において対象となる粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアミノ酸等を有する生物細胞及び胞子等である。なお、本実施形態における粒子は、染色がなされていない、又は、染色ができない粒子である。また、粒子のサイズは、例えば０．５～２０ミクロンである。
図１は、本実施形態における粒子分取装置１００の構成図である。粒子分取装置１００は、深紫外光領域のレーザー光（以下単に「深紫外光」という。）を粒子に照射することによって得られる粒子の蛍光を検出し、検出した粒子の蛍光に基づいて粒子を分取する装置である。本実施形態において対象となる粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアミノ酸等を有する生物細胞及び胞子等である。なお、本実施形態における粒子は、染色がなされていない、又は、染色ができない粒子である。また、粒子のサイズは、例えば０．５～２０ミクロンである。
粒子分取装置１００は、ノズル１０、複数のレーザー装置１１（１１－１～１１－３）、複数のフォーカスレンズ１２、検出部１３、制御回路１４、表示部１５、偏向板１６、廃液タンク１７、ウェルプレート１８及び撮影装置１９を備える。以下の説明では、複数のレーザー装置１１を、第１レーザー装置１１－１、第２レーザー装置１１－２及び第３レーザー装置１１－３として説明する。
ノズル１０は、シース液１と、サンプル液とをジェットインエアー方式で放出する。サンプル液には、粒子２が含まれる。ジェットインエアー方式により、シース液１の流れの中心に粒子２が一列に整列する。また、ノズル１０には、振動子が備えられ、制御回路１４の制御に応じて振動子が所定の周期で上下に振動する。これにより、液滴３が形成される。振動子の振動周期及びノズル１０内の圧力は、制御回路１４によって制御される。
第１レーザー装置１１－１は、可視光領域のレーザー光（以下単に「可視光」という。）を連続で出力するレーザー装置である。例えば、第１レーザー装置１１－１は、可視光として４８８ｎｍのレーザー光を連続で出力する。
第２レーザー装置１１－２は、深紫外光を連続で出力するレーザー装置である。例えば、第２レーザー装置１１－２は、深紫外光として２３０ｎｍのレーザー光を連続で出力する。
第３レーザー装置１１－３は、紫外光領域のレーザー光（以下単に「紫外光」という。）を連続で出力するレーザー装置である。例えば、第３レーザー装置１１－３は、紫外光として３５５ｎｍのレーザー光を連続で出力する。
第２レーザー装置１１－２は、深紫外光を連続で出力するレーザー装置である。例えば、第２レーザー装置１１－２は、深紫外光として２３０ｎｍのレーザー光を連続で出力する。
第３レーザー装置１１－３は、紫外光領域のレーザー光（以下単に「紫外光」という。）を連続で出力するレーザー装置である。例えば、第３レーザー装置１１－３は、紫外光として３５５ｎｍのレーザー光を連続で出力する。
ここで、２３０ｎｍのレーザー光の生成方法について説明する。本実施形態において、第２レーザー装置１１－２は、レーザーユニットと、波長変換ユニットとを用いて構成される。レーザーユニットは、例えば４６０ｎｍのレーザー光を連続で出力するレーザー装置である。波長変換ユニットは、２倍高調波を出力する装置である。波長変換ユニットは、レーザーユニットから出力されたレーザー光を非線形光学結晶と相互作用させ、レーザーユニットから出力されたレーザー光の２倍の周波数のレーザー光を発生させることによって２倍高調波を生成する。これにより、レーザーユニットから出力された４６０ｎｍのレーザー光が２倍の周波数の光に変換される。すなわち、レーザーユニットから出力された４６０ｎｍのレーザー光が、波長が１／２の２３０ｎｍのレーザー光に変換される。なお、厳密には変換効率等も踏まえて、変換後のレーザー光は、２３０ｎｍ近傍（２３０ｎｍの±数ｎｍ）のレーザー光となる。
フォーカスレンズ１２－１～１２－３は、それぞれ対応付けられているレーザー装置１１から出力されるレーザー光の光軸を調節する。
検出部１３は、レーザー装置１１から出力されたレーザー光が粒子に照射されることによって得られる散乱光及び粒子の蛍光（以下「取得光」という。）に基づいて粒子の蛍光を検出する。具体的な説明は後述する。
検出部１３は、レーザー装置１１から出力されたレーザー光が粒子に照射されることによって得られる散乱光及び粒子の蛍光（以下「取得光」という。）に基づいて粒子の蛍光を検出する。具体的な説明は後述する。
制御回路１４は、予め設定されているレーザー装置１１から出力されたレーザー光によって得られた粒子の蛍光に基づいて粒子を分取する。なお、どのレーザー装置１１を対象とするかは、ユーザが決定してもよい。制御回路１４は、分取する対象となる粒子を含む液滴３に対して、プラス又はマイナスの電荷を印加する。電荷の印加方法としては、セルソーターで一般的に使用されている手法が適用できる。以下の説明では、制御回路１４は、深紫外光を連続で出力する第２レーザー装置１１－２から出力されたレーザー光によって得られた粒子の蛍光に基づいて粒子を分取するものとして説明する。
また、対象となるレーザー装置１１は、複数であってもよい。制御回路１４は、検出部１３による検出結果を表示部１５に表示させる。また、制御回路１４は、撮影装置１９において撮影された映像（以下「撮影映像」という。）に基づいてノズル１０を制御する。例えば、制御回路１４は、撮影映像において液滴３に閾値以上の変化が生じた場合にノズル１０内の圧力を変更する。さらに、制御回路１４は、液滴３に閾値以上の変化が生じた場合に振動子の振動周期を変更する。
表示部１５は、液晶ディスプレイ、有機ＥＬ（Electro Luminescence）ディスプレイ等の画像表示装置である。表示部１５は、検出結果及び撮影映像を表示する。表示部１５は、画像表示装置を粒子分取装置１００に接続するためのインタフェースであってもよい。この場合、表示部１５は、検出結果及び撮影映像を表示するための映像信号を生成し、自身に接続されている画像表示装置に映像信号を出力する。
偏向板１６は、プラスの電圧を有する板と、マイナスの電圧を有する板とで構成される。各板は、向かい合うように設置され、板間には所定の電位差（例えば、±４０００Ｖ）が生じる。偏向板１６によって、電荷が印加された液滴３が分取される。
偏向板１６は、プラスの電圧を有する板と、マイナスの電圧を有する板とで構成される。各板は、向かい合うように設置され、板間には所定の電位差（例えば、±４０００Ｖ）が生じる。偏向板１６によって、電荷が印加された液滴３が分取される。
廃液タンク１７は、分取されなかった液滴３を廃棄するタンクである。
ウェルプレート１８は、複数のくぼみを有する平板である。ウェルプレート１８は、分取された液滴３を回収する。ウェルプレート１８は、制御回路１４の制御に応じて上下左右に移動可能である。
撮影装置１９は、カメラ等の撮影装置である。撮影装置１９は、液滴３が形成される位置に固定して設置され、液滴３を撮影する。撮影装置１９は、液滴３の撮影映像を制御回路１４に出力する。
ウェルプレート１８は、複数のくぼみを有する平板である。ウェルプレート１８は、分取された液滴３を回収する。ウェルプレート１８は、制御回路１４の制御に応じて上下左右に移動可能である。
撮影装置１９は、カメラ等の撮影装置である。撮影装置１９は、液滴３が形成される位置に固定して設置され、液滴３を撮影する。撮影装置１９は、液滴３の撮影映像を制御回路１４に出力する。
図２は、検出部１３の内部構成図である。
図２に示すように、検出部１３は、対物レンズ１３１、チューブレンズ１３２、ピンホール板１３３、プリズム１３４、複数のコリメーションレンズ１３５－１～１３５－３、第１ＰＯＤ１３６－１、第２ＰＯＤ１３６－２及び第３ＰＯＤ１３６－３を備える。
対物レンズ１３１は、入射された光を集光する。対物レンズ１３１には、レーザー光及び取得光が入射される。
チューブレンズ１３２は、対物レンズ１３１から出力された光を再度集光する。
ピンホール板１３３は、レーザー装置１１の数分のピンホールが開いた板である。ピンホール板１３３は、各レーザー装置１１から得られる光から不要な光をブロックする。
図２に示すように、検出部１３は、対物レンズ１３１、チューブレンズ１３２、ピンホール板１３３、プリズム１３４、複数のコリメーションレンズ１３５－１～１３５－３、第１ＰＯＤ１３６－１、第２ＰＯＤ１３６－２及び第３ＰＯＤ１３６－３を備える。
対物レンズ１３１は、入射された光を集光する。対物レンズ１３１には、レーザー光及び取得光が入射される。
チューブレンズ１３２は、対物レンズ１３１から出力された光を再度集光する。
ピンホール板１３３は、レーザー装置１１の数分のピンホールが開いた板である。ピンホール板１３３は、各レーザー装置１１から得られる光から不要な光をブロックする。
プリズム１３４は、ピンホール板１３３を介して出力された光を反射する多面体である。例えば、プリズム１３４は、第１レーザー装置１１－１に対応するレーザー光及び取得光を第１ＰＯＤ１３６－１に反射し、第２レーザー装置１１－２に対応するレーザー光及び取得光を第２ＰＯＤ１３６－２に反射し、第３レーザー装置１１－３に対応するレーザー光及び取得光を第３ＰＯＤ１３６－３に反射する。
コリメーションレンズ１３５－１～１３５－３は、入光した光を平行光にする。
コリメーションレンズ１３５－１～１３５－３は、入光した光を平行光にする。
第１ＰＯＤ１３６－１は、第１レーザー装置１１－１に対応するレーザー光及び取得光を入力とし、入力された取得光から粒子の蛍光を検出する。第１レーザー装置１１－１に対応するレーザー光（可視光）は、第１ＰＯＤ１３６－１において遮断される。
第２ＰＯＤ１３６－２は、第２レーザー装置１１－２に対応するレーザー光及び取得光を入力とし、入力された取得光から粒子の蛍光を検出する。第２レーザー装置１１－２に対応するレーザー光（深紫外光）は、第２ＰＯＤ１３６－２において遮断される。
第３ＰＯＤ１３６－３は、第３レーザー装置１１－３に対応するレーザー光及び取得光を入力とし、入力された取得光から粒子の蛍光を検出する。第３レーザー装置１１－３に対応するレーザー光（紫外光）は、第３ＰＯＤ１３６－３において遮断される。
第２ＰＯＤ１３６－２は、第２レーザー装置１１－２に対応するレーザー光及び取得光を入力とし、入力された取得光から粒子の蛍光を検出する。第２レーザー装置１１－２に対応するレーザー光（深紫外光）は、第２ＰＯＤ１３６－２において遮断される。
第３ＰＯＤ１３６－３は、第３レーザー装置１１－３に対応するレーザー光及び取得光を入力とし、入力された取得光から粒子の蛍光を検出する。第３レーザー装置１１－３に対応するレーザー光（紫外光）は、第３ＰＯＤ１３６－３において遮断される。
次に、図３～図５を用いて、各ＰＯＤの構成について説明する。
図３は、第１ＰＯＤ１３６－１（４８８ｎｍ）の内部構成を表す図である。
図３に示すように、第１ＰＯＤ１３６－１は、複数のダイクロイックミラー１３７～１４２及び複数の吸収フィルタ１４３～１４９を備える。なお、図示していないが、各吸収フィルタ１４３～１４９の出力先には、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）が備えられる。
図３は、第１ＰＯＤ１３６－１（４８８ｎｍ）の内部構成を表す図である。
図３に示すように、第１ＰＯＤ１３６－１は、複数のダイクロイックミラー１３７～１４２及び複数の吸収フィルタ１４３～１４９を備える。なお、図示していないが、各吸収フィルタ１４３～１４９の出力先には、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）が備えられる。
ダイクロイックミラー１３７～１４２は、特定の波長の光を反射し、特定の波長以外の光を透過する。
吸収フィルタ１４３～１４９は、特定の波長の光を通過させ、特定の波長以外の光を吸収する。例えば、吸収フィルタ１４３は、７８５ｎｍを中心とした半値幅６２ｎｍの光を透過させる。
光電子増倍管は、吸収フィルタ１４３～１４９を通過した光を検出する。次に、光電子増倍管は、検出した光を増幅する。そして、光電子増倍管は、増幅した光信号を電気信号に変換する。光電子増倍管は、電気信号を制御回路１４に出力する。
吸収フィルタ１４３～１４９は、特定の波長の光を通過させ、特定の波長以外の光を吸収する。例えば、吸収フィルタ１４３は、７８５ｎｍを中心とした半値幅６２ｎｍの光を透過させる。
光電子増倍管は、吸収フィルタ１４３～１４９を通過した光を検出する。次に、光電子増倍管は、検出した光を増幅する。そして、光電子増倍管は、増幅した光信号を電気信号に変換する。光電子増倍管は、電気信号を制御回路１４に出力する。
図４は、第２ＰＯＤ１３６－２（２３０ｎｍ）の内部構成を表す図である。
図４に示すように、第２ＰＯＤ１３６－２は、複数のダイクロイックミラー１５０～１５２及び複数の吸収フィルタ１５３～１５６を備える。なお、図示していないが、各吸収フィルタ１５３～１５６の出力先には、光電子増倍管が備えられる。
ダイクロイックミラー１５０～１５２は、特定の波長の光を反射し、特定の波長以外の光を透過する。
吸収フィルタ１５３～１５６は、特定の波長の光を通過させ、特定の波長以外の光を吸収する。例えば、吸収フィルタ１５３は、２７２ｎｍを中心とした半値幅３６ｎｍの光を透過させる。
光電子増倍管は、吸収フィルタ１５３～１５６を通過した光を検出する。次に、光電子増倍管は、検出した光を増幅する。そして、次に、光電子増倍管は、増幅した光信号を電気信号に変換する。光電子増倍管は、電気信号を制御回路１４に出力する。
図４に示すように、第２ＰＯＤ１３６－２は、複数のダイクロイックミラー１５０～１５２及び複数の吸収フィルタ１５３～１５６を備える。なお、図示していないが、各吸収フィルタ１５３～１５６の出力先には、光電子増倍管が備えられる。
ダイクロイックミラー１５０～１５２は、特定の波長の光を反射し、特定の波長以外の光を透過する。
吸収フィルタ１５３～１５６は、特定の波長の光を通過させ、特定の波長以外の光を吸収する。例えば、吸収フィルタ１５３は、２７２ｎｍを中心とした半値幅３６ｎｍの光を透過させる。
光電子増倍管は、吸収フィルタ１５３～１５６を通過した光を検出する。次に、光電子増倍管は、検出した光を増幅する。そして、次に、光電子増倍管は、増幅した光信号を電気信号に変換する。光電子増倍管は、電気信号を制御回路１４に出力する。
図５は、第３ＰＯＤ１３６－３（３５５ｎｍ）の内部構成を表す図である。
図５に示すように、第３ＰＯＤ１３６－３は、複数のダイクロイックミラー１５７～１５９及び複数の吸収フィルタ１６０～１６３を備える。なお、図示していないが、各吸収フィルタ１６０～１６３の出力先には、光電子増倍管が備えられる。
ダイクロイックミラー１５７～１５９は、特定の波長の光を反射し、特定の波長以外の光を透過する。
吸収フィルタ１６０～１６３は、特定の波長の光を通過させ、特定の波長以外の光を吸収する。例えば、吸収フィルタ１６０は、４５７ｎｍを中心とした半値幅５０ｎｍの光を透過させる。
光電子増倍管は、吸収フィルタ１６０～１６３を通過した光を検出する。次に、光電子増倍管は、検出した光を増幅する。そして、光電子増倍管は、増幅した光信号を電気信号に変換する。光電子増倍管は、電気信号を制御回路１４に出力する。
図５に示すように、第３ＰＯＤ１３６－３は、複数のダイクロイックミラー１５７～１５９及び複数の吸収フィルタ１６０～１６３を備える。なお、図示していないが、各吸収フィルタ１６０～１６３の出力先には、光電子増倍管が備えられる。
ダイクロイックミラー１５７～１５９は、特定の波長の光を反射し、特定の波長以外の光を透過する。
吸収フィルタ１６０～１６３は、特定の波長の光を通過させ、特定の波長以外の光を吸収する。例えば、吸収フィルタ１６０は、４５７ｎｍを中心とした半値幅５０ｎｍの光を透過させる。
光電子増倍管は、吸収フィルタ１６０～１６３を通過した光を検出する。次に、光電子増倍管は、検出した光を増幅する。そして、光電子増倍管は、増幅した光信号を電気信号に変換する。光電子増倍管は、電気信号を制御回路１４に出力する。
図６は、粒子分取装置１００の処理の流れを示すフローチャートである。なお、図６の処理開始時には、粒子がジェットインエアー方式により放出されているものとする。また、図６では、第２レーザー装置１１－２に焦点を当てて処理の流れを説明する。
第２レーザー装置１１－２は、レーザー光（深紫外光）を照射する（ステップＳ１０１）。レーザー光が粒子に照射された場合、取得光が検出部１３に入力される。一方、レーザー光が粒子に照射されなかった場合、レーザー光が検出部１３に入力される。入力された光は、検出部１３内の第２ＰＯＤ１３６－２に入力される。第２ＰＯＤ１３６－２は、入力された光を各波長に分類する（ステップＳ１０２）。具体的には、第２ＰＯＤ１３６－２は、ダイクロイックミラー１５０～１５２及び吸収フィルタ１５３～１５６によって、入力された光を各波長に分類する。分類された光は、光電子増倍管に入力される。
第２レーザー装置１１－２は、レーザー光（深紫外光）を照射する（ステップＳ１０１）。レーザー光が粒子に照射された場合、取得光が検出部１３に入力される。一方、レーザー光が粒子に照射されなかった場合、レーザー光が検出部１３に入力される。入力された光は、検出部１３内の第２ＰＯＤ１３６－２に入力される。第２ＰＯＤ１３６－２は、入力された光を各波長に分類する（ステップＳ１０２）。具体的には、第２ＰＯＤ１３６－２は、ダイクロイックミラー１５０～１５２及び吸収フィルタ１５３～１５６によって、入力された光を各波長に分類する。分類された光は、光電子増倍管に入力される。
制御回路１４は、蛍光を検出したか否か判定する（ステップＳ１０３）。蛍光を検出したか否かの判定は、制御回路１４に設定されたＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値を超える電気信号が入力されたか否か、すなわち光電子増倍管に入力された光の強さが一定値を超えたか否かで行われる。光の強さが一定値を超える光が光電子増倍管に入力された場合、制御回路１４にはＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値を超える電気信号が入力される。一方、光の強さが一定値を超える光が光電子増倍管に入力されなかった場合、制御回路１４にはＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値を超える電気信号が入力されない。
制御回路１４にＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値を超える電気信号が入力された場合、制御回路１４は蛍光を検出したと判定する。一方、制御回路１４にＴｈｒｅｓｈｏｌｄ値を超える電気信号が入力されなかった場合、制御回路１４は蛍光を検出していないと判定する。なお、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ値は、光電子増倍管に印可する電圧によって異なる。
蛍光を検出した場合（ステップＳ１０３－ＹＥＳ）、制御回路１４は入力された電気信号に基づいて、蛍光の発生元が選別対象の粒子（例えば、栄養細胞、胞子）であるか否か判定する（ステップＳ１０４）。具体的には、制御回路１４は、電気信号に基づく特性が選別対象の粒子の特性を示す場合には蛍光の発生元が選別対象の粒子であると判定する。一方、制御回路１４は、電気信号に基づく特性が選別対象の粒子の特性を示さない場合には蛍光の発生元が選別対象の粒子ではないと判定する。
電気信号に基づく特性としては、スペクトル特性が挙げられる。ここで、２３０ｎｍ近傍の深紫外光では、栄養細胞の蛍光スペクトルのピークが３５０ｎｍ近傍に現れ、胞子の蛍光スペクトルのピークが３００ｎｍ近傍に現れる。そこで、制御回路１４は、電気信号に基づく特性が、上記の粒子のいずれかの特性に一致する場合には、蛍光の発生元が選別対象の粒子であると判定する。一方、制御回路１４は、電気信号に基づく特性が、上記の粒子のいずれかの特性にも一致しない場合には、蛍光の発生元が選別対象の粒子ではないと判定する。
選別対象の粒子である場合（ステップＳ１０４－ＹＥＳ）、制御回路１４は選別対象の粒子に対して電荷を印加する（ステップＳ１０５）。具体的には、制御回路１４は、選別対象の粒子を含む液滴３ができるタイミングで、対象となる粒子に電荷を印加する。なお、制御回路１４は、栄養細胞の場合にはプラスの電荷を印加し、胞子の場合にはマイナスの電荷を印加してもよい。これにより、電荷が印加された液滴３は、偏向板１６によって偏向され、ウェルプレート１８にて回収される。
その後、制御回路１４は、処理が終了したか否か判定する（ステップＳ１０６）。処理が終了した場合（ステップＳ１０６－ＹＥＳ）、粒子分取装置１００は図６の処理を終了する。
一方、処理が終了していない場合（ステップＳ１０６－ＮＯ）、粒子分取装置１００はステップＳ１０２以降の処理を実行する。
ステップＳ１０３の処理において蛍光を検出していない場合（ステップＳ１０３－ＮＯ）、又は、ステップＳ１０４の処理において選別対象の粒子ではない場合（ステップＳ１０４－ＮＯ）、粒子分取装置１００はステップＳ１０６の処理を実行する。
一方、処理が終了していない場合（ステップＳ１０６－ＮＯ）、粒子分取装置１００はステップＳ１０２以降の処理を実行する。
ステップＳ１０３の処理において蛍光を検出していない場合（ステップＳ１０３－ＮＯ）、又は、ステップＳ１０４の処理において選別対象の粒子ではない場合（ステップＳ１０４－ＮＯ）、粒子分取装置１００はステップＳ１０６の処理を実行する。
図７は、深紫外光を照射することによって得られた蛍光の検出結果を示す図である。図７では、吸収フィルタ１５５の出力先に備えられた光電子増倍管で検出された蛍光及び吸収フィルタ１５６の出力先に備えられた光電子増倍管で検出された蛍光を２次元プロットした様子が示されている。
図７（Ａ）は、深紫外光を胞子に照射することによって得られた蛍光の検出結果を示す図である。図７（Ａ）では、Ｆで示される領域において胞子の蛍光が検出されている。図７（Ｂ）は、深紫外光を栄養細胞に照射することによって得られた蛍光の検出結果を示す図である。図７（Ｂ）では、Ｅで示される領域において栄養細胞の蛍光が検出されている。
図７（Ａ）は、深紫外光を胞子に照射することによって得られた蛍光の検出結果を示す図である。図７（Ａ）では、Ｆで示される領域において胞子の蛍光が検出されている。図７（Ｂ）は、深紫外光を栄養細胞に照射することによって得られた蛍光の検出結果を示す図である。図７（Ｂ）では、Ｅで示される領域において栄養細胞の蛍光が検出されている。
図８は、顕微鏡写真と、蛍光分光光度計による分析結果を示す図である。
図８（ａ）は栄養細胞１７０のみが含まれる顕微鏡写真を表し、図８（ｃ）は栄養細胞１７０と胞子１７１が含まれる顕微鏡写真を表し、図８（ｅ）は胞子１７１のみが含まれる顕微鏡写真を表す。図８（ｂ）は図８（ａ）の状態を蛍光分光光度計によって分析した結果を表す。図８（ｄ）は図８（ｃ）の状態を蛍光分光光度計によって分析した結果を表す。図８（ｆ）は図８（ｅ）の状態を蛍光分光光度計によって分析した結果を表す。
図８（ｂ）と、図８（ｆ）とを比較すると、胞子１７１のみの方が栄養細胞１７０のみと比べて３００ｎｍ近傍に特徴が現れている。
図８（ａ）は栄養細胞１７０のみが含まれる顕微鏡写真を表し、図８（ｃ）は栄養細胞１７０と胞子１７１が含まれる顕微鏡写真を表し、図８（ｅ）は胞子１７１のみが含まれる顕微鏡写真を表す。図８（ｂ）は図８（ａ）の状態を蛍光分光光度計によって分析した結果を表す。図８（ｄ）は図８（ｃ）の状態を蛍光分光光度計によって分析した結果を表す。図８（ｆ）は図８（ｅ）の状態を蛍光分光光度計によって分析した結果を表す。
図８（ｂ）と、図８（ｆ）とを比較すると、胞子１７１のみの方が栄養細胞１７０のみと比べて３００ｎｍ近傍に特徴が現れている。
以上のように構成された粒子分取装置１００によれば、粒子の検出精度を向上させることが可能になる。以下、この効果について詳細に説明する。
粒子分取装置１００は、深紫外光を連続で出力するレーザー装置１１から出力されたレーザー光が粒子に照射されることによって得られる粒子の蛍光に基づいて粒子を分取する。ここで、本実施形態における粒子分取装置１００は、鉱物による自家蛍光が見られず、粒子が自然に蛍光を発する深紫外光を使用している。これにより、従来では検出することができなかった細胞（例えば、染色で見つけることができない胞子及び染色できない細胞等）を検出することができる。そのため、粒子の検出精度を向上させることが可能になる。
粒子分取装置１００は、深紫外光を連続で出力するレーザー装置１１から出力されたレーザー光が粒子に照射されることによって得られる粒子の蛍光に基づいて粒子を分取する。ここで、本実施形態における粒子分取装置１００は、鉱物による自家蛍光が見られず、粒子が自然に蛍光を発する深紫外光を使用している。これにより、従来では検出することができなかった細胞（例えば、染色で見つけることができない胞子及び染色できない細胞等）を検出することができる。そのため、粒子の検出精度を向上させることが可能になる。
また、従来では、レーザー発振が停止している時間には粒子を検出することができない。そのため、粒子の数え落としが多く発生してしまう場合がある。それに対して、本発明における粒子分取装置１００では、レーザー光を連続で出力するレーザー装置１１を用いる。したがって、粒子の数え落としを従来よりも減らすことができる。そのため、粒子の検出精度を向上させることが可能になる。また、粒子分取装置１００は、レーザー光が粒子に照射されることによって得られる粒子の蛍光を検出し、検出した蛍光に基づいて粒子を分取する。その結果、粒子の分取精度を向上させることが可能になる。
粒子分取装置１００では、分取対象として、染色がなされていない粒子を用いる。したがって、細胞自体の元素組成を変化させてしまうことが無い。そのため、より精度の高い元素分析が可能になる。
分取対象となる粒子の放出方式としては、ジェットインエアー方式と、フローセル方式が挙げられる。これらの放出方式のうち、フローセル方式では、用いられている材料によって深紫外光領域のレーザー光が通過できない場合があるため深紫外光領域のレーザー光を使用することができない。これに対して、ジェットインエアー方式では、深紫外光領域のレーザー光を使用することができる。そこで、本実施形態における粒子分取装置１００は、分取対象となる粒子をジェットインエアー方式で放出する。そのため、深紫外光領域のレーザー光を用いて解析が可能になる。
分取対象となる粒子の放出方式としては、ジェットインエアー方式と、フローセル方式が挙げられる。これらの放出方式のうち、フローセル方式では、用いられている材料によって深紫外光領域のレーザー光が通過できない場合があるため深紫外光領域のレーザー光を使用することができない。これに対して、ジェットインエアー方式では、深紫外光領域のレーザー光を使用することができる。そこで、本実施形態における粒子分取装置１００は、分取対象となる粒子をジェットインエアー方式で放出する。そのため、深紫外光領域のレーザー光を用いて解析が可能になる。
以下、粒子分取装置１００を用いた実験結果について説明する。
まず実験の概要として、実験方法について説明する。
＜実験試料＞
枯草菌 Bacillus megateriumの培養液二種類（vegetative, spore）
＜使用した液体培地＞
vegetative:ＮＢＲＣ No.702、spore:ＤＳＭ（Difco Sporulation Medium）
＜レーザー条件＞
Ｄｅｅｐ ＵＶ（深紫外光）、４８８ｎｍ（可視光：青レーザー）使用
なお、分取時はレーザー装置１１をＯＮ状態のままとした。
＜ソート細胞数（イベント数）＞
１、２、５、１０
＜ソーティング条件（total）＞
レーザー（１条件）×ソート細胞数（４条件）＝４条件（９６ウェルプレート：１条件４８ウェル使用）
＜ソート後の培養条件＞
vegetative：３０℃, ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ、spore：３７℃, ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ
まず実験の概要として、実験方法について説明する。
＜実験試料＞
枯草菌 Bacillus megateriumの培養液二種類（vegetative, spore）
＜使用した液体培地＞
vegetative:ＮＢＲＣ No.702、spore:ＤＳＭ（Difco Sporulation Medium）
＜レーザー条件＞
Ｄｅｅｐ ＵＶ（深紫外光）、４８８ｎｍ（可視光：青レーザー）使用
なお、分取時はレーザー装置１１をＯＮ状態のままとした。
＜ソート細胞数（イベント数）＞
１、２、５、１０
＜ソーティング条件（total）＞
レーザー（１条件）×ソート細胞数（４条件）＝４条件（９６ウェルプレート：１条件４８ウェル使用）
＜ソート後の培養条件＞
vegetative：３０℃, ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ、spore：３７℃, ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔ
＜サンプル溶液の準備＞
Bacillus megaterium（栄養細胞、vegetative cell）の培養
－ＮＢＲＣ７０２液体培地にグリセロールストック（菌株）を添加して一晩培養（３０℃、１００rpm）
－翌日、新しい培地に植え継ぐ
７ｍＬ程度の培地に対して３０μｌ程度、３時間くらいで濁り始める。
－薄濁りの段階で培養を止め、氷上に置く
－ソーティングの際は培養液を直接流す。
Bacillus megaterium（胞子、spore）の培養
－ＤＳＭ液体培地にグリセロールストック（菌株）を添加して５２時間培養（３７℃、３００rpm）
－ソーティングの際はＤＳＭ液体培地で希釈した溶液を直接流す。
＜染色条件＞
未染色でそのまま粒子分取装置１００に流してソーティングする
Bacillus megaterium（栄養細胞、vegetative cell）の培養
－ＮＢＲＣ７０２液体培地にグリセロールストック（菌株）を添加して一晩培養（３０℃、１００rpm）
－翌日、新しい培地に植え継ぐ
７ｍＬ程度の培地に対して３０μｌ程度、３時間くらいで濁り始める。
－薄濁りの段階で培養を止め、氷上に置く
－ソーティングの際は培養液を直接流す。
Bacillus megaterium（胞子、spore）の培養
－ＤＳＭ液体培地にグリセロールストック（菌株）を添加して５２時間培養（３７℃、３００rpm）
－ソーティングの際はＤＳＭ液体培地で希釈した溶液を直接流す。
＜染色条件＞
未染色でそのまま粒子分取装置１００に流してソーティングする
次に、図９～図１５を用いて実験結果について説明する。
図９～図１５は、実験結果の具体例を示す図である。図９はvegetative cell（栄養細胞）の分取結果を表し、図１０はspore（胞子）の分取結果を表す。図９及び図１０において、vegetative cellのソーティング領域は領域Ｂであり、sporeのソーティング領域は領域Ａである。図９において領域Ｂの密度が高いことを表し、図１０において領域Ａの密度が高いことを表す。
図９～図１５は、実験結果の具体例を示す図である。図９はvegetative cell（栄養細胞）の分取結果を表し、図１０はspore（胞子）の分取結果を表す。図９及び図１０において、vegetative cellのソーティング領域は領域Ｂであり、sporeのソーティング領域は領域Ａである。図９において領域Ｂの密度が高いことを表し、図１０において領域Ａの密度が高いことを表す。
vegetative cellを０．２μｍ孔径のポリカーボネートメンブレンにソーティング後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色し、顕微鏡観察を行った結果を図１１に示す。図１１は、４０倍率の対物レンズを介して撮影した図である。
また、Vegitative cellをソーティング後、一晩培養。ソート細胞数「１」の培養液をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色し、顕微鏡観察を行った結果を図１２に示す。図１２は、４０倍率の対物レンズを介して撮影した図である。
また、Vegitative cellをソーティング後、一晩培養。ソート細胞数「１」の培養液をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色し、顕微鏡観察を行った結果を図１２に示す。図１２は、４０倍率の対物レンズを介して撮影した図である。
Sporeをメンブレンにソーティング後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色し、顕微鏡観察を行った結果を図１３に示す。図１３は、４０倍率の対物レンズを介して撮影した図である。
また、Sporeをソーティング後、一晩培養。ソート細胞数「１」の培養液をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色し、顕微鏡観察を行った結果を図１４に示す。図１４は、４０倍率の対物レンズを介して撮影した図である。
また、Sporeをソーティング後、一晩培養。ソート細胞数「１」の培養液をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色し、顕微鏡観察を行った結果を図１４に示す。図１４は、４０倍率の対物レンズを介して撮影した図である。
生細胞割合の測定結果（液体培地へのソーティング結果）を図１５に示す。図１５に示すように、ソーティング用胞子液中の細胞は、全てが培養可能ではなかったことが分かる。
・ソーティング用胞子液の全菌数（顕微鏡による計数）：１．３４×１０＾６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
・寒天培地（ＮＢＲＣ７０２組成）で増殖可能な細胞の数（コロニーカウント）：９．１０×１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
→ソーティング用胞子液中の培養可能な細胞の割合：６４．６％
・ソーティング用胞子液の全菌数（顕微鏡による計数）：１．３４×１０＾６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
・寒天培地（ＮＢＲＣ７０２組成）で増殖可能な細胞の数（コロニーカウント）：９．１０×１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
→ソーティング用胞子液中の培養可能な細胞の割合：６４．６％
上記から、胞子液中には元々６４．６％の生細胞が含まれていて、その胞子液を用いて行ったソーティングの結果として６０．４％の細胞が生存していた。すなわち、ソーティングの操作を行った前後の生細胞比率を比較すると９３．５％であり、大部分の胞子がソーティングによる影響を受けないことが分かる。また、栄養細胞においては、ソーティングの結果として１００％の細胞が生存していた。すなわち、ソーティング後の生細胞比率は１００％であり、栄養細胞がソーティングによる影響を受けないことが分かる。
＜変形例＞
本実施形態では、レーザー装置１１として、可視光領域のレーザー光を連続で出力する第１レーザー装置１１－１、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力する第２レーザー装置１１－２、紫外光領域のレーザー光を連続で出力する第３レーザー装置１１－３の３つを示したが、これに限定される必要はない。例えば、レーザー装置１１として、１台の深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置１１（例えば、第２レーザー装置１１－２）のみが用いられてもよい。また、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置１１が含まれていれば、他のレーザー装置１１が出力するレーザー光の領域の組み合わせはどの領域の組み合わせであってもよい。
本実施形態では、レーザー装置１１として、可視光領域のレーザー光を連続で出力する第１レーザー装置１１－１、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力する第２レーザー装置１１－２、紫外光領域のレーザー光を連続で出力する第３レーザー装置１１－３の３つを示したが、これに限定される必要はない。例えば、レーザー装置１１として、１台の深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置１１（例えば、第２レーザー装置１１－２）のみが用いられてもよい。また、深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置１１が含まれていれば、他のレーザー装置１１が出力するレーザー光の領域の組み合わせはどの領域の組み合わせであってもよい。
本実施形態では、電荷が印加された液滴３を回収する機構としてウェルプレートを例に説明したが、液滴３を回収する機構はチューブまたはプラスチック容器であってもよい。
本実施形態では、粒子が、染色がなされていない、又は、染色ができない粒子を例に説明した。しかしながら、粒子分取装置１００に用いられる粒子は、染色された粒子であってもよい。
本実施形態では、粒子が、染色がなされていない、又は、染色ができない粒子を例に説明した。しかしながら、粒子分取装置１００に用いられる粒子は、染色された粒子であってもよい。
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
１０…ノズル， １１…レーザー装置， １１－１…第１レーザー装置， １１－２…第２レーザー装置， １１－３…第３レーザー装置， １２－１、１２－２、１２－３…フォーカスレンズ， １３…検出部， １４…制御回路， １５…表示部， １６…偏向板， １７…廃液タンク， １８…ウェルプレート， １９…撮影装置， １３１…対物レンズ， １３２…チューブレンズ， １３３…ピンホール板， １３４…プリズム， １３５－１、１３５－２、１３５－３…コリメーションレンズ， １３６－１…第１ＰＯＤ， １３６－２…第２ＰＯＤ， １３６－３…第３ＰＯＤ， １３７～１４２、１５０～１５２、１５７～１５９…ダイクロイックミラー， １４３～１４９、１５３～１５６、１６０～１６３…吸収フィルタ
Claims (6)
- 深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置と、
前記レーザー装置から出力された前記深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる前記粒子の蛍光を検出する検出部と、
検出された前記蛍光に基づいて、前記粒子を分取する制御回路と、
を備える粒子分取装置。 - 前記深紫外光領域は、前記深紫外光領域のうち無機鉱物による自家蛍光が見られない領域である、請求項１に記載の粒子分取装置。
- 前記深紫外光領域は、２３０ｎｍ近傍の領域である、請求項１又は２に記載の粒子分取装置。
- 前記粒子は、ジェットインエアー方式で放出される、請求項１から３のいずれか一項に記載の粒子分取装置。
- 深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置から出力された前記深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる前記粒子の蛍光を検出する検出ステップと、
検出された前記蛍光に基づいて、前記粒子を分取する分取ステップと、
を有する粒子分取方法。 - 深紫外光領域のレーザー光を連続で出力するレーザー装置から出力された前記深紫外光領域のレーザー光が粒子に照射されることによって得られる前記粒子の蛍光を検出する検出ステップと、
検出された前記蛍光に基づいて、前記粒子を分取する分取ステップと、
をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
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| JP2019090838A JP2022107070A (ja) | 2019-05-13 | 2019-05-13 | 粒子分取装置、粒子分取方法及びコンピュータプログラム |
| PCT/JP2020/018955 WO2020230779A1 (ja) | 2019-05-13 | 2020-05-12 | 粒子分取装置、粒子分取方法及びコンピュータプログラム |
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