CN110023741B - 生物粒子计数系统以及生物粒子计数方法 - Google Patents

生物粒子计数系统以及生物粒子计数方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供生物粒子计数系统以及生物粒子计数方法。生物粒子计数系统，与非生物粒子区分地高精度对生物粒子进行计数。前段照射部(2)在生物粒子计数部(1)的前段对成为流体的试样照射紫外线。该外线是使生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域的紫外线。并且，生物粒子计数部(1)测定包含第一自身荧光物质的荧光波长的第一波长范围的光强度，并且测定特定的第二波长范围的光强度，基于测定出的第一波长范围的光强度和测定出的特定的第二波长范围的光强度，与流体内的非生物粒子区分地对生物粒子进行计数。

Description

生物粒子计数系统以及生物粒子计数方法
技术领域
本发明涉及生物粒子计数系统以及生物粒子计数方法。
背景技术
某一液中荧光检测装置，向池内的液体照射激励光，检测比拉曼散射光的波段长的第一荧光波段以及比拉曼散射光的波段短的第二荧光波段的光，在第一荧光波段的光强度大于第二荧光波段的光强度的情况下，判定为液体中含有生物粒子，在第二荧光波段的光强度大于第一荧光波段的光强度的情况下，判定为液体中含有非生物粒子(例如参照专利文献1)。
另一方面，某一生物粒子计数器，作为生物粒子测定的预处理，通过对试样照射UV-C波长范围的紫外线，使因激励光而引起的生物粒子的自身荧光强度增加，对一个特定波段的荧光进行检测，将检测到的荧光的光强度与阈值进行比较来检测生物粒子(例如参照专利文献2)。
专利文献1：日本专利公开公报特开2016-080673号
专利文献2：日本专利公开公报特开2014-153199号
但是，由于各个生物粒子的荧光微弱，所以会被埋没到背景噪声中，在专利文献1的液中荧光检测装置中，有时无法检测到各个生物粒子以及荧光。此外，如图2(无紫外线照射)所示，根据细菌的种类，有时第一荧光波段和第二荧光波段的荧光强度的大小关系相反。
另一方面，在专利文献2的生物粒子计数器中，在试样内还包含通过对生物粒子照射的激励光而发出荧光的非生物粒子的情况下，有时无法与非生物粒子区分地检测生物粒子。
因而，在上述的技术中，有时难以与非生物粒子区分地高精度对生物粒子进行计数。
发明内容
本发明是鉴于上述的问题而完成的，其目的在于提供一种与非生物粒子区分地高精度对生物粒子进行计数的生物粒子计数系统以及生物粒子计数方法。
本发明的生物粒子计数系统具备：生物粒子计数部，对流体照射激励光，对流体内的生物粒子的自身荧光进行检测，对流体内的生物粒子进行计数；以及前段照射部，设置在生物粒子计数部的前段，对成为流体的试样照射紫外线。并且，该紫外线是使生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域的紫外线，生物粒子计数部测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光波长的第一波长范围的光强度，并且测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的自身荧光物质的荧光波长的特定的第二波长范围的光强度，基于测定出的第一波长范围的光强度和测定出的特定的第二波长范围的光强度，与流体内的非生物粒子区分地对生物粒子进行计数，所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度中的至少一方为规定的阈值以下的情况下，不论测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度如何，都不对所述生物粒子进行计数，所述规定的阈值被分别设定为与由所述紫外线的照射而引起的所述第一波长范围内的光强度的增加量以及所述第二波长范围内的光强度的增加量对应的值。
本发明的生物粒子计数方法包括：在生物粒子计数部的前段对试样照射紫外线的步骤；以及使照射紫外线后的试样作为流体流入生物粒子计数部，在生物粒子计数部中对流体照射激励光，对流体内的生物粒子的自身荧光进行检测，对流体内的生物粒子进行计数的步骤。并且，该紫外线是使生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域的紫外线，在生物粒子计数部中，测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光波长的第一波长范围的光强度，并且测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的自身荧光物质的荧光波长的特定的第二波长范围的光强度，基于测定出的第一波长范围的光强度和测定出的特定的第二波长范围的光强度，与流体内的非生物粒子区分地对生物粒子进行计数，所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度中的至少一方为规定的阈值以下的情况下，不论测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度如何，都不对所述生物粒子进行计数，所述规定的阈值被分别设定为与由所述紫外线的照射而引起的所述第一波长范围内的光强度的增加量以及所述第二波长范围内的光强度的增加量对应的值。
根据本发明，与非生物粒子区分地高精度对生物粒子进行计数。
附图说明
图1是表示本发明的实施方式1的生物粒子计数系统的结构的框图。
图2是表示对特定的细菌A、B、C进行紫外线照射而引起的荧光光谱的变化的图。
图3是表示非生物粒子(硅粒子)的荧光光谱的图。
图4是表示对特定的细菌A、B、C进行紫外线照射而引起的荧光光谱的变化(除去拉曼散射光分量的荧光光谱)的图。
图5是表示非生物粒子(硅粒子)的荧光光谱(除去拉曼散射光分量的荧光光谱)的图。
图6是表示图1中的生物粒子计数器1的结构的框图。
图7是对实施方式1中的第一测定信号、第二测定信号和第三测定信号进行说明的时序图。
图8是表示本发明的实施方式4的生物粒子计数系统的结构的框图。
图9是表示本发明的实施方式5的生物粒子计数系统中的前段照射部51的一例的图。
具体实施方式
以下，基于附图对本发明的实施方式进行说明。
实施方式1.
图1是表示本发明的实施方式1的生物粒子计数系统的结构的框图。实施方式1的生物粒子计数系统具备生物粒子计数器1、前段照射部2以及试样流动调整部3。
生物粒子计数器1对作为试样的流体照射测定光(激励光)，对流体内的生物粒子的自身荧光进行检测，对该流体内的生物粒子进行计数。生物粒子计数器1能够对例如0.1μm～几百μm大小的生物粒子进行计数。具体而言，计数对象的生物粒子为细菌、酵母、霉菌等。生物粒子的细胞包含发出自身荧光的特定的自身荧光物质(核黄素等的黄素类等)。因而，通过检测该自身荧光，能够对生物粒子进行计数。
此外，前段照射部2设置在生物粒子计数器1的前段，对成为流入生物粒子计数器1的流体的试样照射特定波长的紫外线。
此外，试样流动调整部3利用泵、阀等调整从生物粒子计数器1流出的试样(即，向生物粒子计数器1流入的试样)的流量，将生物粒子计数器1对生物粒子的计数完成的试样排出。
如图1所示，实施方式1的生物粒子计数系统是分批方式的计数系统，前段照射部2具备：具有贮存试样水101的容器的贮存部21；对贮存部21内的试样水101发出上述的紫外线的光源22；以及将贮存部21内的试样水101作为流体而向生物粒子计数器1供给的流路部23。
另外，在利用来自光源22的紫外线透射的材质构成贮存部21的情况下，在贮存部21的外周配置遮蔽紫外线的遮蔽材料，以免来自光源22的紫外线向外部泄漏。作为遮蔽材料，优选使用铝、聚四氟乙烯(PTFE)等的反射紫外线的材料。
光源22配置在贮存部21的容器内侧，具有发出上述的紫外线的发光部22a。例如，光源22在发光部22a的整体没入贮存部21内的试样水101的状态下向试样水101照射上述的紫外线。另外，也可以在前段照射部2设置搅拌试样的搅拌装置，以便对贮存部21内的试样水101均匀地照射紫外线。
由前段照射部2照射的紫外线是使计数对象的生物粒子内的特定的自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域(300nm以下，优选为254nm以下，更优选为185nm以下)的紫外线。在本实施方式1中，使用254nm的杀菌光线作为该紫外线。
图2是表示对特定的细菌A、B、C进行紫外线照射而引起的荧光光谱的变化的图。图3是表示非生物粒子(硅粒子)的荧光光谱的图。图4是表示对特定的细菌A、B、C进行紫外线照射而引起的荧光光谱的变化(除去拉曼散射光分量的荧光光谱)的图。图5是表示非生物粒子(硅粒子)的荧光光谱(除去拉曼散射光分量的荧光光谱)的图。
此处，细菌A是Pseudomonas属的细菌，细菌B是Sphingomonas属的细菌，细菌C是Methylobacterium属的细菌。
图2～图5表示通过实验得到的、在上述的深紫外区域的紫外线照射的有无的各个情况下相对于405nm激励光的荧光光谱等的测定结果。另外，在图2～图5所示的光强度分布中，除了荧光光谱之外，还包含散射光分量。图2和图3中的约465nm的光强度峰值源自拉曼散射光分量。除去该拉曼散射光分量后的荧光光谱如图4和图5所示。此外，图2～图5的情况下的激励光的峰值波长为405nm，在小于430nm的波长范围内包含散射光分量(或激励光分量)。
如图2以及图4所示，在细菌A、B、C的任一个荧光光谱中，通过上述的紫外线照射，在约450nm以及约500nm处形成峰值。另外，在图2以及图4中，通过上述的紫外线照射，散射光分量(或激励光分量)的光强度不增加，但由于与荧光光谱中的约450nm和约500nm的峰值对应的边缘部分，小于430nm的波长范围的光强度也通过上述的紫外线照射而增加。
自身荧光的波长具有自身荧光物质所固有的分布。例如，作为黄素类的核黄素及其辅酶类型的FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)的自身荧光的光谱，在约520nm的波长处具有峰值。此外，例如叶酸类(叶酸及其衍生物)的自身荧光的光谱在约450nm的波长处具有峰值。
因而，对于上述的约500nm的峰值，推断源自在约520nm处具有荧光峰值波长的黄素类，对于上述的约450nm的峰值，推断源自在约450nm处具有荧光峰值波长的叶酸类。
另一方面，对于非生物粒子，荧光强度不会因上述的紫外线照射而增加，无论有无紫外线照射，如图3以及图5所示，非生物粒子的荧光光谱都不发生变化。
这样，通过前段照射部2的紫外线照射，黄素类、叶酸类等特定的自身荧光物质的荧光强度增加。
接着，对生物粒子计数器1的结构进行说明。图6是表示图1中的生物粒子计数器1的结构的框图。如图6所示，生物粒子计数器1具备流动池31、发光装置32、照射光学系统33、检测光学系统34、散射光选择光学元件35、荧光光选择光学元件36、受光光学系统37a、37b、荧光受光装置38a、38b、受光光学系统39以及散射光受光装置40。
流动池31形成包含计数对象的生物粒子的流体的流路。流动池31是形成该流路的透明管状的构件，例如由合成石英、蓝宝石等构成，具有中空的四棱柱的形状。
发光装置32具备发出规定波长的光(此处为激光)的光源(例如激光二极管等的半导体发光元件)，利用该光源发出激励生物粒子的自身荧光物质的激励光。该激励光例如具有从紫外线区域到绿色的可见光区域为止的范围内的自身荧光物质所固有的波长。
例如，核黄素的激励吸收光谱在约375nm和约450nm处具有峰值。因而，例如作为用于核黄素的激励光，使用波长330nm～500nm的范围内的激光。例如，在本实施方式1中，使用405nm的激光。
照射光学系统33从与流动池31的流路中的流体的行进方向不同的方向(此处为垂直方向)对在该流路内流动的流体照射激励光。照射光学系统33例如由各种透镜(例如准直透镜、双凸透镜、柱面透镜等)构成，将来自发光装置32的激光调整为平行光线，将该平行光线作为激励光对在流路内流动的流体照射。通过对在流动池31的流路内流动的流体照射该激励光，形成检测区域。另外，也可以配置遮蔽透射流动池31后的激励光的光束挡板(光束陷阱)。
检测光学系统34使通过上述激励光的照射而从流路内的粒子发出的散射光和荧光入射到散射光选择光学元件35的规定的入射面。例如，作为检测光学系统34，使用聚光透镜，或者使用具有用于遮蔽背景光的针孔以及分别配置在该针孔的前后的聚光透镜。
在对生物粒子照射激励光的情况下，从生物粒子发出的散射光和自身荧光入射到散射光选择光学元件35的规定的入射面。另外，当在流体内包含发出与计数对象的生物粒子的自身荧光不同的荧光的非生物粒子的情况下，如果对该非生物粒子照射激励光，则该非生物粒子也会发出荧光。
另外，在试样为液体亦即水的情况下，相对于激励光而从水发出的拉曼散射光也经由检测光学系统34入射到散射光选择光学元件35。例如在激励光具有405nm的波长的情况下，从水发出的拉曼散射光的峰值波长为约465nm。
此外，在本实施方式中，由于激励光从与检测光学系统34的光轴不同的方向入射到流动池31的流路，所以侧方散射的散射光通过检测光学系统34入射到散射光选择光学元件35。
散射光选择光学元件35是使与激励光相同且比散射光的波长长的荧光波长范围的光透射，而使来自粒子的散射光的波长范围(即，激励光的波长范围)的光反射的光学元件(例如分色镜)。
荧光选择光学元件36(例如分色镜)是使透射散射光选择光学元件35的光中特定的波长范围的光与其他波长范围的光彼此分离的光学元件、且是使特定的波长范围的光透射而使其他波长范围的光反射的光学元件。
该特定的波长范围包含荧光强度的测定对象的第一波长范围。此外，该其他波长范围包含荧光强度的测定对象的特定的第二波长范围。
第一波长范围包含特定的自身荧光物质的荧光波长。
在实施方式1中，生物粒子计数器1中的上述第一波长范围包含作为特定的自身荧光物质的黄素类(核黄素、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)等)的荧光波长。
另外，通常情况下，由于自身荧光物质的荧光具有比较宽的波长分布，所以可以将第一波长范围设定为不包含特定的自身荧光物质所固有的已知的峰值波长，也可以设定为包含最接近该特定的自身荧光物质的已知的峰值波长的、生物粒子(细菌)的荧光光谱的极大值的波长。也就是说，当在其他自身荧光物质等的影响下生物粒子(细菌)的荧光光谱的极大值出现在特定的自身荧光物质所固有的峰值波长的附近的其他波长的情况下，可以将第一波长范围设为包含最接近自身荧光物质的荧光峰值波长的、荧光光谱的极大值的波长的规定宽度的波长范围。
此处，黄素类的荧光峰值波长为约520nm，但如图2以及图4所示，在520nm附近，通过紫外线照射而产生的生物粒子(细菌)的荧光光谱的极大值出现在约500nm，因此，在实施方式1中，将第一波长范围设为包含该极大值的波长500nm的规定宽度(例如±10nm)的波长范围。另外，第一波长范围当然也可以包含黄素类的荧光峰值波长(约520nm)。
另一方面，在实施方式1中，第二波长范围是在上述的激励光的波长(在实施方式1中为405nm)与第一波长范围之间，不包含通过由前段照射部2照射的紫外线而荧光强度增加的生物粒子内的自身荧光物质的荧光峰值波长的规定的波长范围。进而，在试样包含水的情况下，将第二波长范围设定在激励光的波长与拉曼散射光的峰值波长之间，使之不包含拉曼散射光的峰值波长。
在实施方式1中，由于叶酸类的荧光峰值波长为约450nm，通过紫外线照射而产生的生物粒子(细菌)的荧光光谱的极大值也出现在450nm，所以第二波长范围如图2和图4所示，以不包含叶酸类的荧光峰值波长和拉曼散射光的波长的方式设为包含430nm的规定宽度(例如±10nm)的波长范围。
受光学系统37a利用聚光透镜组将透射荧光选择光学元件36而来的特定波长范围(即，包含第一波长范围的波长范围)的光聚光到荧光用受光装置38a。受光学系统37b利用聚光透镜组将从荧光选择光学元件36反射而来的其他波长范围(即，包含第二波长范围的波长范围)的光聚光到荧光用受光装置38b。
另外，受光学系统37a、37b的一方或双方可以具有根据经由散射光选择光学元件35和荧光选择光学元件36入射的拉曼散射光的强度，切断拉曼散射光并使上述的波长范围的光透射的长通滤波器、带通滤波器或短通滤波器。
荧光受光装置38a、38b分别具有光电二极管、光电晶体管等的半导体受光元件或光电倍增管，通过半导体受光元件或光电倍增管接收聚集的光并将其转换为电信号，根据受光强度分别输出。
此外，受光学系统39利用聚光透镜组将由散射光选择光学元件35反射的光(散射光)聚光到散射光受光装置40。散射光受光装置40具有光电二极管、光电晶体管等的半导体受光元件或光电倍增管，通过半导体受光元件或光电倍增管接收聚集的散射光并将其转换为电信号，根据受光强度输出。
进而，生物粒子计数器1具备放大器41a、41b、A/D转换器42a、42b、放大器43、A/D转换器44、计数处理部45以及控制部46。放大器41a、41b将来自荧光受光装置38a、38b的电信号的电压以规定的放大率分别放大，A/D转换器42a、42b将放大后的电信号分别转换为数字信号。放大器43将来自散射光受光装置40的电信号的电压以规定的放大率放大，A/D转换器44将放大后的电信号转换为数字信号。
计数处理部45是基于与荧光对应的来自A/D转换器42a、42b的数字信号(第一测定信号和第二测定信号)以及与散射光对应的来自A/D转换器44的数字信号(第三测定信号)，对通过测定区域的生物粒子(例如按照粒径区分)进行计数的数字处理电路。
如上所述，生物粒子计数部1为，(a)使用荧光选择光学元件36、受光学系统37a、37b、荧光受光装置38a、38b等的荧光测定系统，测定上述的第一波长范围的光强度以及上述的第二波长范围的光强度，(b)使用计数处理部45，基于测定出的第一波长范围的光强度和测定出的第二波长范围的光强度，与流体内的非生物粒子区分地对生物粒子进行计数。
在实施方式1中，计数处理部45当与第一波长范围的荧光对应的第一测定信号(来自A/D转换器42a的数字信号)的值以及与第二波长范围的荧光对应的第二测定信号(来自A/D转换器42b的数字信号)的值的双方都超过规定的阈值时，判定第一测定信号的波高值是否大于第二测定信号的值，在第一测定信号的波高值大于第二测定信号的值的情况下，判定为检测到一个生物粒子，对生物粒子进行计数。该阈值与背景噪声的上限电平对应地设定为使得背景噪声电平不超过该阈值。进而，该阈值被设定为与通过上述的紫外线照射而产生的在第一波长范围内的光强度的增加量和在第二波长范围内的光强度的增加量对应的值。也就是说，在第一波长范围内的光强度的增加量以及在第二波长范围内的光强度的增加量越大，该阈值被设定为越高于背景噪声的上限电平。另外，这些增加量通过实验等预先确定。
另一方面，在实施方式1中，计数处理部45在第一测定信号和第二测定信号的值中的至少一方不超规定的阈值的情况下、以及在第一测定信号的值和第二测定信号的值的双方都超过规定的阈值但第一测定信号的波高值为第二测定信号的值以下的情况下，判定为未检测到生物粒子，不对生物粒子进行计数。
也就是说，在实施方式1中，生物粒子计数部1在测定出的第一波长范围的光强度大于测定出的第二波长范围的光强度的情况下，对生物粒子进行计数。在生物粒子的情况下，如图2和图4所示，通过前段照射部2的紫外线照射，不论生物粒子的种类如何，第一波长范围的光强度都高于第二波长范围的光强度，因此，生物粒子被可靠地作为生物粒子进行计数。另一方面，在非生物粒子的情况下，由于荧光强度低，如上所述，不会因前段照射部2的紫外线照射而增加，所以第一测定信号和第二测定信号的值中的至少一方难以超过规定的阈值，该非生物粒子难以被作为生物粒子进行计数。另外，在非生物粒子的情况下，即使第一测定信号和第二测定信号的值分别超过规定的阈值，由于第一波长范围的光强度低于第二波长范围的光强度，所以也不会被作为生物粒子进行计数。
进而，计数处理部45基于与散射光对应的第三测定信号的波高值，确定检测到的生物粒子的尺寸。
另外，在也对非生物粒子进行计数的情况下，例如，虽然未检测到生物粒子，但当与散射光对应的测定信号的波高值超过规定的阈值时，判定为检测到一个非生物粒子即可。
控制部46对计数处理部45等的内部装置进行控制，从计数处理部45取得测定结果，作为测定数据输出，或者将曲线图等显示于显示装置(未图示)。
接着，对实施方式1的生物粒子计数系统中的生物粒子的计数进行说明。
由于实施方式1的生物粒子计数系统采用分批方式，所以如图1所示，在每1次测定时，都将一定量的试样水101放入贮存部21。接着，光源22点亮，向试样水101照射上述的紫外线。由此，也以规定的强度和时间对试样水101内的生物粒子照射上述的紫外线。通过该紫外线的照射，在后段的生物粒子计数器1中，生物粒子内的黄素类等的自身荧光强度增加。
在上述的紫外线照射规定时间后，熄灭光源22，通过试样流动调整部3使试样水101流入生物粒子计数器1，生物粒子计数器1开始生物粒子的计数。生物粒子计数器1对作为流体的试样水101内的生物粒子进行计数。
在生物粒子计数器1中，发光装置32以及照射光学系统33向试样水101照射激励光。
然后，通过荧光选择光学元件36、受光学系统37a、37b、荧光受光装置38a、38b、放大器41a、41b以及A/D转换器42a、42b的荧光测定系统，将表示第一波长范围的光强度的第一测定信号和表示第二波长范围的光强度的第二测定信号输出至计数处理部45，并且通过散射光选择光学元件35、受光学系统39、散射光受光装置40、放大器43和A/D转换器44的散射光测定系统，将表示包含激励光的波长的波长范围的光强度的第三测定信号输出至计数处理部45。
图7是对实施方式1中的第一测定信号、第二测定信号和第三测定信号进行说明的时序图。
如图7所示，在各测定信号中重叠有背景噪声。在该背景噪声中，除了光学系统的背景噪声之外，还包含电背景噪声。
在对试样水101内的一个生物粒子照射激励光的情况下，在第一测定信号中，出现因通过前段照射部2的紫外线照射而增大的黄素类的自身荧光而引起的1个较大的脉冲，在第二测定信号中出现比较小的脉冲。另外，虽然因前段照射部2的紫外线照射而自身荧光增大的自身荧光物质的荧光波长峰值不在第二波长范围内，但是由于黄素类或其他自身荧光物质(叶酸类等)的宽的荧光特性，在第二测定信号中也在同一时刻出现脉冲。并且，在第三测定信号中也在同一时刻出现因与生物粒子的粒径对应的散射光引起的脉冲。
此外，在对试样水101内的一个非生物粒子照射激励光的情况下，在第一测定信号和第二测定信号中出现因非生物粒子的荧光而引起的脉冲。另外，由于该脉冲非常小，所以第一测定信号和第二测定信号的电平难以超过阈值。也就是说，由于非生物粒子的荧光强度不因前段照射部2的紫外线照射而增加，所以因非生物粒子的荧光而引起的脉冲小而难以检测。进而，在第三测定信号中出现因与非生物粒子的粒径对应的散射光而引起的脉冲。
计数处理部45将上述的第一测定信号、第二测定信号和第三测定信号的电平分别持续与阈值Th1～Th3进行比较。
在第一测定信号的电平和第二测定信号的电平分别超过阈值Th1、Th2的情况下，计数处理部45当第一测定信号的波高值Vpeak1(即，极大值)大于第二测定信号的波高值Vpeak2时，对一个生物粒子进行计数。
也就是说，在对试样水101内的一个生物粒子照射激励光的情况下，由于第一测定信号的电平和第二测定信号的电平分别超过阈值Th1、Th2、且第一测定信号的波高值Vpeak1大于第二测定信号的波高值Vpeak2，所以对该一个生物粒子进行计数。
另一方面，在对试样水101内的一个非生物粒子照射激励光的情况下，如图3以及图5所示，非生物粒子的荧光强度不增加，在第一测定信号和第二测定信号中不出现有意义的脉冲，第一测定信号的电平和第二测定信号的电平中的至少一方不超过阈值Th1、Th2，因此，该一个非生物粒子不会被作为生物粒子进行计数。另外，即使在第一测定信号的电平和第二测定信号的电平分别超过阈值Th1、Th2的情况下，由于第一测定信号的波高值Vpeak1小于第二测定信号的波高值Vpeak2，所以该一个非生物粒子不被作为生物粒子进行计数。
另外，在不对试样水101内的生物粒子和非生物粒子中的任意一方照射激励光的情况下，由于第一测定信号的电平和第二测定信号的电平不超过阈值Th1、Th2，所以不对生物粒子进行计数。
进而，计数处理部45基于与因上述一个生物粒子而引起的第一测定信号和第二测定信号的脉冲相同时刻得到的第三测定信号的脉冲的波高值Vpeak3，确定该一个生物粒子的尺寸(粒径)。
如以上那样，根据上述实施方式1，前段照射部2在生物粒子计数部1的前段，对成为流体的试样照射紫外线。该紫外线是使生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域的紫外线。并且，生物粒子计数部1测定包含第一自身荧光物质的荧光波长的第一波长范围的光强度和特定的第二波长范围的光强度，并基于测定出的第一波长范围的光强度和测定出的特定的第二波长范围的光强度，与流体内的非生物粒子区分地对生物粒子进行计数。
特别是在实施方式1中，第二波长范围被设为在激励光的波长与第一波长范围之间，不包含因紫外线而荧光强度增加的生物粒子内的自身荧光物质的荧光峰值波长的规定的波长范围，生物粒子计数部1在测定出的第一波长范围的光强度大于测定出的第二波长范围的光强度的情况下，对生物粒子进行计数。
由此，与非生物粒子区分而高精度地对生物粒子进行计数。
也就是说，如图2～图5所示，在不照射上述的紫外线的情况下，由于生物粒子(细菌)的第一波长范围的光强度和第二波长范围的光强度的高低关系根据生物粒子的种类而不一定，有时会与非生物粒子的第一波长范围的光强度和第二波长范围的光强度的高低关系一致，所以有时无法准确地区分非生物粒子和生物粒子，但在照射上述的紫外线的情况下，由于生物粒子(细菌)的第一波长范围的光强度和第二波长范围的光强度的高低关系一定，所以能够准确地区分非生物粒子和生物粒子。
实施方式2.
在实施方式2的生物粒子计数系统中，与实施方式1相同，第一波长范围包含特定的自身荧光物质的荧光波长。在实施方式2中，第一波长范围包含叶酸类的荧光波长。叶酸及其蝶吟衍生物(氨甲蝶吟)的荧光峰值波长为约450nm。通过上述前段照射部2的紫外线照射，从叶酸生成叶酸的蝶吟衍生物(氨甲蝶吟)。叶酸的荧光强度比较低，而叶酸的蝶吟衍生物的荧光强度比叶酸高。因此，通过上述前段照射部2的紫外线照射，自身荧光强度增加。因而，作为用于生物粒子的检测的自身荧光物质，代替实施方式1的黄素类，在实施方式2中使用叶酸类。
如图2以及图4所示，在细菌的荧光光谱中，源自叶酸类的极大值也在约450nm，因此，在实施方式2中，将第一波长范围设为包含450nm的规定宽度的波长范围。另外，将实施方式2的第二波长范围与实施方式1相同地设定。也就是说，实施方式2的第二波长范围被设定在第一波长范围与激励光(此处为405nm)之间。
另外，实施方式2的生物粒子计数系统的其他结构和动作与实施方式1相同，因此省略其说明。
实施方式3.
在实施方式3的生物粒子计数系统中，第一波长范围包含特定的第一自身荧光物质的荧光波长，第二波长范围包含与第一自身荧光物质不同的特定的第二自身荧光物质的荧光波长。第一自身荧光物质和第二自身荧光物质都通过前段照射部2的紫外线照射而荧光强度增加。在本实施方式3中，第一自身荧光物质是上述的黄素类，第二自身荧光物质是上述的叶酸类。并且，在实施方式3中，计数处理部45在测定出的第一波长范围的光强度与测定出的第二波长范围的光强度的差在规定范围内的情况下，对生物粒子进行计数。另外，实施方式3中的第一波长范围和第二波长范围与相应的自身荧光物质对应，与实施方式1的第一波长范围和实施方式2的第一波长范围相同地设定。
另外，实施方式3的生物粒子计数系统的基本结构与实施方式1相同，因此省略其说明。
接着，对实施方式3的生物粒子计数系统的生物粒子的计数进行说明。
在对试样水101内的一个生物粒子照射激励光的情况下，在第一测定信号中出现因通过前段照射部2的紫外线照射而增大的黄素类的自身荧光引起的1个大的脉冲，在第二测定信号中也出现因通过前段照射部2的紫外线照射而增大的叶酸类的自身荧光引起的1个大的脉冲。
计数处理部45将上述的第一测定信号、第二测定信号和第三测定信号的电平持续与阈值Th1～Th3进行比较。
在第一测定信号的电平和第二测定信号的电平分别超过阈值Th1、Th2的情况下，计数处理部45当第一测定信号的波高值(也就是极大值)与第二测定信号的波高值的差分在规定范围内(例如规定的阈值以下)时，对一个生物粒子进行计数。
在对试样水101内的一个生物粒子照射激励光的情况下，由于第一测定信号的电平和第二测定信号的电平分别超过阈值Th1、Th2、且不论生物粒子的种类如何，第一测定信号的波高值和第二测定信号的波高值都相同程度地变高，所以两者的差分在规定范围内，对该一个生物粒子进行计数。
另一方面，在对试样水101内的一个非生物粒子照射激励光的情况下，由于第一测定信号的电平和第二测定信号的电平中的至少一方不超过阈值Th1、Th2，所以该一个非生物粒子不被作为生物粒子进行计数。
在不对试样水101内的生物粒子和非生物粒子中的任意一方照射激励光的情况下，由于第一测定信号的电平和第二测定信号的电平不超过阈值Th1、Th2，所以不对生物粒子进行计数。
另外，实施方式3的生物粒子计数系统的其他动作与实施方式1相同，因此省略其说明。
如以上那样，在上述实施方式3中，将第二波长范围设为包含与第一自身荧光物质不同的、通过紫外线而荧光强度增加的生物粒子内的第二自身荧光物质的荧光波长的规定的波长范围，生物粒子计数部1在测定出的第一波长范围的光强度与测定出的第二波长范围的光强度的差分在规定范围内的情况下，对生物粒子进行计数。
由此，与非生物粒子区分而高精度地对生物粒子进行计数。
也就是说，如图2以及图4所示，在不照射上述的紫外线的情况下，由于生物粒子(细菌)的第一波长范围的光强度与第二波长范围的光强度的差的偏差大，所以有时无法准确地区分非生物粒子和生物粒子，但在通过前段照射部2照射上述的紫外线的情况下，不论生物粒子(细菌)的种类如何，第一波长范围的光强度与第二波长范围的光强度的差变为大致相同程度，能够准确地区分非生物粒子和生物粒子。
实施方式4.
图8是表示本发明实施方式4的生物粒子计数系统的结构的框图。实施方式4的生物粒子计数系统是连续方式的计数系统。因而，实施方式4的生物粒子计数系统具备连续方式用的前段照射部51，在实施方式4中，当生物粒子计数器1连续地对试样流体内的生物粒子进行计数时，在流入生物粒子计数器1之前的阶段，前段照射部51对试样流体照射与实施方式1～3相同的深紫外区域的紫外线。
实施方式4的生物粒子计数器1与实施方式1～3中任一生物粒子计数器1相同。
实施方式4的前段照射部51具备：发出紫外线的光源61；在光源61的周围流通试样流体的流路部62；以及覆盖光源61和流路部62的外周并反射或吸收紫外线的遮蔽部63。
光源61与实施方式1～3的光源22相同。在实施方式4中，流路部62为石英管等的管状构件，具有沿着光源61的发光部61a延伸的U状的流路部。遮蔽部63由铝、聚四氟乙烯(PTFE)等的反射紫外线的材料构成，通过利用遮蔽部63覆盖光源61和流路部62的外周，使来自光源61的紫外线难以泄漏到外部并且高效地照射到流路部62。另外，遮蔽部63可以是收纳光源61和流路部62的壳体，遮蔽部63也可以覆盖收纳光源61和流路部62的壳体的外周。
另外，在从光源61照射紫外线而光源61的周围的空气(外部空气)产生臭氧的情况下，优选将遮蔽部63设为例如箔状，将光源61与流路部62紧密地配置以使光源61以及流路部62与遮蔽部63之间的空间变小。此外，也可以将遮蔽部63与光源61的接合部分以及遮蔽部63与流路部62的接合部分密闭，以免在遮蔽部63的内侧产生的臭氧向外部空气泄漏。
接着，对实施方式4的生物粒子计数系统的生物粒子的计数进行说明。
实施方式4的生物粒子计数系统由于采用连续方式，因此将试样作为流体流通而连续地进行基于前段照射部51的紫外线照射以及基于生物粒子计数器1的生物粒子的计数。此处，试样为水。
首先，通过试样流动调整部3，在分流部52使试样水从主流路(例如水管)分支，流入前段照射部51，并且光源61点亮，在试样水在流路部62中流动的期间，对该试样水照射上述的紫外线。由此，对试样水照射与试样水的流速以及流路部62的长度对应的规定时间的上述的紫外线。另外，此时，不对试样水进行曝气。由此，与实施方式1～3相同，试样流体内的特定的自身荧光物质的荧光强度增加。
然后，在前段照射部51的流路部62中流动并被照射规定时间的上述的紫外线的试样水，流入生物粒子计数器1。生物粒子计数器1对试样水内的生物粒子进行计数。此时，由于生物粒子的自身荧光强度增加，所以能够高精度对试样水内的生物粒子进行计数。
另外，由于实施方式4的生物粒子计数系统的其他构成要素的结构和动作与实施方式1～3的任一个相同，因此省略其说明。但是，在实施方式4中，如果基于主流路的水压、分流部52等，能够调整在前段照射51和生物粒子计数器1中流通的流量，则也可以不设置试样流动调整部3。
如以上那样，根据上述实施方式4，在生物粒子计数器1的前段设置有连续方式的前段照射部51，对试样流体照射使生物粒子的特定的自身荧光强度增加的紫外线。由此，能够实时与非生物粒子区分而高精度地对生物粒子进行计数。
实施方式5.
本发明实施方式5的生物粒子计数系统是改变了实施方式4的前段照射部51的系统。图9是表示本发明实施方式5的生物粒子计数系统前段照射部51的一例的图。图9的(A)是表示实施方式5的前段照射部51的一例的侧视图，图9的(B)是表示实施方式5的流路部71的一例的仰视图。
在实施方式5的前段照射部51中，代替流路部62而设置流路部71。流路部71是直立的圆筒状的壳体，能够沿着内侧的中心轴收纳光源61。即，在实施方式5中，试样水流入流路部71的下部，一边与光源61接触一边流通，从流路部71的上部流出。另外，在本实施方式5中，也与其他实施方式相同，不对试样水进行曝气。
在流路部71的底面附近设置有流入口71a，在流路部71的规定高度的位置设置有流出口71b。流出口71b设置在比流入口71a高的位置且与发光部61a的上端大体相同或比上端高的位置。此外，流入口71a和流出口71b沿着流路部71的外周面的切线方向设置在从流路部71的中心轴沿着径向离开的规定的位置。由此，从流入口71a流入的试样水当在光源61的发光部61a的周围呈螺旋状流动时，从流出口71b流出。
此外，在流路部71的外周面设置有遮蔽部72，该遮蔽部72覆盖光源61和流路部71的外周并反射或吸收紫外线。遮蔽部72是与遮蔽部63相同的材料。
另外，由于实施方式5的生物粒子计数系统的其他的构成要素的结构和动作与实施方式4相同，因此省略其说明。
实施方式6.
在本发明的实施方式6的生物粒子计数系统中，生物粒子计数部1测定上述的第一波长范围的光强度和第二波长范围的光强度，并且测定第一波长范围和第二波长范围以外的至少一个追加波长范围的光强度，基于测定出的第一波长范围的光强度、测定出的第二波长范围的光强度和测定出的追加波长范围的光强度，与流体内的非生物粒子区分开而对生物粒子进行计数。
例如，第一波长范围包含与上述相同的特定的第一自身荧光物质的荧光波长，第二波长范围与实施方式3相同，包含与第一自身荧光物质不同的特定的第二自身荧光物质的荧光波长，在将追加波长范围设为与实施方式1的第二波长范围相同的情况下，当测定出的第一波长范围的光强度高于测定出的追加波长范围的光强度、且测定出的第一波长范围的光强度与测定出的第二波长范围的光强度的差分在规定范围内时，对生物粒子进行计数，否则不对生物粒子进行计数。
此外，例如第一波长范围包含与上述相同的特定的第一自身荧光物质的荧光波长，第二波长范围与实施方式3相同，包含与第一自身荧光物质不同的特定的第二自身荧光物质的荧光波长，在将追加波长范围设为与实施方式1的第二波长范围相同(比第一波长范围短的波长)，另一追加波长范围是比第一波长范围长的波长，例如如图2所示，在第一波长范围包含黄素类的500nm的波长时，另一追加波长范围是包含光强度的下降倾斜部分的520nm的范围。并且，当测定出的第一波长范围的光强度高于测定出的两个追加波长范围的光强度、且测定出的第一波长范围的光强度与测定出的第二波长范围的光强度的差分在规定范围内时，对生物粒子进行计数，否则不对生物粒子进行计数。
此外，例如生物粒子计数部1可以基于相对于波长的光强度的特性中的、测定出的第一波长范围的光强度与测定出的特定的第二波长范围的光强度所产生的斜率(第一波长范围和第二波长范围之间的波长差与光强度差之比)、和测定出的第一波长范围的光强度与测定出的追加波长范围的光强度所产生的斜率(第一波长范围和各追加波长范围之间的波长差与光强度差之比)，与流体内的非生物粒子区分开而对生物粒子进行计数。在该情况下，例如，如果全部的斜率都分别在对应的规定范围内，则对生物粒子进行计数，否则不对生物粒子进行计数。
另外，由于实施方式6的生物粒子计数系统的其他的构成要素的结构和动作与实施方式1～5的任一个相同，因此省略其说明。
如以上那样，根据上述实施方式6，测定3个波长范围以上的光强度，基于这些光强度，与非生物粒子区分而高精度地对生物粒子进行计数。
另外，针对上述的实施方式的各种变更和修正，对本领域技术人员而言是显而易见的。可以在不脱离本发明的主旨和范围且不削弱预期效果的情况下进行这样的变更和修正。即，这样的变更和修正旨在包含在权利要求的范围内。
例如在上述实施方式1～6中，将试样设为液体，但是也可以是气体(空气等)。
此外，在上述实施方式1～6中，作为生物粒子内通过上述的紫外线照射而荧光强度增加的自身荧光物质，例示了黄素类和叶酸类，但是也可以利用其他的自身荧光物质。
此外，在上述实施方式1～6中，在无需测定非生物粒子且无需测定生物粒子的尺寸的情况下，不是特别需要散射光测定系统(散射光选择光学元件35、受光学系统39、散射光受光装置40、放大器43和A/D转换器44)。在该情况下，来自检测光学系统34的光入射到荧光选择光学元件36。
此外，在上述实施方式1～6中，前段照射部2、51与生物粒子计数器1分开设置，但是也可以将前段照射部2、51内置于生物粒子计数器1。
此外，在上述实施方式1、2中，第二波长范围可以是比第一波长范围长的波长。
产业上的可利用性
本发明例如能够应用于生物粒子的计数。
附图标记说明：
1：生物粒子计数器(生物粒子计数部的一例)；
2、51：前段照射部。

Claims (9)

1.一种生物粒子计数系统，其特征在于，
所述生物粒子计数系统具备：
生物粒子计数部，对流体照射激励光，对所述流体内的生物粒子的自身荧光进行检测，对所述流体内的所述生物粒子进行计数；以及
前段照射部，设置在所述生物粒子计数部的前段，对成为所述流体的试样照射紫外线，
所述紫外线是使所述生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域的紫外线，
所述生物粒子计数部测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的所述第一自身荧光物质的荧光波长的第一波长范围的光强度，并且测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的自身荧光物质的荧光波长的特定的第二波长范围的光强度，基于测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述特定的第二波长范围的光强度，与所述流体内的非生物粒子区分地对所述生物粒子进行计数，
所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度中的至少一方为规定的阈值以下的情况下，不论测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度如何，都不对所述生物粒子进行计数，
所述规定的阈值被分别设定为与由所述紫外线的照射而引起的所述第一波长范围内的光强度的增加量以及所述第二波长范围内的光强度的增加量对应的值。
2.根据权利要求1所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度分别高于所述阈值的情况下，基于测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度，与所述流体内的非生物粒子区分地对所述生物粒子进行计数。
3.根据权利要求1所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述第二波长范围是在所述激励光的波长与所述第一波长范围之间，不包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的所述自身荧光物质的荧光峰值波长的规定的波长范围，
所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度高于测定出的所述第二波长范围的光强度的情况下，对所述生物粒子进行计数。
4.根据权利要求3所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述流体为液体，
所述第二波长范围是在所述激励光的波长与由所述液体产生的拉曼散射光的峰值波长之间，不包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的所述自身荧光物质的荧光峰值波长的规定的波长范围。
5.根据权利要求1所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述第二波长范围是包含与所述第一自身荧光物质不同的、因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的第二自身荧光物质的荧光波长的规定的波长范围，
所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度与测定出的所述第二波长范围的光强度的差分在规定范围内的情况下，对所述生物粒子进行计数。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述生物粒子计数部测定所述第一波长范围的光强度和所述第二波长范围的光强度，并且测定所述第一波长范围和所述第二波长范围之外的至少一个追加波长范围的光强度，基于测定出的所述第一波长范围的光强度、测定出的所述第二波长范围的光强度和测定出的所述追加波长范围的光强度，与所述流体内的非生物粒子区分地对所述生物粒子进行计数。
7.根据权利要求6所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述生物粒子计数部基于光强度相对于波长的特性中、由测定出的所述第一波长范围的光强度与测定出的所述特定的第二波长范围的光强度产生的斜率、以及由测定出的所述第一波长范围的光强度与测定出的所述追加波长范围的光强度产生的斜率，与所述流体内的非生物粒子区分地对所述生物粒子进行计数。
8.根据权利要求6所述的生物粒子计数系统，其特征在于，
所述生物粒子计数部测定所述第一波长范围的光强度和所述第二波长范围的光强度，并且测定所述第一波长范围和所述第二波长范围之外的两个追加波长范围的光强度，
所述两个追加波长范围中的一方是比所述第一波长范围短的波长，
所述两个追加波长范围中的另一方是比所述第一波长范围长的波长。
9.一种生物粒子计数方法，其特征在于，
所述生物粒子计数方法包括：
在生物粒子计数部的前段对试样照射紫外线的步骤；以及
使照射所述紫外线后的所述试样作为流体流入所述生物粒子计数部，在所述生物粒子计数部中对所述流体照射激励光，对所述流体内的生物粒子的自身荧光进行检测，对所述流体内的所述生物粒子进行计数的步骤，
所述紫外线是使所述生物粒子内的第一自身荧光物质的荧光强度增加的深紫外区域的紫外线，
在所述生物粒子计数部中，测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的所述第一自身荧光物质的荧光波长的第一波长范围的光强度，并且测定包含因所述紫外线而荧光强度增加的所述生物粒子内的自身荧光物质的荧光波长的特定的第二波长范围的光强度，基于测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述特定的第二波长范围的光强度，与所述流体内的非生物粒子区分地对所述生物粒子进行计数，
所述生物粒子计数部在测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度中的至少一方为规定的阈值以下的情况下，不论测定出的所述第一波长范围的光强度和测定出的所述第二波长范围的光强度如何，都不对所述生物粒子进行计数，
所述规定的阈值被分别设定为与由所述紫外线的照射而引起的所述第一波长范围内的光强度的增加量以及所述第二波长范围内的光强度的增加量对应的值。
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