CN104215561A - 一种精确区分细胞周期的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种精确区分细胞周期的方法。本发明人根据细胞周期细胞核内DNA、RNA的变化规律以及有丝分裂期细胞核内蛋白磷酸化的特点，通过多参数同时定位细胞，运用流式细胞仪对其进行荧光检测，有效地将细胞周期准确分为G0、G1、S、G2、M五个群体。本发明首次揭示了一种精密区分细胞周期的方法、方法简单易行，解决了现有方法不能将细胞周期精确区分得不足，结果稳定可靠，适用于各种细胞的检测。

Description

一种精确区分细胞周期的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种精确区分细胞周期的分析方法。

背景技术

细胞周期是指以有丝分裂方式增殖的细胞从亲代分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程，在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。通常细胞周期由G0期、G1期、S期、G2期和M期组成，如图1。细胞在G0期处于阻留静止的状态；G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体；S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间，当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入有丝分裂期(M期)，细胞内遗传物质平均分配到两个子细胞中，并使细胞一分为二。这两个子细胞或者重新开始下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)。细胞周期是调控细胞正常生长、分裂的重要事件。细胞周期的研究有助于揭示抗肿瘤制剂的作用机制。在肿瘤细胞增殖中，细胞周期的调控失效，使细胞无限分裂；反之，若细胞周期调控正常则可迫使细胞从活跃的生长分裂期进入静止的G0期。使用流式细胞仪分析细胞周期的变化已非常普遍。流式细胞仪(Flow Cytometer)是通过光源照射高速流动状态下的细胞，检测其标记荧光染料后受激发射荧光的强度，从而获得细胞大小、内部结构、组成特性等物理和生物学特征，具有检测速度快、分析参数多、获取信息量大、灵敏度高、准确性好、方法灵活等优点。传统流式细胞仪检测细胞周期的方法是对细胞内的脱氧核糖核酸(DNA)进行分析、用核酸染料标记DNA，通过流式细胞仪所检测到的DNA含量直方图可将细胞周期分为G0/G1期、S期、G2/M期三个细胞群体。该方法基于细胞周期DNA含量变化，因为G0、G1期DNA含量相同为二倍体、G2、M期DNA含量相同为四倍体，只能粗略地把细胞周期合并为G0/G1、S、G2/M三个细胞群体，计算其比例，如图2。

综上，本领域目前缺乏能将细胞周期区分得更为准确详细，实现G0期与G1期分开，G2和M期分开的技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精确区分细胞周期的方法。

在本发明的第一方面，提供一种精确测定细胞周期的方法，所述方法包括：

(1)以DNA染料、RNA染料、荧光标记的有丝分裂磷蛋白(MPM-2)抗体(较佳地为单克隆抗体)对细胞进行染色，所述的DNA染料、RNA染料和荧光标记具有不同的发射波长；DNA染料荧光用于区分细胞核染色体的倍型，RNA染料荧光用于区分细胞中RNA的量，MPM-2的荧光标记用于区分细胞是否处于分裂期；

(2)用具有三通道或三通道以上的流式细胞仪对染色后样品进行检测分析根据细胞中DNA染料、RNA染料、荧光标记的发射波长，在流式细胞仪激光束的激发下产生不同的荧光，荧光可被光学系统收集后转化为电信号进而输送到计算机进行运算分析，根据流式细胞结果图，将细胞分为5个群体，分别为G0期、G1期、S期、G2期和M期；

较佳地，5个细胞群体中，细胞DNA量、RNA和量MPM-2表达量差异在于：若DNA含量为二倍体(2N)且RNA表达量低于整体细胞RNA量，即圈定Hochest33342标记的二倍体细胞群中PyroninY荧光强度低于整体细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)的群体，为G0期细胞群；若DNA含量为二倍体(2N)且RNA表达量开始升高，即圈定Hochest33342标记的二倍体细胞群中PyroninY荧光强度等于整体细胞的平均荧光强度的群体，为G1期细胞群；若DNA含量为四倍体(4N)且MPM-2不表达，即圈定Hochest33342标记的四倍体细胞群中MPM-2荧光阴性的群体，为G2期细胞群；若DNA含量为四倍体(4N)且MPM-2开始表达，即圈定Hochest33342标记的四倍体细胞群中MPM-2荧光阳性的群体，为M期细胞群；若DNA含量介于二倍体与四倍体之间，圈定Hochest33342标记的二倍体与四倍体之间细胞群为S期细胞群。

在一个优选例中，所述的DNA染料是：Hochest33342；和/或

所述的RNA染料是：Pyronin Y；和/或

所述的有丝分裂磷蛋白抗体的荧光标记包括：Cy5、Cy3、FITC、罗丹明、PE、PerCP、APC、PE-Cy7。

在另一优选例中，所述的方法中，用多聚甲醛(较佳地，终浓度为0.5%(w/v))的磷酸盐溶液对细胞进行固定。

在另一优选例中，所述的方法中，DNA染料荧光通道采集数据设定为线性模式，RNA染料荧光通道采集数据设定为线性模式，有丝分裂磷蛋白抗体荧光标记通道采集数据设定为对数模式。

在另一优选例中，所述的方法中，细胞获取速度保持低速，优选的≤500events/s，更佳的200-500events/s。

在另一优选例中，所述的Hochest33342的激发光波长为355nm，发射光波长为460nm；或

所述的Pyronin Y的激发光波长为488nm，发射光波长为560nm；

所述的有丝分裂磷蛋白荧光标记是Cy5，其激发光波长为633nm，发射光波长为668nm。

在另一优选例中，所述方法的步骤为：

(1)将细胞进行固定；

(2)洗涤细胞并重悬，形成单个细胞悬液；

(3)离心，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇混匀，低温过夜；

(4)按照步骤(2)所述方法用染色洗涤液洗涤；

(5)用荧光标记的有丝分裂磷蛋白抗体(较佳地浓度0.5mg/ml)对细胞染色；

(6)按照步骤(2)所述方法用染色缓冲液洗涤；

(7)重悬细胞，以Hochest33342和Pyronin Y染色；

(8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；其中Hochest33342激发发射采用355/460nm，Pyronin Y激发发射488/560nm，有丝分裂磷蛋白抗体的激发发射通道根据荧光标记种类来选择，其激发发射波长不同于Hochest33342和Pyronin Y。

在另一优选例中，所述方法的步骤为：

(1)固定：取约1×10⁷个的细胞，加入新鲜配制的固定液，终浓度为0.5%(w/v)，37℃二氧化碳培养箱孵育10分钟；

(2)洗涤：把步骤(1)所得的细胞用离心机在400g转速5分钟的条件下，离心洗涤去上清，用冷的磷酸盐缓冲液1ml重悬细胞，剧烈混匀成单个细胞；

(3)通透：将步骤(2)中的所得细胞重悬液400g离心去上清，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇1ml；一边加入一边混匀，-20℃过夜；

(4)按照步骤(2)所述方法用染色洗涤液洗涤2遍；

(5)染色：取2×10⁶个细胞，加入100ul染色洗涤液，其中含有0.2ul核磷蛋白染料偶联荧光素的有丝分裂磷蛋白抗体(浓度0.5mg/ml)，37℃孵育1h；

(6)按照步骤(2)所述方法用染色缓冲液洗涤2遍；

(7)细胞用500ul HBSS重悬，加入核酸染料Hochest33342，终浓度为2ug/ml；以及加入Pyronin Y，终浓度为2ug/ml；37℃20分钟；

(8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；其中Hochest33342激发发射采用355/460nm，Pyronin Y激发发射488/560nm，有丝分裂磷蛋白抗体的激发发射通道根据荧光素来选择，注意避开Hochest33342、Pyronin Y这两个通道即可。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒用于精确测定细胞周期，其中含有：DNA染料、RNA染料、荧光标记的有丝分裂磷蛋白抗体。

在一个优选例中，其中还含有选自以下的一种或多种试剂：细胞固定液，洗涤液，细胞通透试剂，洗涤液，Hanks’平衡盐溶液

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、细胞周期模式图。

图2、传统方法核酸染料PI单染的流式直方图，只能将细胞周期模糊区分为G0/G1、S、G2/M期。

图3、三参数同时染DNA和RNA核磷蛋白的新方法，把细胞精确分为G0、G1、S、G2、M期。

3A、DNA含量与RNA含量的二维散点图，可把G0、G1期分开；

3B、DNA含量与MPM-2表达的二维散点图，可把G2、M期分开；

3C、细胞周期DNA表达含量的直方图，S期DNA表达处于二倍体和四倍体之间。

图4、精确区分Jurkat T细胞G0、G1、S、G2、M期，并计算每个期的细胞比例。

图4A、精确区分Jurkat T细胞G0、G1期群并分别计算细胞G0、G1期比例。

图4B、精确区分Jurkat T细胞G2、M期并分别计算细胞G2、M期比例。

图4C、计算Jurkat T细胞S期比例。

图5、精确区分7721细胞G0、G1、S、G2、M期，并计算每个期的细胞比例。

图5A、精确区分7721细胞G0、G1期细胞群并分别计算细胞G0、G1期比例。

图5B、精确区分7721细胞G2、M期细胞群并分别计算7721细胞G2、M期比例。

图5C、计算7721细胞S期比例。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，根据细胞分裂周期的一般性原理，同时结合细胞中RNA生成以及有丝分裂期细胞核内蛋白发生磷酸化的特点，首次揭示了一种精密区分细胞周期的方法。同时，本发明人深入研究后，选择到了多种荧光染料和抗体标记细胞内的DNA、RNA以及有丝分裂核磷蛋白，通过观察这些荧光染料在细胞内的染色情况(荧光信号)，可准确地获得细胞内DNA、RNA以及有丝分裂期核磷蛋白的量，从而根据它们的量精确地区分细胞周期。所述方法简单易行，可获得稳定可靠的结果，适用于各种细胞的检测。

本发明首次将这三种染料同时使用，把细胞周期精确分为G0、G1、S、G2、M期五个群体。具体地，所述方法包括：(1)以DNA染料、RNA染料、荧光标记的有丝分裂核磷蛋白抗体(MPM-2)对细胞进行染色，所述的DNA染料、RNA染料和荧光标记产生的荧光信号是不同的(即激发/发射光谱显著不同)；(2)根据细胞中DNA染料、RNA染料、荧光标记的信号强度，获得细胞DNA、RNA和MPM-2表达量；若DNA含量为二倍体(2N)且RNA表达量低于整体细胞RNA量，即圈定Hochest33342标记的二倍体细胞群中PyroninY荧光强度低于整体细胞的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)群体，为G0期细胞群；若DNA含量为二倍体(2N)且RNA表达量开始升高，即圈定Hochest33342标记的二倍体细胞群中PyroninY荧光强度等于整体细胞的平均荧光强度的群体，为G1期细胞群；若DNA含量为四倍体(4N)且MPM-2不表达，即圈定Hochest33342标记的四倍体细胞群中MPM-2荧光阴性的群体，为G2期细胞群；若DNA含量为四倍体(4N)且MPM-2开始表达，即圈定Hochest33342标记的四倍体细胞群中MPM-2荧光阳性的群体，为M期细胞群；若DNA含量介于二倍体与四倍体之间，圈定Hochest33342标记的二倍体与四倍体之间细胞群为S期细胞群。

如本发明所用，所述的“DNA染料”是指可以标记细胞内的DNA的染色标记物；以所述的DNA染料处理细胞后，可通过染料所呈现的信号强度来得知细胞内的总DNA量。

如本发明所用，所述的“RNA染料”是指可以标记细胞内的RNA的染色标记物；以所述的RNA染料处理细胞后，可通过染料所呈现的信号强度来得知细胞内的总RNA量。

作为本发明的优选方式，所述的DNA染料是Hochest33342，所述的RNA染料是Pyronin Y。本发明人发现，这两种染料的组合应用，检测结果清楚、区分度非常理想。

任何可观察荧光标记和/或染色标记的仪器及方法都可应用于本发明，只要其能够识别本发明所述的多种染料或荧光标记，并能够确定染料或荧光标记的量。作为本发明的优选方式，借助流式细胞仪多通道同时采集信号的特点来实现方便的检测区分。此外，激光共聚焦显微镜等仪器也是可应用的。

作为本发明的优选方式，为了能将细胞周期区分得更为准确详细，实现G0期与G1期分开，G2和M期分开，本发明的方法采用三种染料分别为DNA染料Hochest33342、RNA染料Pyronin Y、核磷蛋白MPM-2抗体偶联荧光素，共同将细胞周期区分G0、G1、S、G2、M期这5个群体。在Hochest33342结合DNA的条件下，Pyronin Y可以作为RNA的特异性染料，由于G1期RNA表达量开始升高，而DNA仍然保持二倍体的状态，据此区分G0、G1期。细胞进入有丝分裂期后，大量蛋白直接或间接被M期促进因子(MPF)磷酸化，MPM-2抗体结合到发生磷酸化的氨基酸抗原表位(如LTPLK和FTPLQ多肽区)，MPM-2用来作为有丝分裂期(M期)的标志物，据此区分G2、M期。

用于MPM-2抗体标记的荧光标记没有特别的限制，只要其能够与DNA染料与RNA染料实现显著区分即可。例如所述的荧光标记可以是(但不限于)：Cy5、Cy3、FITC、罗丹明、PE、PerCP等等。

作为本发明的优选方式，所述的Hochest33342的激发光波长为355nm，发射光波长为460nm；或所述的Pyronin Y的激发光波长为488nm，发射光波长为560nm；所述的荧光标记是Cy5，其激发光波长为633nm，发射光波长为668nm。

本发明还提供了一种用于对外源基因进行细胞内示踪的试剂盒，所述试剂盒中含有：DNA染料、RNA染料、荧光标记的MPM-2抗体。

任何其它对于细胞染色有用的试剂都可包含在所述的试剂盒中，其它对于细胞的培养有用的试剂或培养基也可包含在所述的试剂盒中。例如，所述的试剂盒中还含有选自以下的一种或多种试剂：细胞固定液(如含多聚甲醛的磷酸盐溶液)，洗涤液，细胞通透试剂(如无水甲醇)，洗涤液，Hanks’平衡盐溶液。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有使用说明书。

本发明利用细胞周期中DNA、RNA含量变化和分裂期核蛋白磷酸化等的表达规律，用实验满足了细胞周期分为G0、G1、S、G2、M期五部分的理论要求，克服了单一参数对细胞周期定位模糊性的缺陷。目前国内外专门用于精确区分细胞周期的方法较少，本发明的方法填补了这方面的空白，为科研工作者研究细胞生长发育、开发肿瘤细胞周期抑制药物提供了便捷的工具。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

试剂

本发明所涉及的试剂，包括以下组成：

1)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)

8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

2)Hanks’平衡盐溶液(HBSS)

HBSS10×储备液：40g NaCl2.0g，KCl0.5g，Na₂HPO₄0.5g，NaHCO₃定容至500ml；

Tris1.0M储备液：Tris碱8.0g，Tris-HCl68.5g，定容至500ml，pH值为7.3；

制备100ml HBSS：

HBSS10×储备液： 10ml；

去离子水：       80ml；

Tris  1.0M       2.75ml；

CaCl₂  1.1M      170ul；

MgSO₄0.4M        200ul；

葡萄糖           220mg；

调节pH至7.4，定容至100ml。

3)染色洗涤液

含4%(w/v)BSA的PBS溶液。

4)固定液

4%(w/v)多聚甲醛的磷酸盐溶液。

5)抗体

荧光素(Cy5)标记的单克隆小鼠抗人MPM-2抗体(Anti-phospho-Ser/Thr-Pro，MPM-2)，浓度为0.5mg/ml。

方法

(1)固定：取约1×10⁷个的细胞，加入新鲜配制的固定液(多聚甲醛的磷酸盐溶液)，终浓度为0.5%(w/v)，37℃二氧化碳培养箱孵育10分钟；

(2)洗涤：把步骤(1)所得的细胞用离心机在400g转速5分钟的条件下，离心洗涤去上清，用冷的磷酸盐缓冲液1ml重悬细胞，剧烈混匀成单个细胞；

(3)通透：将步骤(2)中的所得细胞重悬液400g离心去上清，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇1ml；一边加入一边混匀，-20℃过夜；

(4)按照步骤(2)所述方法用染色洗涤液洗涤2遍；

(5)染色：取2×10⁶个细胞，加入100ul染色洗涤液，其中含有0.2ul核磷蛋白染料偶联荧光素的MPM-2抗体(浓度0.5mg/ml)，37℃孵育1h；

(6)按照步骤(2)所述方法用染色缓冲液洗涤2遍；

(7)细胞用500ul HBSS重悬，加入核酸染料Hochest33342，终浓度为2ug/ml；以及加入Pyronin Y，终浓度为2ug/ml；37℃20分钟；

(8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；其中hochest33342激发发射采用355/460nm，Pyronin Y激发发射488/560nm，MPM-2的激发发射通道根据荧光素来选择，注意避开hochest33342、Pyronin Y这两个通道即可。

本方法所需流式细胞仪需要具备3个通道，仪器需要配有紫外激光，如汞灯。流式细胞仪器设置：Pyronin Y通道采集数据设定为线性模式，Hochest33342通道采集数据设定为线性模式，MPM-2通道采集数据设定为对数模式，细胞获取速度保持低速(低于500)。

实施例1、悬浮细胞的细胞周期精确区分

以人急性T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat T)的分析为例，本发明所述的运用流式细胞仪的可精确定位细胞周期的试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)固定：取约1×10⁷个的细胞，加入新鲜配置的固定液，终浓度为0.5%(w/v)，37℃二氧化碳培养箱孵育15分钟；

2)洗涤：把步骤1)所得的细胞用离心机在400g转速5分钟的条件下，离心洗涤去上清，用冷的磷酸盐缓冲液1ml重悬细胞，混匀成单个细胞；

3)通透：将步骤(2)中的所得细胞重悬液400g离心去上清，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇1ml；一边加入一边混匀，-20℃过夜；

4)按照步骤2)所述方法用染色洗涤液洗涤2遍；

5)染色：取1×10⁶个细胞，加入100ul染色洗涤液含有0.2ul偶联荧光素的MPM-2抗体(浓度mg/ml)，37℃1h；

6)按照步骤2)所述方法用染色缓冲液洗涤2遍；

7)细胞用500ul HBSS重悬，加入核酸染料Hochest33342，终浓度为2ug/ml，Pyronin Y终浓度为2ug/ml，37℃20分钟；

8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；本实验所用流式细胞仪型号为Beckman Coulter Moflo XDP，设置：Pyronin Y用FL2，采集数据为线性模式；Hochest33342通道为FL11，采集数据设定为线性模式；MPM-2通道用FL6，采集数据设定为对数模式。细胞获取速度控制在200-500events/s。

采用上述实施例精确区分Jurkat T细胞G0、G1、S、G2、M期的方法，获得的流式细胞图如图4。其中，图4A为精确区分Jurkat T细胞G0、G1期群并分别计算细胞G0、G1期比例。图4B采用上述实施例精确区分Jurkat T细胞G2、M期并分别计算细胞G2、M期比例。图4C采用上述实施例计算Jurkat T细胞S期比例。

实施例2、贴壁细胞的细胞周期精确区分

以人肝癌细胞系(SMMG-7721)的分析为例，本发明所述的运用流式细胞仪的可精确定位细胞周期的试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)固定：细胞加胰酶37℃5分钟消化成单个悬浮细胞，取约1×10⁷个的细胞，加入新鲜配置的固定液，终浓度为0.5%(w/v)，37℃二氧化碳培养箱孵育15分钟；

2)洗涤：把步骤1)所得的细胞用离心机在400g转速5分钟的条件下，离心洗涤去上清，用冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞，混匀成单个细胞；

3)通透：将步骤(2)中的所得细胞重悬液400g离心去上清，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇1ml；一边加入一边混匀，-20℃过夜；

4)按照步骤2)所述方法用染色洗涤液洗涤2遍；

5)染色：取3×10⁶个细胞，加入100ul染色洗涤液含有0.2ul偶联荧光素的MPM-2抗体(0.5mg/ml)，37℃孵育1h；

6)按照步骤2)所述方法用染色缓冲液洗涤2遍；

7)细胞用500ul HBSS重悬，加入核酸染料Hochest33342，终浓度为2ug/ml，Pyronin Y终浓度为2ug/ml，37℃孵育20分钟；

8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；本实验所用流式细胞仪型号为Beckman Coulter Moflo XDP，设置：Pyronin Y用FL2，采集数据为线性模式；Hochest33342通道为FL11，采集数据设定为线性模式；MPM-2通道用FL6，采集数据设定为对数模式。细胞获取速度控制在200-500events/s。

采用上述实施例精确区分7721细胞G0、G1、S、G2、M期的方法，结果如图5。其中，图5A采用上述实施例精确区分7721细胞G0、G1期细胞群并分别计算细胞G0、G1期比例。本实施例中MPM-2的荧光标签(荧光素)为Cy5。图5B采用上述实施例精确区分7721细胞G2、M期细胞群并分别计算7721细胞G2、M期比例。图5C采用上述实施例计算7721细胞S期比例。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种利用流式细胞仪精确测定细胞周期的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)以DNA染料、RNA染料、荧光标记的有丝分裂磷蛋白抗体对细胞进行染色，所述的DNA染料、RNA染料和荧光标记具有不同的发射波长；

(2)用具有三通道或三通道以上的流式细胞仪对染色后样品进行检测分析；根据流式细胞结果图将细胞分为5个群体，分别为G0期、G1期、S期、G2期和M期。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA染料是：Hochest33342；和/或

所述的RNA染料是：Pyronin Y；和/或

所述的有丝分裂磷蛋白抗体的荧光标记包括：Cy5、Cy3、FITC、罗丹明、PE、PerCP、APC、PE-Cy7。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括步骤：用多聚甲醛的磷酸盐溶液对细胞进行固定。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，DNA染料荧光通道采集数据设定为线性模式，RNA染料荧光通道采集数据设定为线性模式，有丝分裂磷蛋白抗体荧光标记通道采集数据设定为对数模式。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，细胞获取速度保持低速，优选的≤500events/s，更佳的200-500events/s。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Hochest33342的激发光波长为355nm，发射光波长为460nm；或

所述的Pyronin Y的激发光波长为488nm，发射光波长为560nm；

所述的有丝分裂磷蛋白荧光标记是Cy5，其激发光波长为633nm，发射光波长为668nm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤为：

(1)将细胞进行固定；

(2)洗涤细胞并重悬，形成单个细胞悬液；

(3)离心，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇混匀，低温过夜；

(4)按照步骤(2)所述方法用染色洗涤液洗涤；

(5)用荧光标记的有丝分裂磷蛋白抗体对细胞染色；

(6)按照步骤(2)所述方法用染色缓冲液洗涤；

(7)重悬细胞，以Hochest33342和Pyronin Y染色；

(8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；其中Hochest33342激发发射采用355/460nm，Pyronin Y激发发射488/560nm，有丝分裂磷蛋白抗体的激发发射通道根据荧光标记种类来选择，其激发发射波长不同于Hochest33342和Pyronin Y。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤为：

(1)固定：取约1×10⁷个的细胞，加入新鲜配制的固定液，终浓度为0.5%(w/v)，37℃二氧化碳培养箱孵育10分钟；

(2)洗涤：把步骤(1)所得的细胞用离心机在400g转速5分钟的条件下，离心洗涤去上清，用冷的磷酸盐缓冲液1ml重悬细胞，剧烈混匀成单个细胞；

(3)通透：将步骤(2)中的所得细胞重悬液400g离心去上清，向细胞沉淀中加入冷的无水甲醇1ml；一边加入一边混匀，-20℃过夜；

(4)按照步骤(2)所述方法用染色洗涤液洗涤2遍；

(5)染色：取2×10⁶个细胞，加入100ul染色洗涤液，其中含有0.2ul核磷蛋白染料偶联荧光素的有丝分裂磷蛋白抗体，37℃孵育1h；

(6)按照步骤(2)所述方法用染色缓冲液洗涤2遍；

(7)细胞用500ul HBSS重悬，加入核酸染料Hochest33342，终浓度为2ug/ml；以及加入Pyronin Y，终浓度为2ug/ml；37℃20分钟；

(8)流式细胞仪检测，计算细胞分别处于每个期的比例；其中Hochest33342激发发射采用355/460nm，Pyronin Y激发发射488/560nm，有丝分裂磷蛋白抗体的激发发射通道根据荧光素来选择，注意避开Hochest33342、Pyronin Y这两个通道即可。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于精确测定细胞周期，其中含有：DNA染料、RNA染料、荧光标记的有丝分裂磷蛋白抗体。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，其中还含有选自以下的一种或多种试剂：细胞固定液，洗涤液，细胞通透试剂，洗涤液，Hanks’平衡盐溶液。