CN101251535A - 基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，其特征是：它是在金电极表面上覆盖有CdSe纳晶－碳纳米管－壳聚糖复合物膜，并用硅烷偶联剂处理后固定抗体的电化学发光免疫传感器。将本发明的传感器完全清洗后再浸入40μL不同浓度的待测样品(HIgG)中，在37℃下温育50分钟，然后进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(HIgG)的浓度成线性关系。本发明公开了基于纳晶复合物的电化学发光免疫传感器的制法。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，以及用该传感器作为电化学发光分析探针的免疫检测方法。
背景技术
半导体纳米晶体(NCs)由于其独特的荧光特性而广泛应用于生物标记与免疫分析中。近几年来，半导体纳晶的电致化学发光(ECL)研究引起了人们极大的兴趣。较之荧光分析，半导体纳晶的ECL通过电化学控制，不需激发光源，背景小，灵敏度高，线性范围宽，在ECL生物传感器和免疫分析中具有潜在的应用价值。但是到目前为止，基于半导体纳晶的ECL进行生物分子的检测还很少有报道，可能是由于半导体纳晶的ECL强度不如传统的发光试剂如鲁米诺和Ru(bpy)3 2+。因此，发展新的半导体纳晶材料以及提高半导体纳晶的ECL强度成为研制ECL生物传感器的当务之急。[参见：(a)Constantine，C.A.；Gattas-Asfura，K.M.；Mello，S.V.；Crespo，G.；Rastogi，V.；Cheng，T.C.；DeFrank，J.J.；Leblanc，R.M.J.Phys.Chem.B 2003，107，13762-13764.(b)Constantine，C.A.；Gattas-Asfura，K.M.；Mello，S.V.；Crespo，G.；Rastogi，V.；Cheng，T.C.；DeFrank，J.J.；Leblanc，R.M.Langmuir 2003，19，9863-9867.(c)Goldman，E.R.；Balighian，E.D.；Mattoussi，H.；Kenneth Kuno，M.；Mauro，J.M.；Tran，P.T.；Anderson，G.P.J.Am.Chem.Soc.2002，124，6378-6382.(d)Goldman，E.R.；Clapp，A.R.；Anderson，G.P.；Uyeda，H.T.；Mauro，J.M.；Medintz，I.L.；Mattoussi，H.Anal.Chem.2004，76，684-688.]
最近的研究表明，纳晶薄膜技术为研制ECL传感器提供了一种有效的方法，向CdSe或CdSe/CdS纳晶膜施加负电位能极大地提高发光强度。CdSe NCs因其具有优良的光学特性而成为ECL研究的热门材料。碳纳米管(CNTs)由于具有良好的导电性能够极大地提高半导体纳米晶体的ECL强度。此外，壳聚糖(CHIT)具有极好的成膜能力和生物相溶性，碳纳米管溶于壳聚糖已广泛用于生物传感器中。CdSe NCs/CNT-CHIT纳米复合物具有很强的ECL，良好的生物相溶性，极好的稳定性，是用于研制ECL生物传感器的良好的纳米材料，在免疫生物学和临床检验学等研究中将会有广阔的应用前景。[参见：(e)Jie，G.；Liu，B.；Pan，H.；Zhu，J.J.；Chen，H.Y.Anal.Chem.2007，79，5574-5581.(f)Poznyak，S.K.；Talapin，D.V.；Shevchenko，E.V.；Weller，H.Nano Lett.2004，4，693-698.(g)Weller，H.Angew.Chem.Int.Edit.1993，32，41-53.(h)Murray，C.B.；Norris，D.J.；Bawendi，M.G.J.Am.Chem.Soc.1993，115，8706-8715.目前，基于纳晶复合物的电化学发光免疫传感器用作免疫分析探针还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，以及用该传感器作为电化学发光分析探针的免疫检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，它是在金电极表面上覆盖有CdSe纳晶-碳纳米管-壳聚糖复合物膜，并用硅烷偶联剂处理后固定抗体的电化学发光免疫传感器。
一种制备上述基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器的方法，它由下列步骤组成：
步骤1.将一定量壳聚糖溶于含有0.05M HCl的热水(80-90℃)中，得到0.50％的壳聚糖溶液，然后过滤得到无色的滤液，多壁碳纳米管在混酸(硫酸与硝酸的体积比为3∶1)中超声氧化4小时，离心后用二次水洗涤，直至pH值为～7，然后将纯化处理后的多壁碳纳米管分散于壳聚糖溶液(0.50mg mL-1)超声15分钟，得到一均匀的黑色CNT-CHIT复合溶液，
步骤2.将0.05mM的CdSe纳晶溶液用盐酸调至pH 5.5，然后与上述步骤1得到的CNT-CHIT复合溶液以1∶3的体积比超声混合0.5小时，得到CdSe NCs/CNT-CHIT复合溶液，备用，
步骤3.将4mm直径金电极依次用1.0，0.3和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，再用二次水冲洗干净，然后将电极置于在0.5M H2SO4溶液中，在-0.2～1.6V下扫描至循环伏安曲线稳定，
步骤4.将步骤3的金电极冲洗干净，待电极干燥后取10μL步骤2的CdSeNCs/CNT-CHIT混合溶液滴在电极表面于空气中凉干，然后浸在质量百分比浓度为1-3％的硅烷偶联剂KH550的水溶液中0.5-2小时，二次水冲干净后浸入2.5-5％的戊二醛(GLD)溶液中10-20min，
步骤5.将步骤4的电极冲洗干净后浸入到0.5-1mg/mL的羊抗人IgG的50mM磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中反应12-20小时，然后用50mM的磷酸缓冲液冲洗干净，浸入质量百分浓度为2-3％的牛血清蛋白(BSA)中封闭1-2小时，即制得基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器。
一种采用基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器作为电化学发光分析探针的免疫检测方法，它由下列步骤组成：
步骤1.将上述方法制得的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器清洗后再浸入40μL要检测的样品(人的IgG)，在37℃下温育50分钟，
步骤2.电化学发光(ECL)免疫检测：将步骤1处理后的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器清洗，在含有0.1M K2S2O8和0.1M KCl的0.1M PBS(pH 7.4)缓冲液中，进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(HIgG)的浓度成线性关系。
所述的电化学发光测试是以修饰好的金电极(基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器)为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在0到-1.5V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为500～700V。
本发明中CNT-CHIT比CNTs具有更开放的多空结构(扫描电子显微镜图1A，1B)，使复合的CdSeNCs ECL不仅能在修饰电极和溶液界面产生，而且能在膜的内部产生，极大的提高了发光强度。而且，CdSe NCs/CNT-CHIT具有极好的生物相溶性和稳定性，是组装ECL免疫传感器的良好材料。KH550不仅用作ECL传感器组装过程中固定抗体的偶联剂，而且因氨基功能团的催化效应能够极大的增强ECL(见图2)。ECL检测表明抗原浓度在0.02到200ng/mL范围内，ECL强度随着浓度的增大而降低，与浓度的对数成线性关系(见图2中的插图)，检测限达到0.001ng/mL。
本发明的电化学发光传感器表现出了优良的准确性、高灵敏性，稳定性与重现性，免疫分析检测迅速、方便，可用于实际样品的检测。
附图说明
图1为本发明中CNTs(A)与CNT-CHIT(B)的扫描电子显微镜(SEM)表征结果。
图2采用电化学发光技术，在检测范围内，一系列不同浓度的人的IgG(0，0.02，0.1，0.5，2，10，50，100，200ng mL-1)的光学免疫分析结果，及标准曲线。
具体实施方式
实施例1.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
首先将直径4mm金电极依次用1.0，0.3和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，二次水冲净后置于在0.5M H2SO4溶液中，在-0.2～1.6V下扫描至循环伏安曲线稳定。取10μL CdSe NCs/CNT-CHIT混合溶液滴在电极表面于空气中凉干，然后浸在质量百分比浓度为3％的硅烷偶联剂KH550的水溶液中0.5小时。二次水冲干净后浸入2.5％的戊二醛(GLD)中15min。
将上述电极洗净后浸入到0.5mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)反应12小时，然后用50mM的PBS缓冲液冲洗干净，浸入质量百分浓度为2％的牛血清蛋白(BSA)中封闭1小时。清洗后再浸入40μL要检测的样品(人的IgG)，在37℃下温育50分钟，抗体与抗原反应，完全清洗后的电极可用于电化学发光检测。
实施例2.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将硅烷偶联剂KH550的浓度改为1％，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例3.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“浸在质量百分比浓度为3％的硅烷偶联剂KH550的水溶液中0.5小时”改为“浸在质量百分比浓度为3％的硅烷偶联剂KH550的水溶液中2小时”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例4.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“浸入2.5％的戊二醛(GLD)中15min。”改为“浸入2.5％的戊二醛(GLD)中20min。”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例5.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“浸入2.5％的戊二醛(GLD)中15min。”改为“浸入5％的戊二醛(GLD)中10min。”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例6.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“0.5mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)”改为“1mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例7.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“浸入到0.5mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)反应12小时”改为“浸入到0.5mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)反应16小时”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例8.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“浸入到0.5mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)反应12小时”改为“浸入到0.5mg/mL的羊抗人IgG(50mM PBS，pH 7.4)反应20小时”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例9.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将封闭1小时改为封闭2小时，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
实施例10.电化学发光免疫传感器的制备及免疫检测
将“2％的牛血清蛋白(BSA)”改为“3％的牛血清蛋白(BSA)”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的免疫传感器。免疫检测结果同实施例1。
Claims (4)
1.一种基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器，其特征是：它是在金电极表面上覆盖有CdSe纳晶-碳纳米管-壳聚糖复合物膜，并用硅烷偶联剂处理后固定抗体的电化学发光免疫传感器。
2.一种制备权利要求1所述的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器的方法，其特征是它由下列步骤组成：
步骤1.将一定量壳聚糖溶于含有0.05M HCl的80-90℃的热水中，得到0.50％的壳聚糖溶液，然后过滤得到无色的滤液，多壁碳纳米管在3份硫酸与1份硝酸组成的混酸中超声氧化4小时，离心后用二次水洗涤，直至pH值为～7，然后将纯化处理后的多壁碳纳米管分散于0.50mg/mL的壳聚糖溶液超声15分钟，得到一均匀的黑色碳纳米管-壳聚糖复合溶液，
步骤2.将0.05mM的CdSe纳晶溶液用盐酸调至pH 5.5，然后与上述步骤1得到的碳纳米管-壳聚糖复合溶液以1∶3的体积比超声混合0.5小时，得到CdSe NCs/CNT-CHIT复合溶液，备用，
步骤3.将4mm直径金电极依次用1.0，0.3和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，再用二次水冲洗干净，然后将电极置于0.5M H2SO4溶液中，在-0.2～1.6V下扫描至循环伏安曲线稳定，
步骤4.将步骤3的金电极冲洗干净，待电极干燥后取10μL步骤2的CdSeNCs/CNT-CHIT混合溶液滴在电极表面于空气中凉干，然后浸在质量百分比浓度为1-3％的硅烷偶联剂KH550的水溶液中0.5-2小时，二次水冲干净后浸入2.5-5％的戊二醛溶液中10-20min，
步骤5.将步骤4的电极冲洗干净后浸入到0.5-1mg/mL的羊抗人IgG的50mM磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中反应12-20小时，然后用50mM的磷酸缓冲液冲洗干净，浸入质量百分浓度为2-3％的牛血清蛋白(BSA)中封闭1-2小时，即制得基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器。
3.一种采用权利要求1所述的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器作为电化学发光分析探针的免疫检测方法，其特征是它由下列步骤组成：
步骤1.将上述方法制得的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器清洗后再浸入40μL要检测的样品(人的IgG)，在37℃下温育50分钟，
步骤2.电化学发光(ECL)免疫检测：将步骤1处理后的基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器清洗，在含有0.1M K2S2O8和0.1M KCl的0.1M磷酸缓冲液中，pH 7.4，进行电化学发光的测试，发光强度与待测样品(HIgG)的浓度成线性关系。
4.根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征是：所述的电化学发光测试是以基于CdSe纳晶复合物的电化学发光免疫传感器为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在0到-1.5V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为500～700V。
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2008
- 2008-03-25 CN CN2008100245060A patent/CN101251535B/zh not_active Expired - Fee Related
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