CN110082414A - 核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-rgo电极的制备和应用 - Google Patents

核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-rgo电极的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸适配体‑镍铁氰纳米粒子‑RGO电极的制备及其对PCB77的电化学分析方法。该方法将直径约为5nm的镍铁氰纳米粒子原位共沉积于还原氧化石墨烯(RGO)表面，并修饰在金电极后，通过共价键合反应将PCB77适配体固定于镍铁氰纳米粒子‑RGO复合材料，制备得到了核酸适配体‑镍铁氰纳米粒子‑RGO电极，并将该电极用于对环境中PCB77的快速，实时检测。与现有的PCB 77检测方法相比，本发明采用了高灵敏的电化学方法与特异性识别能力的适配体结合实现了对惰性分子PCB77实现高灵敏、高选择性检测。检测限可达0.22ng/L。且本发明具有仪器设备简单、分析成本低、快速、简便等优点。

Description

核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备和应用
技术领域
本发明涉及电化学修饰电极，特别涉及一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-还原氧化石墨烯(RGO)电极及其制备方法，以及该电极对PCB77的电化学分析方法。
技术背景
多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)可以通过生产过程中的废物排放和使用过程中的泄漏、挥发及焚烧等途径排放到环境中而长期稳定存在，并参与地表循环，进而通过食物链累积在生物体和人体内。慢性低剂量的PCBs暴露能够引起肝脏损害、生殖异常、神经和内分泌系统失调等问题。因此，PCBs被《持久性有机污染物斯德哥尔摩公约》列为首批需要控制的一类污染物。毒理学家研究发现，某些类二噁英的非邻位取代共平面结构PCBs具有远高于其它同系物的毒性，这类PCBs虽然以超痕量存在，但可通过食物链浓缩放大，对人体产生巨大的危害。3，3'，4，4'-四氯联苯(PCB77)是一种类二噁英的非邻位取代共平面结构PCBs，其反应活性较高，致突变、致畸形和致癌毒性大，对生态环境和人类健康具有严重地威胁作用。因此，检测环境和食品中的PCB77含量对保护环境和人类健康具有重要的意义。
目前，测定PCBs的常用方法是气相色谱、高效液相色谱结合质谱法等传统的仪器分析方法。但是，这些方法所需仪器昂贵，样品前期处理繁琐，且要求训练有素的操作人员。此外，由于环境中所含的PCBs浓度在ng或pg级，传统的仪器方法很难满足其高灵敏度的要求。而电化学方法具有设备简单，响应快速，操作方便，灵敏度高等优点，受到了广泛地关注。本发明首次将直径约为5nm镍铁氰纳米粒子原位共沉积在RGO表面，并与PCB77适配体复合，制备了一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极，用于对PCB77测定，该方法不仅利用了电化学方法高的灵敏度，而且结合了适配体高的特异性，实现了对复杂环境中PCB77的高灵敏、高选择性检测，在环境分析领域具有非常好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极及其制备方法，用于对PCB77快速、高灵敏、高选择性的检测，以克服现有的PCB 77检测方法操作复杂、费时、成本高等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：制备一种用于检测PCB77的电化学修饰电极，所述电化学修饰电极是在RGO表面原位共沉积直径约为5nm的镍铁氰纳米粒子制备得到了镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料，该复合材料修饰在金电极表面作为信号探针，再将适配体修饰在复合材料表面，制备得到了核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极，并用于对PCB77的检测。
本发明提供的一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)取浓度为1.0～1.5mg/mL氧化石墨烯溶液2.5～4.0mL于反应瓶中，加入50.0～60.0ul浓度为10.0～12.0wt％的PDDA充分混匀，然后通过28％氨水调节pH到9～10.5；再加入45.0～55.0uL 80％的水合肼，剧烈搅拌，将反应瓶放入水浴锅中加热3.5h，得到稳定的黑色悬浮液体RGO；
(2)利用HCl将RGO溶液pH调节至2～4，在快速搅拌下，将浓度是均为15.0～25.0mM的K3[Fe(CN)6]和Ni(NO3)2加入RGO溶液中，继续搅拌4h，最后离心、洗涤，得到镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料；
(3)将镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料固定于金电极表面，并将其置于2.0μM PCB77的适配体溶液中，再加入EDC和NHS反应8～12h，用0.1M pH为7.41的Tris-HCl缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体，用牛血清蛋白堵塞剩余的活性位点，制备得到核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极。
进一步地，所述步骤(1)中氧化石墨烯的浓度是1.2mg/mL，PDDA的浓度为10.5wt％。
进一步地，所述步骤(1)将反应瓶放入水浴锅中水浴锅的温度为58～70℃。
进一步地，所述步骤(2)中K3[Fe(CN)6]和Ni(NO3)2的浓度是均为20.0mM。
进一步地，所述步骤(3)中EDC的浓度为25.0mg/mL，NHS的浓度为15.0mg/mL。
本发明提供的一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77的电化学分析方法，其特征在于，分析步骤如下：
(1)配制一系列不同浓度的PCB77标准溶液；
(2)以权利要求1制备的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极为工作电极，铂电极为对电极，银-氯化银电极为参比电极，将三电极置于以0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.41)为电解液的溶液中，将步骤(1)配制的标准溶液依次与核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极反应，采用差分脉冲伏安法记录不同浓度的PCB77对应的峰电流，根据峰电流变化值与对应标准溶液中的PCB77浓度，绘制PCB77分析的标准曲线；
(3)将PCB77浓度未知的待测样品加入到三电极体系中，采用差分脉冲伏安法记录待测样品对应的峰电流，代入步骤(2)制得的标准曲线中，即可得到待测样品中PCB77的浓度。
进一步地，所述的步骤(2)中PCB77标准溶液与核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极反应的时间为60min。
电极的选择性：配制50.0ng/L PCB77溶液和100倍于PCB77浓度的干扰物溶液，将PCB77溶液和干扰物溶液分别加入三电极测试体系中，所述的干扰物分别为PCB81、对硝基苯酚、铅离子、汞离子、硝基苯、铜离子；采用步骤(2)所述的方法，分别记录其峰电流，利用峰电流的相对变化，考察核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的选择性。
本发明具有以下有益效果：本发明通过原位共沉积法制备RGO负载的直径约为5nm镍铁氰纳米粒子，RGO作为基底，具有大的比表面积和好的导电性，可负载大量的镍铁氰纳米粒子，而且能极好地改善电极的导电性。由于镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料低成本、氧化还原可逆性好、易合成等特点，可广泛地应用于电化学分析方面；
本发明采用共价键合的方式将PCB77适配体修饰在镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料上制备得到核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极，并用于PCB77检测。由于适配体对待测物PCB77的高亲和性和专一性识别能力，大大提高了所制备电极的抗干扰能力，使得该修饰电极能够在100倍浓度且结构相似的干扰物质中选择性的识别出PCB77，具有极好的选择性，可用于复杂环境体系中PCB77的检测；
本发明采用的电化学分析方法具有高的灵敏度，检出限达到了0.22ng/L，该值是根据10次空白试验标准偏差的三倍计算而得到的。该方法仪器廉价便携，方法简单，操作方便，同时，首次制备的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极具有好的稳定性，可逆性和重现性。
附图说明
图1为本发明制备的RGO负载直径约5nm的镍铁氰纳米粒子在不同放大倍数下的TEM图；
图2为本发明制备的镍铁氰配合物纳米粒子-RGO复合材料在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.41)溶液中的50次扫描循环伏安图；
图3为核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77检测时，电流随PCB77浓度变化的差分脉冲伏安图；
图4为核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77检测的定量曲线图；
图5为核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77和不同干扰物光电流相对变化图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面对本发明具体实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分优选实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测PCB77的电化学修饰电极的制备。
PDDA保护的RGO的制备方法为：量取1.2mg/mL氧化石墨烯溶液3.0mL于反应瓶中，加入55.0ul的10.5wt％PDDA充分混匀.然后，通过0.13mL 28％氨水调节pH到10。再加入50.0uL 80％的水合肼，剧烈搅拌20min后，定容到10mL，将反应瓶放入60℃水浴锅中加热3.5h，得到稳定的黑色悬浮液体RGO。
镍铁纳米粒子-RGO复合材料的合成方法为：利用0.1M HCl将RGO溶液pH调节至3，将浓度均为20.0mM K3[Fe(CN)6]和Ni(NO3)2在快速搅拌的下，加入RGO溶液中，首先Fe(CN)6 3-由于静电作用被吸附在RGO表面上，然后再将同量Ni(NO3)2溶液作用，继续搅拌4h，最后离心、洗涤，得到镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料。图1是RGO负载的镍铁氰纳米粒子在不同放大倍数时的TEM图。
核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备:将镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料固定于金电极表面，如图2所示，为将镍铁氰纳米粒子-RGO化合物修饰在金电极在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中连续扫描50圈的循环伏安图。结果显示循环50圈后，氧化还原峰电流几乎没有降低，表明镍铁氰纳米粒子作为信号探针沉积在RGO表面具有很好的稳定性。随后，将镍铁氰纳米粒子-RGO修饰电极置于2μM氨基修饰的PCB77的适配体溶液中，再在溶液中加入25.0mg/L EDC和15.0mg/L NHS反应10h，用0.1M Tris-HCl(pH 7.41)的缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体，用2.0wt％牛血清蛋白堵塞剩余的活性位点，制备得到核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极。
实施例2
本实施例提供了一种用于检测PCB77的电化学分析方法，分析步骤如下：
(1))配制一系列不同浓度的PCB77标准溶液，范围为1.0～300.0ng/L；
(2)以核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极为工作电极，铂电极为对电极，银-氯化银电极为参比电极，将三电极置于以0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.41)为电解液的溶液中，将步骤(1)配制的标准溶液依次与核酸适体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极反应，反应时间为60min，采用差分脉冲伏安法记录不同浓度的PCB77对应的峰电流，峰电流随PCB77浓度的变化的差分脉冲伏安图如图3所示。根据峰电流变化值与对应标准溶液中的PCB77浓度，绘制PCB77分析的标准曲线如图4为所示。其中电流变化ΔI和PCB77浓度在1.0～100.0ng/L的对数呈良好的线性关系，检测限可达0.22ng/L，该值是根据10次空白试验标准偏差的三倍计算而得到的。
(3)将PCB77浓度未知的待测样品加入到三电极体系中，采用差分脉冲伏安法记录待测样品对应的峰电流，代入步骤(2)制得的标准曲线中，即可得到待测样品中PCB77的浓度。
实施例3
配制50.0ng/L PCB77溶液和100倍于PCB77浓度的干扰物溶液，所述干扰物质分别为PCB81、对硝基苯酚、铅离子、汞离子、硝基苯、铜离子。考察核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77的选择性。采用实施例2中的测试条件，分别将上述溶液加入测试体系，反应60min，采用差分脉冲伏安法记录峰电流。其峰电流相对变化如图5所示，核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77测试(第1条柱状图)，其次，该电极对干扰物一一测试(第2～7条柱状图)。结果显示，制备的电极只有对PCB77检测时电流相对变化明显为53.7％。其他6种干扰物的电流相对变化均小于10％，表明本发明所制备的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77具有好的选择性和专一性识别能力。
实施例4
本发明利用所制备的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对不同的环境水样中的PCB77进行测试。
选取山西省太原市山西大学校内的湖水和实验室的自来水样品进行分析。将污水样品先通过普通的滤纸进行过滤以去除悬浮颗粒和其它固体杂质，滤液再次通过0.22μm滤膜过滤并稀释100倍，在处理过的湖水和自来水两种不同环境样品中分别加入1.0,10.0,100.0ng/L三种不同浓度PCB77标准溶液进行加标回收测定，如表1所示。结果发现，在两种不同环境水样中的回收率在88.0％到104.1％范围，且相对标准偏差均小于4.2％，表明所制备的电极能抵制复杂基体效应的影响，可用于实际环境体系中的PCB77的测定。
表1在不同环境水样品中PCB77的回收率结果

Claims (9)

1.一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取浓度为1.0～1.5mg/mL氧化石墨烯溶液2.5～4.0mL于反应瓶中，加入50.0～60.0ul浓度为10.0～12.0wt％的PDDA充分混匀，然后通过28％氨水调节pH到9～10.5；再加入45.0～55.0uL80％的水合肼，剧烈搅拌，将反应瓶放入水浴锅中加热3.5h，得到稳定的黑色悬浮液体RGO；
(2)利用HCl将RGO溶液pH调节至2～4，在快速搅拌下，将浓度是均为15.0～25.0mM的K3[Fe(CN)6]和Ni(NO3)2加入RGO溶液中，继续搅拌4h，最后离心、洗涤，得到镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料；
(3)将镍铁氰纳米粒子-RGO复合材料固定于金电极表面，并将其置于2.0μM PCB77的适配体溶液中，再加入EDC和NHS反应8～12h，用0.1M pH为7.41的Tris-HCl缓冲溶液冲洗掉未反应的适配体，用牛血清蛋白堵塞剩余的活性位点，制备得到核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极。
2.根据权利要求1所述的一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中氧化石墨烯溶液的浓度是1.2mg/mL，PDDA的浓度为10.5wt％。
3.根据权利要求1所述的一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中水浴锅中加热温度为58～70℃。
4.根据权利要求1所述的一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备方法，其特征是所述步骤(2)中K3[Fe(CN)6]和Ni(NO3)2的浓度是均为20.0mM。
5.根据权利要求1所述的一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极的制备方法，其特征是所述步骤(3)中EDC的浓度为25.0mg/mL，NHS的浓度为15.0mg/mL。
6.根据权利要求1-5任一所述方法制备的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极。
7.根据权利要求6所述的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极在PCB77电化学分析中的应用。
8.一种核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极对PCB77的电化学分析方法，其特征在于，分析步骤如下：
(1)配制一系列不同浓度的PCB77标准溶液；
(2)以权利要求1制备的核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极为工作电极，铂电极为对电极，银-氯化银电极为参比电极，将三电极置于0.1M pH为7.41的磷酸盐缓冲溶液中，将步骤(1)配制的PCB77标准溶液依次与核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极反应，采用差分脉冲伏安法记录不同浓度PCB77对应的峰电流，根据峰电流变化值与对应标准溶液中的PCB77浓度，绘制PCB77分析的标准曲线；
(3)将PCB77浓度未知的待测样品加入到三电极体系中，采用差分脉冲伏安法记录待测样品对应的峰电流，代入步骤(2)制得的标准曲线中，即可得到待测样品中PCB77的浓度。
9.根据权利要求8所述的电化学分析方法，其特征在于，所述的步骤(2)中PCB77标准溶液与核酸适配体-镍铁氰纳米粒子-RGO电极反应的时间为60min。
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LIPING JIANG 等: ""Aptamer-based highly sensitive electrochemical detection of thrombin via the amplification of graphene"", 《ANALYST》 *
元宝: ""石墨烯/铁氰化镍电极材料及其非对称超级电容器的组装"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114264590A (zh) * 2021-12-14 2022-04-01 江苏济纶医工智能科技有限公司 一种用于细胞检测的可拆卸便携传感器、装配方法、测量方法、设计方法
CN114264590B (zh) * 2021-12-14 2024-04-05 江苏济纶医工智能科技有限公司 一种用于细胞检测的可拆卸便携传感器、装配方法、测量方法、设计方法

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