CN109632904A - 一种用于检测多氯联苯的适配体传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种用于检测多氯联苯的适配体传感器及其制备方法，属于电化学生物传感器的技术领域。多氯联苯适配体传感器是在硼掺杂金刚石膜(1)上溅射金膜，用退火或刻蚀的方法得到高密度金纳米颗粒(2)，在金纳米颗粒上自组装适配体(3)，所述的适配体，是具有高目标亲和力的单链DNA或RNA，用于对多氯联苯‑77或羟化多氯联苯的检测。还可以使用巯基己醇占据金纳米颗粒未被适配体占据的空白位点减少非特异性吸附。本发明用于检测多氯联苯的适配体传感器具有特异性强、灵敏度高、检测限低，可原位快速检测，稳定性强，制备工艺简单，成本低廉，性价比高。该传感器可去除适配体和巯基己醇，恢复至初始状态，再重新组装使用。

Description

一种用于检测多氯联苯的适配体传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于电化学生物传感器的技术领域，涉及一种金刚石基引入适配体检测多氯联苯复合材料传感器及其制备方法。
背景技术
持久性有机污染物如多氯联苯威胁生态系统，由于其高毒性、低致死剂量和生物蓄积性，对人类具有显著的危害。应优先考虑多氯联苯的检测和去除。尽管20多年前在一些国家已经禁止生产，但多氯联苯的痕量仍然存在于食物中，水中，空气中，以及其他健康环境中。美国食品和药物管理局建议在食物中多氯联苯的含量不应超过3μmol/L。但是通过食物链逐步富集，多氯联苯在体内高度富集。如果环境受到污染，高浓度的多氯联苯也会在人体内积累。实现多氯联苯的敏感性和选择性检测是非常困难和具有挑战性的，尤其是由于多氯联苯在水中的溶解度较低，所以导致水中的浓度非常低而不利于检测。因此，迫切需要研制出在环境样品中检测多氯联苯的简单和敏感的监测系统，以确保安全并将环境卫生的风险降至最低。几种典型的多氯联苯检测方法例如气相色谱-质谱、高效液相色谱、免疫分析-液相色谱等方法。虽然这些经典方法的最小检出限可以达到数十皮摩尔(10-12mol/L)，但复杂的预处理程序、昂贵且耗时的系统使其不适合现场检测，其实际应用受到限制。
电化学方法检测的设备和工艺的相对简单灵敏，可以实现大的动态范围和低的检测限。硼掺杂金刚石是一种惰性的电极材料，具有电势窗口宽、背景电流低、电流密度高、电化学稳定性好、耐沾污性好等特点。纳米金颗粒具有高的化学稳定性、良好的生物相容性、增强的电导率和较大的比表面积，因此在提高生物传感器性能方面发挥着重要作用。适配体是具有高目标亲和力的单链DNA或RNA，可以敏感和有选择性地识别目标并改变其结构以增加检测限。电化学阻抗谱是一种非常敏感的技术，可以获取界面、界面结构和反应的响应信息。
结合以上材料、结构以及合适的电化学方法，本发明利用CVD硼掺杂金刚石上溅射高密度纳米金颗粒，引入适配体对复合电极进行改性，以检测多氯联苯。通过电化学阻抗谱的方法得到检测限达亚飞摩10-16mol/L。该传感器具有非常好的重复使用性。基于硼掺杂金刚石的高性能多氯联苯传感器具有极低的检测限，将在实际应用中具有非常好的应用价值。
和本发明接近的现有技术是文献Adv.Sci.2(2015)1500013，利用环糊精修饰的单根纳米金电极(直径400纳米)，利用电化学方法检测。其检测限达到2.09×10-16mol/L，但检测线性范围较窄(2×10-15～1.6×10-14mol/L)，且单根纳米金电极的制备需要极其精密的仪器和复杂的制作工艺，重复性差，不利于大规模制备。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过功能材料的选择和特殊结构的设计，将纳米金颗粒、适配体、和硼掺杂金刚石膜相结合，获得一种检测限低、重现性好、灵敏度高、特异性强且可重复利用的一种新的多氯联苯适配体传感器。
本发明在硼掺杂金刚石膜上通过离子溅射沉积金膜，并退火得到纳米金颗粒，为适配体提供附着点。利用适配体自组装，提高传感器的特异性识别能力和检测水平。本发明多氯联苯适配体传感器的具体技术方案如下。
一种用于检测多氯联苯的适配体传感器，在硅、钛或钼衬底上生长有硼掺杂金刚石膜1，其特征在于，在硼掺杂金刚石膜1上利用溅射退火的方法得到高密度纳米金颗粒2，在纳米金颗粒2上自组装有适配体3；所述的适配体3，是结构为5'-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3'或5'-SH-(CH2)6-AGC-AGC-ACA-GAG-GTC-AGA-TGC-ACT-CGG-ACC-CCA-TTC-TCC-TTC-CAT-CCC-TCA-TCC-GTC-CAC-CCT-ATG-CGT-GCT-ACC-GTG-AA的适配体，分别用于检测多氯联苯-77、羟化多氯联苯。
所述的纳米金颗粒2，是溅射退火得到的，平均粒径尺寸10～30nm,密度约7×1010/cm2～2.5×1011/cm2。
本发明的检测多氯联苯的适配体传感器，第一，可用于电化学检测，检测过程中传感器做为三电极系统中的工作电极，通过阻抗测试检测多氯联苯，具有检测限低、重现性好、灵敏度高、特异性强等特点。第二，去除适配体以再生纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜，再生后的电极重新自组装适配体，可恢复至初始状态，即，可以除去适配体并重新修饰，实现重复使用。第三，通过改变适配体，可以检测系列多氯联苯。
本发明用于检测多氯联苯的适配体传感器制备方法的具体技术方案如下。
一种用于检测多氯联苯的适配体传感器的制备方法，通过微波等离子体化学气相沉积法在硅、钛、钼等衬底上生长硼掺杂金刚石膜；其特征在于，在硼掺杂金刚石膜表面利用电子溅射或磁控溅射方法溅射金膜；将所得的金膜/硼掺杂金刚石膜在空气中或含氧气体中退火或者经氧等离子体刻蚀，得到纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜结构；将2～2.5μmol/L的适配体加置于干燥的纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜表面，于室温下自由组装5～12小时；去离子水中浸泡清洗1小时，得到用于检测多氯联苯的适配体传感器。
在制备中，还可以在得到的用于检测多氯联苯的适配体传感器表面加置巯基己醇，自由组装0.5～2小时。巯基己醇得起到占据金纳米颗粒空余位点的作用，减少非特异性吸附。
在制备中，还可以在溅射金膜和退火制得纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜结构之后，重复溅射金膜和退火过程，以得到更高密度的纳米金颗粒。
所述的退火，是在800～900℃下退火，得到纳米金颗粒。
在上述的制备过程中，所述的加置，可以是滴加，也可以是浸泡。
本发明制备的多氯联苯适配体传感器灵敏度高，特异性好。实验测量结果表明，所得传感器在1.0×10-15～1.0×10-11mol/L浓度范围具有良好的线性关系，检测限达到2～5×10-16mol/L，低于飞摩水平。检测能力远高于目前报道多氯联苯传感器，在应用于实际水样中获得良好的回收率。
本发明中设计的金刚石与适配体结合的结构，用于多氯联苯的检测尚属首次，利用溅射退火在金刚石获得高密度纳米金颗粒，基于金刚石的纳米金颗粒电极可以自组装适配体用于检测多氯联苯属首次。去除修饰适配体，重新修饰后恢复初始状态而实现可重复使用属首次。
硼掺杂金刚石的选择以及合理的结构设计有利于提高检测性能。这种新型多氯联苯适配体传感器(适配体/纳米金颗粒/金刚石复合材料)作为多氯联苯的检测电极，具有灵敏度高、特异性强、重现性好，检测限低等优势，是本发明专利所涉及的主要内容和重要创新点之一，基于纳米金颗粒/金刚石电极的适配体传感器去除适配体，重新修饰后恢复初始状态而实现可重复使用是创新点之二。并且制备方法工艺简单，成本低廉。随着对检测便捷需求的日益增加，检测快速，效率高，稳定性强的新一代多氯联苯传感器变得意义重大。
附图说明
图1为本发明用于检测多氯联苯的适配体传感器的结构示意图。
图2为实施例1纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜形貌图。
图3为实施例1的适配体传感器的制备过程及检测原理示意图。
图4为本发明的适配体传感器的阻抗与多氯联苯-77的浓度对应关系的测试图。
图5为本发明的适配体传感器的相对阻抗变化与多氯联苯-77的浓度对应关系的曲线图。
图6为本发明的适配体传感器与不同干扰物作用后的相对阻抗响应柱状图。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本申请作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本申请的理解。实施例1～6所制得的适配体传感器结构如图1的示意图所示，图1中，1为硼掺杂金刚石膜，2为纳米金颗粒，3为适配体。
实施例1：用于检测多氯联苯-77的适配体传感器的制备(1)
硼掺杂导电金刚石膜通过微波等离子体化学气相沉积设备沉积到硅衬底上。然后在金刚石表面离子溅射金膜，样品转移至高温管式炉中，高温(800℃)空气中退火，获得纳米金颗粒/金刚石膜结构(见图2)。将2μmol/L的适配体滴加到纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜表面，于室温下自由组装过夜，用缓冲液冲洗干净，得到用于检测多氯联苯-77的适配体传感器。
所述的适配体，是具有高目标亲和力的单链DNA或RNA。本实施例选择的多氯联苯-77的适配体具体结构是5'-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3'。
该适配体传感器的检测限可以达到10-14mol/L。
实施例2：用于检测多氯联苯-77的适配体传感器的制备(2)
硼掺杂导电金刚石膜通过微波等离子体化学气相沉积设备沉积到硅衬底上。然后在金刚石表面离子溅射金膜，样品转移至高温管式炉中，高温(800℃)空气中退火，重复上述溅射和退火的过程(二次溅射退火)，获得纳米金颗粒/金刚石膜结构。金颗粒平均粒径尺寸降低,密度增大，为适配体提供更多的活性结合位点，二次溅射退火得到的纳米金颗粒密度约为实施例1中单次溅射退火的3倍，将2μmol/L的适配体滴加到纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜表面，于室温下自由组装过夜，用缓冲液冲洗干净，得到用于检测多氯联苯-77的适配体传感器。
本实施例的巯基修饰适配体可选择上海生物工程股份有限公司合成的产品，具体结构是5'-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3'。本实施例与实施例1制得的多氯联苯-77适配体传感器性能也基本相同，该适配体传感器的检测线可以达到10-15mol/L。
实施例3：用于检测多氯联苯-77的适配体传感器的制备(3)
在实施例2的基础上，自组装巯基修饰适配体的时间可以是5～10小时；用缓冲液冲洗干净，然后自组装6-巯基己-1-醇0.5～2小时，以封锁纳米金颗粒的空余位点，提高灵敏度及检测限。
本实施例的巯基修饰适配体可选择上海生物工程股份有限公司合成的产品。本实施例与实施例2制得的多氯联苯-77适配体传感器性能基本相同，该适配体传感器的检测线可以达到2×10-16～5×10-16mol/L。
实施例4：用于多氯联苯-77的适配体传感器的性能测试
多氯联苯-77适配体传感器的制备过程和检测原理如图3所示。通过等离子溅射方法在硼掺杂金刚石电极表面溅射一层金膜(图3中a-b)；后在管式炉中进行热处理，金膜形成纳米金颗粒(图3中c)；将上述电极浸泡在适配体溶液中，适配体会在Au-S共价键的作用下，嫁接到纳米金颗粒上(图3中d)；用于检测多氯联苯-77的适配体传感器制备完成。当不同浓度多氯联苯-77接触检测多氯联苯-77的适配体传感器时，电极上的适配体会与其特异性结合，产生不同的阻抗变化(图3中e)。
基于实施例3制备的适配体传感器，对一系列浓度的多氯联苯-77进行了阻抗测试，如图4所示。传感器的阻抗随着多氯联苯-77浓度的增加而增加，直到达到最大值。定义(Rct-Rct0)除以Rct0作为相对阻抗(即(Rct-Rct0)/Rct0，Rct代表多氯联苯-77适配体传感器与一定浓度多氯联苯-77结合后的阻抗值，Rct0代表多氯联苯-77适配体传感器的初始阻抗)。由此可以得到相对阻抗(％)与多氯联苯-77浓度的对数线性关系，如图5所示。通过三倍信噪比进行计算出传感器的检测限为3.2×10-16mol/L。相对阻抗变化率与多氯联苯-77浓度的对数呈线性关系，范围为1.0×10-15～1.0×10-11mol/L。
实施例5：用于检测多氯联苯-77的适配体传感器的选择性和特异性测试
为了研究传感器的选择性和特异性，选取了8种和多氯联苯-77结构类似的持久性有机污染物作为干扰物(多氯联苯-28、多氯联苯-52、多氯联苯-81、多氯联苯-126、林丹、晕苯、芘和六氯苯)，进行干扰性实验。在1.0×10-13mol/L多氯联苯-77体系中，分别加入50倍于多氯联苯-77浓度的干扰物，进行阻抗测试。将只含有多氯联苯-77的阻抗设置为100％，每种混合物的相对阻抗波动范围在-2.9％-5.8％之间(图6)，表明干扰物对传感器检测的影响很小，传感器在复杂环境下依然具有良好的选择性和特异性。
实施例6：用于检测多氯联苯-77的适配体传感器的实体水样检测
取实际湖水样品，先经过滤纸过滤以除去其中所含的颗粒与悬浮物，随后用滤膜进行多次过滤，对样品进一步纯化。向纯化后的湖样品中加入多氯联苯-77溶液，使实体水样品中多氯联苯-77的含量为1.0×10-15～1.0×10-11mol/L，进行电化学阻抗谱测试。研究结果表明，基于金刚石膜构筑的适配体电化学传感器测定湖水样品中多氯联苯-77含量的回收率在96-107％之间，相对标准偏差小于等于5.6％。可见，本发明制备的适配体传感器在实体水样检测中表现出较高的灵敏度与准确性。该传感器为水体中多氯联苯-77的分析检测提供一种简便、快捷的分析方法。
实施例7：适配体传感器的可重复使用
电化学检测高浓度多氯联苯-77后，由于适配体无法释放多氯联苯-77而使传感器失效。采用电化学方法解吸，打破金-硫醇键，去除纳米金颗粒/硼掺杂金刚石电极表面的适配体和巯基己醇。再生的纳米金颗粒/硼掺杂金刚石电极重新修饰适配体和巯基己醇后再次检测多氯联苯-77，再生的传感器仍然保留其原有灵敏度。这些结果证实了该适配体传感器可以在不损失灵敏度的情况下可重复使用。
实施例8：用于检测羟化多氯联苯的适配体传感器的制备
硼掺杂导电金刚石膜通过微波等离子体化学气相沉积设备沉积到硅衬底上。然后在金刚石表面离子溅射金膜，样品转移至高温管式炉中，高温退火，获得纳米金颗粒/金刚石膜结构。将2μmol/L的适配体滴加到纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜表面，于室温下自由组装过夜，用缓冲液冲洗干净，得到用于检测羟化多氯联苯的适配体传感器。
所述的适配体，是具有高目标亲和力的单链DNA或RNA。本实施例选择的羟化多氯联苯的适配体具体结构是5'-SH-(CH2)6-AGC-AGC-ACA-GAG-GTC-AGA-TGC-ACT-CGG-ACC-CCA-TTC-TCC-TTC-CAT-CCC-TCA-TCC-GTC-CAC-CCT-ATG-CGT-GCT-ACC-GTG-AA。

Claims (7)

1.一种用于检测多氯联苯的适配体传感器，在硅、钛或钼衬底上生长有硼掺杂金刚石膜(1)，其特征在于，在硼掺杂金刚石膜(1)上利用溅射退火的方法得到高密度纳米金颗粒(2)，在纳米金颗粒(2)上自组装有适配体(3)；所述的适配体(3)，是结构为5'-SH-(CH2)6-GGCGGGGCTACGAAGTAGTGATTTTTTCCGATGGCCCGTG-3'或5'-SH-(CH2)6-AGC-AGC-ACA-GAG-GTC-AGA-TGC-ACT-CGG-ACC-CCA-TTC-TCC-TTC-CAT-CCC-TCA-TCC-GTC-CAC-CCT-ATG-CGT-GCT-ACC-GTG-AA的适配体，分别用于检测多氯联苯-77、羟化多氯联苯。
2.按照权利要求1所述的用于检测多氯联苯的适配体传感器，其特征在于，所述的纳米金颗粒(2)，平均粒径尺寸10～30nm,密度7×1010/cm2～2.5×1011/cm2。
3.一种权利要求1的用于检测多氯联苯的适配体传感器的制备方法，通过微波等离子体化学气相沉积法在硅、钛或钼衬底上生长硼掺杂金刚石膜；其特征在于，在硼掺杂金刚石膜表面利用电子溅射或磁控溅射方法溅射金膜；将所得的金膜/硼掺杂金刚石膜在空气中或含氧气体中退火或者经氧等离子体刻蚀，得到纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜结构；将2～2.5μmol/L的适配体加置于干燥的纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜表面，于室温下自由组装5～12小时；去离子水中浸泡清洗1小时，得到用于检测多氯联苯的适配体传感器。
4.按照权利要求3所述的用于检测多氯联苯的适配体传感器的制备方法，其特征在于，在制备中，在得到的用于检测多氯联苯的适配体传感器表面加置巯基己醇，自由组装0.5～2小时。
5.按照权利要求3或4所述的用于检测多氯联苯的适配体传感器的制备方法，其特征在于，在溅射金膜和退火制得纳米金颗粒/硼掺杂金刚石膜结构之后，重复溅射金膜和退火过程，以得到更高密度的纳米金颗粒。
6.按照权利要求3所述的用于检测多氯联苯的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述的退火，是在800～900℃下退火，得到纳米金颗粒。
7.按照权利要求3或4所述的用于检测多氯联苯的适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述的加置，是滴加或浸泡。
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