CN103234952A - 基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法 - Google Patents

基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，采用二氯甲烷或乙酸乙酯作为提取溶剂，酸性水溶液和有机溶剂作为净化萃取溶剂对提取液进行液液萃取，以纳米金或纳米银胶体溶液为增强试剂，采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光谱对上机检测液进行扫描。以位移1258±2cm-1、1470±2cm-1、1601±2cm-1为判定克伦特罗的特征峰；以1450±2cm-1对应峰强进行归一化，1470±2cm-1对应峰强度结合线性曲线进行克伦特罗含量计算，定性和定量对尿液中克伦特罗进行快速检测。纳米金胶制备方法简单，前处理操作时间短、重复性好、灵敏度高，能实现现场快速检测，满足监管需求。

Description

基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法
技术领域
本发明涉及一种尿液中克伦特罗的检测方法，尤其涉及一种基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法。
背景技术
克伦特罗是一种β-肾上腺素能受体激动剂类化合物（以下简称：β-受体激动剂），在人医临床上常被用作平喘药物，用于调节支气管扩张和平滑肌松弛，治疗呼吸系统疾病。由于对动物具有一定的促进生长、提高瘦肉率的作用，而被称之为“瘦肉精”。农业部176号和1519号公告明确规定的禁止在养殖动物上使用克伦特罗，但仍有不法分子受利益驱使非法使用克伦特罗，国内外屡屡发生以克伦特罗为代表的“瘦肉精”中毒事件。为保障人民群众身体健康，对“瘦肉精”类药物非法使用的监管非常重要。
目前，检测克伦特罗的方法主要有酶联免疫试剂盒(ELISA)、试纸条、液质联谱(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)等方法。其中，气相色谱-质谱法需要对克伦特罗进行衍生化处理，操作复杂，且衍生化反应多不稳定，检测灵敏度不高；液相色谱-串联质谱灵敏度高，但设备相对昂贵，且前处理复杂，检测时间长；现有的ELISA快速筛选法虽然较为简便，但该法受环境条件的限制，常常出现“假阳性”情况，给检测工作带来不便。
SERS（Surface-enhanced Raman Spectroscopy,表面增强拉曼光谱）具有速度快、灵敏度高等特点，它能检测到吸附于金属表面的小分子化合物，给出丰富的分子结构信息，适合现场快速检测。
有关克伦特罗等β-受体激动剂的SERS速测方法也有相关报道，如Izquierdo-Lorenzo I.等曾报道利用SERS检测克伦特罗、沙丁胺醇等三种β-受体激动剂的标准溶液，发现其方法的可行性，但检测灵敏度不高（克伦特罗检测限70ng.mL-1），而且该报道没有研究在基质中克伦特罗等的SERS检测方法，无法满足实际监管的需求；GuichiZhu等利用SERS结合免疫的分析方法测定猪尿液中克伦特罗，方法灵敏度高（1pg.mL- 1），但该方法基于免疫学的原理，前期需要制备特异性抗体，周期较长，增强试剂制备方法较为复杂，检测周期较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作时间短、重复性好、灵敏度高、能实现现场快速检测的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，包括步骤：
A、样品前处理：
采用二氯甲烷或乙酸乙酯作为提取溶剂，获得待测尿液的提取液，所述待测尿液与提取溶剂的体积比为1：1；
采用酸性水溶液和有机溶剂为净化萃取溶剂对所述提取液进行液液萃取，获得待测液，所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯；
B、制备检测试剂：
向纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液中加入前处理后的待测液，加入酸性溶液调节体系PH＜7，随后加入含有NO3 -、Cl-的凝聚剂，使纳米粒子聚集，涡旋混合均匀后，混合液为最后的上机检测液；
C、定性检测：
采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光谱对所述上机检测液进行扫描，以位移1258±2cm-1、1470±2cm-1、1601±2cm-1为判定克伦特罗的特征峰；
D、定量检测：
以1450±2cm-1对应峰强度进行谱图归一化，以1470±2cm-1对应峰强度进行克伦特罗含量计算。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，采用二氯甲烷或乙酸乙酯作为提取溶剂，采用酸性水溶液和有机溶剂为净化萃取溶剂对提取液进行液液萃取，以纳米金胶溶液或者纳米银胶溶液为增强试剂，建立了尿液中克伦特罗的SERS快速检测方法，前处理操作时间短、重复性好、灵敏度高（1ng.mL-1）,能实现现场快速检测，满足监管需求。
附图说明
图1为本发明实施例中尿液中克伦特罗浓度为5ng.mL-1的拉曼光谱图；
图2为本发明实施例中尿液中克伦特罗浓度为0、1、2、5、10ng.mL-1的拉曼光谱图；
图3为本发明实施例中尿液基质中盐酸克伦特罗浓度与特征峰（1470±2cm-1）强度线性关系示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。
本发明的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，其较佳的具体实施方式包括步骤：
A、样品前处理：
采用二氯甲烷或乙酸乙酯作为提取溶剂，获得待测尿液的提取液，所述待测尿液与提取溶剂的体积比为1：1；
采用酸性水溶液和有机溶剂为净化萃取溶剂对所述提取液进行液液萃取，获得待测液，所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯；
B、制备检测试剂：
向纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液中加入前处理后的待测液，加入酸性溶液调节体系PH＜7，随后加入含有NO3 -、Cl-的凝聚剂，使纳米粒子聚集，涡旋混合均匀后，混合液为最后的上机检测液；
C、定性检测：
采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光谱对所述上机检测液进行扫描，以位移1258±2cm-1、1470±2cm-1、1601±2cm-1为判定克伦特罗的特征峰；
D、定量检测：
以1450±2cm-1对应峰强度进行谱图归一化，以1470±2cm-1对应峰强度进行克伦特罗含量计算。
所述步骤A包括以下任一种方法：
方法一：准确量取2.0mL尿液，加入20uL1.0M的NaOH，2mL二氯甲烷，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取下层液2mL,加入2mL PH=3-4的HNO3水溶液，涡旋离心，移取上清液2mL，加入20μL1.0M的NaOH溶液，2mL二氯甲烷，涡旋离心，移取下层液加入2mL PH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，上层液为待测液；
方法二：准确量取2.0mL尿液，加入20uL1.0M的NaOH，2mL乙酸乙酯，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取上清液2mL，加入2mL PH=3-4的HNO3水溶液，涡旋离心，移取下层液2mL，加入20μL1.0M的NaOH溶液，2mL乙酸乙酯，涡旋离心，移取上层液加入2mL PH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，下层液为待测液。
所述步骤B包括以下任一种方法：
方法一：应用柠檬酸钠还原的方法合成纳米金胶体或者纳米银溶液，取纳米胶体溶液或者纳米银溶液300-600μL，依次加入200-300μL待测液，50-100μL1%的KNO3溶液、50-100μL1%的HNO3水溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液；
方法二：应用碳量子点合成纳米金粒子的方法合成纳米金胶体溶液，取纳米胶体溶液300-600μL，依次加入200-300μL待测液、50-100μL1%的HNO3溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液；
所述纳米金粒径为50-60nm。
所述步骤C中，光谱扫描时间10s、扫描次数2、平滑参数1。
所述步骤D中，以1450±2cm-1对应峰强度为100单位，进行谱图归一化，通过数据处理使光谱图基线平滑，以1470±2cm-1对应峰强度进行克伦特罗含量计算。
本发明利用纳米粒子结合拉曼光谱实现对尿液中克伦特罗的快速检测，样品前处理步骤简单（仅需简单的液液萃取），每个样品检测时间少于5min；灵敏度完全能满足目前监管的需要（本方法尿液中克伦特罗检测限达1ng.mL-1）；方法回收率高（70%以上）；线性良好（R2=0.990）；重复性良好（RSD≤7%），能实现对尿液中克伦特罗的现场快速检测。
具体实施例，包括步骤：
（1）样品前处理：
方法一：准确量取2.0mL尿液，加入20uL1.0M的NaOH，2mL二氯甲烷，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取下层液2mL,加入2mL PH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，移取上清液2mL，加入20μL1.0M的NaOH溶液，2mL二氯甲烷，涡旋离心，移取下层液加入2mLPH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，上层液为待测液。
方法二：准确量取2.0mL尿液，加入20uL1.0M的NaOH，2mL乙酸乙酯，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取上清液2mL,加入2mL PH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，移取下层液2mL，加入20μL1.0M的NaOH溶液，2mL乙酸乙酯，涡旋离心，移取上层液加入2mLPH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，下层液为待测液。
（2）检测试剂：
方法一：应用目前公开的柠檬酸钠还原的方法合成纳米金胶体或者纳米银溶液（如Frens方法，控制纳米金粒径为50-60nm），取纳米胶体溶液300-600μL，依次加入200-300μL待测液，50-100μL1%KNO3溶液、50-100μL1%HNO3水溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液。
方法二：应用碳量子点合成纳米金粒子的方法合成纳米金胶体溶液（控制纳米金粒径为50-60nm），取纳米胶体溶液300-600μL，依次加入200-300μL待测液、50-100μL1%HNO3溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液。
（3）定性检测：
785nm激光源拉曼光谱，激光能量200mw，光谱扫描时间10s，扫描次数2，平滑参数1。以位移1258±2cm-1、1470±2cm-1、1601±2cm-1（如图1）为判定克伦特罗的特征峰。
（4）定量检测
随着待测尿液中克伦特罗的浓度逐渐加大（0-10ng/mL）,拉曼谱图中1470cm-1处的特征峰强度逐渐增大，1450cm-1处的特征峰强度基本保持不变（如图2），选取1450cm-1作为定量计算归一化峰。以1450±2cm-1对应峰强度为100单位，进行谱图归一化，通过数据处理使光谱图基线平滑，以1470±2cm-1对应峰强度结合线性曲线（见图3）进行克伦特罗含量计算。
本发明技术方案带来的有益效果：
（1）尿液基质复杂，按照目前现有的标准方法样品前处理步骤繁琐，通常需要通过固相萃取柱进行净化处理，本发明通过简单的液液萃取进行净化，效果好，回收率高（回收率70%以上），选取PH=3-4HNO3水溶液和二氯甲烷或乙酸乙酯作为克伦特罗的萃取溶剂，通过克伦特罗在不同离子环境下的存在形式不同的原理（PH＞Pka时，克伦特罗呈分子状态；PH＜PKa≈9.6时，克伦特罗呈离子状态），在样品前处理阶段实现快速净化。
（2）尿液基质复杂，在克伦特罗特征吸收位移1470±2cm-1附近处常有干扰，特征吸收峰常常被掩盖。本发明在选择特异性提取溶剂与萃取溶剂的情况下，在分辨率不高（8cm-1）的拉曼光谱仪上实现1470cm-1与1450cm-1处峰的基本分离，实现对克伦特罗实现定性定量分析。
（3）选取1450cm-1作为归一化峰的目的在于1450cm-1处的吸收位移通常为基质中存在蛋白的C-N键吸收，基本上可以认定为本底吸收，以此作为归一化峰进行定量计算。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，其特征在于，包括步骤：
A、样品前处理：
采用二氯甲烷或乙酸乙酯作为提取溶剂，获得待测尿液的提取液，所述待测尿液与提取溶剂的体积比为1：1；
采用酸性水溶液和有机溶剂为净化萃取溶剂对所述提取液进行液液萃取，获得待测液，所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯；
B、制备检测试剂：
向纳米金胶体溶液或者纳米银胶体溶液中加入前处理后的待测液，加入酸性溶液调节体系PH＜7，随后加入含有NO3 -、Cl-的凝聚剂，使纳米粒子聚集，涡旋混合均匀后，混合液为最后的上机检测液；
C、定性检测：
采用激光能量200mw的785nm激光源拉曼光谱对所述上机检测液进行扫描，以位移1258±2cm-1、1470±2cm-1、1601±2cm-1为判定克伦特罗的特征峰；
D、定量检测：
以1450±2cm-1对应峰强度进行谱图归一化，以1470±2cm-1对应峰强度进行克伦特罗含量计算。
2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，其特征在于，所述步骤A包括以下任一种方法：
方法一：准确量取2.0mL尿液，加入20uL1.0M的NaOH，2mL二氯甲烷，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取下层液2mL,加入2mL PH=3-4的HNO3水溶液，涡旋离心，移取上清液2mL，加入20μL1.0M的NaOH溶液，2mL二氯甲烷，涡旋离心，移取下层液加入2mL PH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，上层液为待测液；
方法二：准确量取2.0mL尿液，加入20uL1.0M的NaOH，2mL乙酸乙酯，涡旋提取30s，12500rpm离心1min，移取上清液2mL，加入2mL PH=3-4的HNO3水溶液，涡旋离心，移取下层液2mL，加入20μL1.0M的NaOH溶液，2mL乙酸乙酯，涡旋离心，移取上层液加入2mL PH=3-4HNO3水溶液，涡旋离心，下层液为待测液。
3.根据权利要求2所述的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，其特征在于，所述步骤B包括以下任一种方法：
方法一：应用柠檬酸钠还原的方法合成纳米金胶体或者纳米银溶液，取纳米胶体溶液或者纳米银溶液300-600μL，依次加入200-300μL待测液，50-100μL1%的KNO3溶液、50-100μL1%的HNO3水溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液；
方法二：应用碳量子点合成纳米金粒子的方法合成纳米金胶体溶液，取纳米胶体溶液300-600μL，依次加入200-300μL待测液、50-100μL1%的HNO3溶液，涡旋混合均匀后，混合液为最后上机液；
所述纳米金粒径为50-60nm。
4.根据权利要求3所述的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，其特征在于，所述步骤C中，光谱扫描时间10s、扫描次数2、平滑参数1。
5.根据权利要求4所述的基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的速测方法，其特征在于，所述步骤D中，以1450±2cm-1对应峰强度为100单位，进行谱图归一化，通过数据处理使光谱图基线平滑，以1470±2cm-1对应峰强度进行克伦特罗含量计算。
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