CN108459010A - 一种基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于液液萃取‑表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法，首先制备氧化石墨烯负载金纳米溶胶的SERS基底(该基底在4℃下能稳定保存180天)；对尿液样品进行液液萃取净化处理；将净化后的待测液加入SERS基底中，随后加入三聚氰胺标准溶液，以三聚氰胺为内标，提高了分析的稳定性和重复性，最后采集指定范围的拉曼光谱数据；基于所采集的光谱数据，对待测液中的克伦特罗进行定性和定量分析。该方法操作时间短、重复性好、灵敏度高，能够实现现场快速检测。

Description

一种基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特 罗的检测方法

技术领域

本发明涉及化合物检测技术领域，尤其涉及一种基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法。

背景技术

目前，克伦特罗是一种β-肾上腺素能受体激动剂类化合物(以下简称：β-受体激动剂)，在人医临床上常被用作平喘药物，用于调节支气管扩张和平滑肌松弛，治疗呼吸系统疾病。由于对动物具有一定的促进生长、提高瘦肉率的作用，而被称之为“瘦肉精”，农业部176号和1519号公告明确规定的禁止在养殖动物上使用克伦特罗，但仍有不法分子受利益驱使非法使用克伦特罗，国内外屡屡发生以克伦特罗为代表的“瘦肉精”中毒事件，为保障人民群众身体健康，对“瘦肉精”类药物非法使用的监管非常重要，对养殖环节克伦特罗的监管靶标主要是活体尿液，开发出适合动物尿液的克伦特罗的快速分析方法势在必行。

现有分析技术中检测动物尿液中克伦特罗的方法主要有酶联免疫试剂盒(ELISA)、试纸卡、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MSⁿ)等方法。其中，ELISA是目前普遍使用的现场快速筛查方法，但该法中核心抗体受环境条件的限制，常常出现“假阳性”，给检测工作带来不便；LC-MS/MS灵敏度高，但设备较昂贵，不适合现场快速检测；GC-MSⁿ需要对克伦特罗进行衍生化处理，操作较为复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法，该方法操作时间短、重复性好、灵敏度高，能够实现现场快速检测。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法，所述方法包括：

步骤1、首先制备氧化石墨烯负载金纳米溶胶的表面增强拉曼光谱SERS基底；

步骤2、对待处理的动物尿液进行净化处理；

步骤3、将净化后的待测液加入SERS基底，随后加入三聚氰胺标准溶液，最后进行拉曼光谱扫描，采集指定范围的光谱数据；

步骤4、基于所采集的光谱数据，对待测液中的克伦特罗进行定性和定量分析。

所述步骤1的过程具体为：

首先将90mL，2mg·L^-1的氧化石墨烯溶液加入到10mL，30％的过氧化氢中，并在紫外光照射下搅拌4h；

再将3.50mL经过二次氧化处理后的石墨烯加入到35mL去离子水中，再添加0.35mL，1％的柠檬酸钠溶液；

将混合溶液加热搅拌至沸腾，再向该混合溶液中加入500μL，1％的氯金酸溶液，再加热搅拌10min后撤去热源；

继续搅拌冷却至室温，即得到氧化石墨烯负载金纳米溶胶(rGO/AuNPs)。

所述步骤2进行前处理的过程具体为：

首先在2mL的尿液样品中加入10μL氢氧化钠溶液和2mL的混合提取溶剂；其中，所述混合提取溶剂为2-乙基己磷酸二酯和二氯甲烷，两者的体积比为1:800；

然后将混合液振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，并移取下层液；

再加入2mL硝酸溶液(pH＝3-4)，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，再移取2mL的上层液；

再加入10μL氢氧化钠溶液(C＝1M)和2mL二氯甲烷，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，再移取上层液体；

然后再加入2mL硝酸溶液(C＝0.1M)，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，所得下层液即为前处理后的待测液。

在步骤3中，具体将前处理后的180μL待测液加入600μL表面增强拉曼光谱基底和2μL的三聚氰胺标准溶液(C＝0.1M)中，并混合10s。

在步骤3中，进行拉曼光谱扫描的拉曼光谱仪的光谱扫描时间为10s、扫描次数3、平滑参数1、扫描功率为200mw；

所采集的光谱数据范围为500-2500cm^-1。

所述步骤4的过程具体为：

基于所采集的光谱数据，以Δv＝1265，1474，1602cm^-1处的拉曼吸收峰作为克伦特罗定性峰；

以△v＝709cm^-1的吸收强度为归一化标准，并以△v＝1474cm^-1处的拉曼吸收峰为克伦特罗定量峰进行定量计算。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，上述方法操作时间短、重复性好、灵敏度高，能够实现现场快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为本发明实施例提供基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法流程示意图；

图2为本发明实施例所举实例中动物尿液中添加不同浓度克伦特罗的SERS图；

图3为本发明实施例所举实例中定量表征的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS)是入射光激发纳米尺度金属材料产生的一种拉曼散射增强效应。SERS可实现对单分子的快速超敏检测，与普通拉曼散射信号相比，信号增强10⁴—10¹⁴倍；同时与传统分析手段相比，SERS技术容易与普遍商业化的便携式拉曼光谱仪进行匹配，为现场速测提供条件。下面将结合附图对本发明实施例作进一步地详细描述，如图1所示为本发明实施例提供基于表面增强拉曼光谱的尿液中克伦特罗的检测方法流程示意图，所述方法包括：

步骤1、首先制备氧化石墨烯负载金纳米溶胶的表面增强拉曼光谱SERS基底；

具体来说，首先将90mL，2mg·L^-1的氧化石墨烯溶液加入到10mL，30％的过氧化氢中，并在紫外光照射下搅拌4h；这里为了提高对克伦特罗的SERS增强活性，进行石墨烯的二次氧化；

再将3.50mL经过二次氧化后的石墨烯加入到35mL去离子水中，再添加0.35mL，1％的柠檬酸钠溶液；

将混合溶液加热搅拌至沸腾后，立即向该混合溶液中加入500μL，1％的氯金酸溶液，再加热搅拌10min后撤去热源；

继续搅拌冷却至室温，即得到氧化石墨烯负载金纳米溶胶rGO/AuNPs。

另外，上述SERS基底可以在4℃条件下保存180天，在每次使用SERS基底之前用去离子水洗2次，离心沉淀，再分散至水相，大大提高SERS基底的稳定性。

步骤2、对待处理的动物尿液样品进行净化处理；

在该步骤中，首先在2mL的动物尿液样品中加入10μL氢氧化钠溶液和2mL的混合提取溶剂；其中，所述混合提取溶剂为2-乙基己磷酸二酯和二氯甲烷，两者的体积比为1:800；

然后将混合液振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，并移取下层液；

再加入2mL硝酸溶液(pH＝3-4)，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，再移取2mL的上层液；

再加入10μL氢氧化钠溶液(C＝1M)和2mL二氯甲烷，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，再移取上层液体；

然后再加入2mL硝酸溶液(C＝0.1M)，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，所得下层液即为前处理后的待测液。

步骤3、将净化后的待测液加入SERS基底，随后加入三聚氰胺标准溶液(C＝0.1M)，最后进行拉曼光谱扫描，采集指定范围的光谱数据；

该步骤中，具体可以将前处理后的180μL待测液加入600μL表面增强拉曼光谱基底和2μL的三聚氰胺标准溶液(C＝0.1M)中，并混合10s。

上述拉曼光谱仪的光谱扫描时间为10s、扫描次数3、平滑参数1、扫描功率为200mw；所采集的光谱数据范围为500-2500cm^-1。

步骤4、基于所采集的光谱数据，对待测液中的克伦特罗进行定性和定量分析。

举例来说，如图2所示为本发明实施例所举实例中尿液中添加不同浓度克伦特罗的SERS示意图，参考图2：基于所采集的光谱数据，以Δv＝1265，1474，1602cm^-1处的拉曼吸收峰作为待测液中的克伦特罗的特征定性峰；

如图3所示为本发明实施例所举实例中定量表征的曲线示意图，基于该曲线图，以拉曼位移△v＝709cm^-1的吸收强度为归一化标准，并以△v＝1474cm^-1处的拉曼吸收峰为克伦特罗的定量峰进行定量计算，以保证SERS分析的重复性和稳定性。

值得注意的是，本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

综上所述，本发明实施例所述检测方法具有如下优点：

(1)利用简单液液萃取的方法，实现复杂动物尿液基质中克伦特罗的净化；

(2)获得的对克伦特罗具有高SERS增强性能的深度氧化石墨烯负载纳米金复合体系基底，该基底在4℃下能稳定保存180天。

(3)能够实现对动物尿液中克伦特罗的快速高灵敏分析，检测灵敏度和定量限分别达到0.5和1ng·mL^-1，分析时间8min/样，大大提高了分析效率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种基于液液萃取-表面增强拉曼光谱的动物尿液中克伦特罗的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、首先制备氧化石墨烯负载金纳米溶胶的表面增强拉曼光谱SERS基底；

步骤2、对待处理的动物尿液样品进行净化处理；

步骤3、将净化后的待测液加入SERS基底，随后加入三聚氰胺标准溶液，最后进行拉曼光谱扫描，采集指定范围的光谱数据；

步骤4、基于所采集的光谱数据，对待测液中的克伦特罗进行定性和定量分析。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤1的过程具体为：

首先将90mL，2mg·L^-1的氧化石墨烯溶液加入到10mL，30％的过氧化氢中，并在紫外光照射下搅拌4h；

再将3.50mL经过二次氧化处理后的石墨烯加入到35mL去离子水中，再添加0.35mL，1％的柠檬酸钠溶液；

将混合溶液加热搅拌至沸腾，再向该混合溶液中加入500μL，1％的氯金酸溶液，再加热搅拌10min后撤去热源；

继续搅拌冷却至室温，即得到氧化石墨烯负载金纳米溶胶rGO/AuNPs。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤2进行前处理的过程具体为：

首先在2mL的尿液样品中加入10μL氢氧化钠溶液和2mL的混合提取溶剂；其中，所述混合提取溶剂为2-乙基己磷酸二酯和二氯甲烷，两者的体积比为1:800；

然后将混合液振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，并移取下层液；

再加入2mL硝酸溶液，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，再移取2mL的上层液；

再加入10μL氢氧化钠溶液和2mL二氯甲烷，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，再移取上层液体；

然后再加入2mL硝酸溶液，振荡30s，在13500rpm转速下离心30s，所得下层液即为前处理后的待测液。

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，在步骤3中，具体将前处理后的180μL待测液加入600μL表面增强拉曼光谱基底和2μL的三聚氰胺标准溶液中，并混合10s。

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，在步骤3中，进行拉曼光谱扫描的拉曼光谱仪的光谱扫描时间为10s、扫描次数3、平滑参数1、扫描功率为200mw；

所采集的光谱数据范围为500-2500cm^-1。

6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤4的过程具体为：

基于所采集的光谱数据，以Δv＝1265，1474，1602cm^-1处的拉曼吸收峰作为克伦特罗定性峰；

以△v＝709cm^-1的吸收强度为归一化标准，并以△v＝1474cm^-1处的拉曼吸收峰为克伦特罗的定量峰进行定量计算。