CN1510148A - 建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立的HBV DNA的探测系统的方法。它是以HBV DNA1873－1912位为靶序列设计寡核苷酸探针，探针包含26个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分长20个核苷酸，另外一小部分为6个核苷酸，将寡核苷酸的5’端或3’端进行烷烃硫醇修饰；将烷烃硫醇修饰的探针通过Au－S键共价结合于Au纳米颗粒或Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒上，采用操控俘捉探针，并在检测系统中加入连接链和信号放大物质，从而实现了临床上HBVDNA及其变异的超灵敏探测。本发明将DNA结合的特异性与纳米材料独有的特性有机地结合起来，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及病毒基因检测技术领域。具体地讲是利用Fe3O4(核)/金(壳)纳米颗粒乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)探针，通过二次放大技术，建立检测HBVDNA及其变异的方法。
背景技术
纳米颗粒是直径为1-100nm的颗粒，在该尺度范围内，纳米材料有很多新的特性，因此它成为科学研究的热点领域。利用纳米材料独特的力、电、光、磁等特性，形成高度学科交叉的纳米生物医学技术，在现实中具有广泛的应用价值。1996年Chad A Mirkin等人将烷烃硫醇修饰的寡核苷酸通过金-硫(Au-S)键共价结合于金纳米颗粒的表面，形成以金纳米颗粒为标记的DNA探针，并利用此探针，检测靶DNA。他们发现：当形成金纳米颗粒聚合体时，靶单链的检测下限可达到10fMol；当形成金纳米单层后加入Ag+对苯二酚液进行放大，靶单链的检测下限可达到50fMol。这一研究成果发表在《科学》上。
病毒性肝炎(特别是乙型肝炎)是严重危害人类健康的重要疾病，据估计全世界HBV携带者有4-5亿。我国是HBV感染高发地区，HBV人群携带率为10-20％，每年由于病毒性肝炎给国家造成的直接经济损失约为500-1000亿元，由此产生的社会负担及其它负面影响更为巨大。乙肝患者(包括肝移植术前术后)经抗病毒治疗后野生型乙肝病毒滴度下降或发生变异(尤其在应用拉米呋啶治疗的患者)，采用传统的生化方法(ELISA，enzyme-linked immunoadsordent assay)不能检出，PCR(polymorase chainreaction)技术因存在一定假阳性有其应用局限性。HBV变异后可产生免疫逃逸、抗疫苗性及抗药性等，病情易恶化并严重威胁患者的生命。目前尚未有文献公开利用利用Fe3O4(核)/金(壳)纳米颗粒乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸探针，通过二次放大技术，检测HBV DNA及其变异的方法。
发明内容
本发明的目的是将DNA结合的特异性与纳米材料独有的特性很好地整合起来，建立了一种新型的DNA探测系统，实现HBV DNA及其变异的超灵敏探测。
本发明是这样实现的：a、以HBV DNA为靶序列设计寡核苷酸探针，探针包含21-60个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分长15-50个核苷酸，另外一小部分为6-10个核苷酸，将寡核苷酸的5’端或3’端进行烷烃硫醇修饰；用化学方法合成寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。寡核苷酸中主要部分是与HBVDNA的突变区或保守区互补的，长15-50个核苷酸；另外一小部分为6-10个核苷酸T，以保证寡核苷酸中的主要部分与其互补区充分结合。
b、将烷烃硫醇修饰的探针通过Au-S键共阶结合于Au纳米颗粒或Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒上；
c、采用操控俘捉探针；
d、检测系统中加入连接链和信号放大物质。
此发明的主要优点有三个：
1、信号二次放大效应，实现了HBV DNA的超灵敏探测。针对HBV DNA设计的金纳米颗粒DNA探针与靶单链在溶液中杂交，在此基础上设计连接链替代靶单链以形成金纳米颗粒聚合体，极大地减少靶单链的需用量(信号一次放大)；随后加入银(Ag+)-对苯二酚液，Ag+离子将从金纳米颗粒表面或溶液中夺得一个电子而还原为Ag原子，并附着于金纳米颗粒表面上(信号二次放大，放大约105倍)。两次放大可使DNA的检测下限小于0.1fMol(目前国际上可探测的敏感度为10fMol)，通过对聚合体灰度的分析，定性或半定量地检测出已知序列的HBV DNA片段，从而实现HBV DNA的超灵敏探测。同时，利用Au纳米颗粒的等离子共振信号在DNA变性温度范围极其敏感的特点：寡核苷酸修饰的Au纳米颗粒体系的光吸收随温度变化的曲线在DNA变性温度附近的变化极陡锐，其一次微分的半峰宽Full Width atHalf Maximum(FWHM)～2℃，而通常DNA的FWHM～15℃，从而提高了DNA杂交的特异选择性。
2、我们发明并应用Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒，极大地减小了杂交的位阻效应，以确保杂交率。传统的Au纳米颗粒无内核，我们所构建的HBVDNA的俘捉探针因含有Fe3O4内核，通过磁场加以控制，既可将靶单链从待检样品中预分离，又可借助磁场在基底上形成覆盖率可控的Fe3O4(核)/Au(壳)-Au纳米颗粒单层，从而极大地减小了杂交的位阻效应，确保HBV DNA样品中靶单链的检测下限达到0.1fMol。
3、该技术的另一个显著的优点就是检测成本低。其主要耗材是烷烃硫醇-寡核苷酸修饰的金纳米颗粒。假设每个聚合体有近千个金纳米颗粒，每个金纳米颗粒(直径约15nm)连接约220条寡核苷酸(实际数可低30-50％)，若探测系统含有近千个聚合体，则共需寡核苷酸的数目约为2.2×108条。而购买烷烃硫醇修饰的寡核苷酸(20D值，HPLC纯化)的价格约为1100～1500元，其中含有约1×1016条寡核苷酸。而且金纳米颗粒的制备成本也很低。每次探测耗材(烷烃硫醇修饰的寡核苷酸、金纳米颗粒)的费用少于1元。如果该技术能实现集成自动化的仪器检测，将具有很大的利润空间和价格优势。
附图说明
附图Fe3O4(核)/金(壳)纳米颗粒HBV DNA探针检测过程示意图
具体实施方式
寡核苷酸的设计与合成：
寡核苷酸探针包含26个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分是与HBV DNA的突变区或保守区互补的，长20个核苷酸；另外一小部分为6个核苷酸T，以保证寡核苷酸中的主要部分与其互补区充分结合。
1、各型乙型肝炎HBV DNA(急性、慢性/重型、轻型及病毒携带者)变异株、野生株的筛选、克隆和纯化。找出与乙型肝炎病情发生发展相关的突变区并进行系统研究，针对常见突变的区域设计探针；同时设计HBV DNA保守序列区域的探针。以HBV DNA(accession：X75658)1873-1912位为靶序列设计探针：
①设计的探针c(probe c)与靶单链的1893-1912位互补，探针c序列为：
5’-ttt ttt gtc aat gtc cat gcc cca aa-3’。
②连接链(linker)的设计：连接链长40bp，序列为：
5’-caa gct gtg cct tgg gtg gcg ggg ggg ggg ggg ggg ggg g-3’
前20bp与靶单链上未跟probe c杂交的部分(即1873-1892位)相同，后20bp不与probe c互补或相似。以linker替代靶单链形成金纳米颗粒聚合体，可大大减少了靶单链的需用量，达到超灵敏地探测DNA。
③对连接链上的这两段分别设计出探针a(probe a)和探针b(probeb)，
probe a序列为：5’-gcc acc caa ggc aca gct tgt ttt tt-3’
probe b序列为：5’-ttt ttt ccc ccc ccc ccc ccc ccc cc-3’
它们与连接链严格地互补。
探针的设计结果是：probe a和probe c可与靶单链上不同段互补结合，probe a和probe b可与linker上不同段互补结合。将烷烃硫醇修饰寡核苷酸的5’端或3’端。用化学方法合成寡核苷酸，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
2、将烷烃硫醇修饰的探针通过Au-S键共价结合于Au纳米颗粒或Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒上，形成探针链：
以超顺磁性的Fe3O4(核)/Au(壳)结构的纳米颗粒偶联烷烃硫醇修饰的probe c，构成靶单链的俘捉探针。在被检样品中俘捉探针通过杂交(加热、退火)而俘捉靶单链，通过磁场操控、清洗，实现被检靶单链的初步分离，并可避免芯片设计带来的位阻影响。
用Au纳米颗粒分别偶联烷烃硫醇修饰的probe a或probe b，用来形成Au纳米颗粒聚合体。
将金纳米颗粒与烷氢硫醇修饰的寡核苷酸连接，其连接方法如下：
(1)5ml柠檬酸处理的10nM金纳米颗粒溶液与2.5OD烷氢硫醇修饰的寡核苷酸(终浓度为3.61uM)混合，放置24小时；
(2)加入0.1M氯化钠，10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7)，放置40小时，14,000转/分，25分钟，去上清；
(3)加入5ml 0.1M氯化钠，10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7)，洗红色油状沉淀，14,000转/分，25分钟，去上清；
(4)沉淀重悬于5ml新鲜0.3M氯化钠，10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7)，0.01％叠氮钠溶液中。
3.探测流程
①probe c[Fe3O4(核)/Au(壳)]与待检样品混合，与靶单链杂交后，加磁场分离，清洗。
②加入probe a，与靶单链另一段杂交后，probe a颗粒即与probec[Fe3O4(核)/Au(壳)]连接，加强磁场，超顺磁性的Fe3O4(核)/Au(壳)纳米颗粒将拉着probe a的Au纳米颗粒向下沉并被吸于底部，排列，不易被洗去。
③依次加入linker、probe b、probe a，并重复多次，使在上一步中probe a的Au纳米颗粒处为固定点，形成降落伞状层叠的含有probe a、probe b的Au纳米颗粒聚合体(信号一次放大)。
④加入Ag+对苯二酚液，Ag+离子将从金纳米颗粒表面或溶液中夺得一个电子而还原为Ag原子，并附着于金纳米颗粒表面上，薄膜表面随即呈现灰黑的颜色，靶越多，颜色越黑(信号二次放大，放大约105倍)。
⑤通过对聚合体灰度的分析，定性或半定量地检测出已知序列的HBVDNA片段。
Claims (9)
1、建立一种乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是：
a、以HBV DNA为靶序列设计寡核苷酸探针，探针包含21-60个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分长15-50个核苷酸，与HBV DNA的突变区或保守区互补；另外一小部分为6-10个核苷酸T，将寡核苷酸的5’端或3’端进行烷烃硫醇修饰；
b、将烷烃硫醇修饰的探针通过Au-S键共价结合于Au纳米颗粒或Fe3O4核/Au壳纳米颗粒上；
c、采用磁场操控俘捉探针；
d、检测系统中加入连接链和信号放大物质。
2、如权利要求1所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是以HBV DNA 1873-1912位为靶序列设计寡核苷酸探针。
3、如权利要求1所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是探针包含26个核苷酸，由两部分组成，其中主要部分与HBVDNA的突变区或保守区互补，长20个核苷酸，另外一小部分是6个核苷酸T。
4、如权利要求1所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是寡核苷酸探针包括俘捉探针c，它与靶单链的一段互补；连接链长30-40bp，其中一段与靶单链上未跟探针c杂交的部分相同，另一段不与探针c互补或相似；探针a和探针b与连接链严格地互补。
5、如权利要求4所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是俘捉探针c序列为：5’-ttt ttt gtc aat gtc cat gcc ccaaa-3’，它与靶单链的1893-1912位互补。
6、如权利要求4所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是连接链长40bp，序列为：5’-caa gct gtg cct tgg gtg gcgggg ggg ggg ggg ggg ggg g-3’，前20bp与靶单链上未跟探针c杂交的部分即1873-1892位相同，后20bp为20个核苷酸G，不与探针c互补或相似。
7、如权利要求4所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是探针a序列为：5’-gcc acc caa ggc aca gct tgt ttt tt-3’，探针b序列为：5’-ttt ttt ccc ccc ccc ccc ccc ccc cc-3’，它们与连接链严格地互补。
8、如权利要求1所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征是通过磁场操控俘捉探针。
9、根据权利要求书1所述建立乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的探测系统的方法，其特征在于检测系统中加入的信号放大物质是Ag+对苯二酚液。
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2002
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