CN105749257B - 一种血红蛋白类携氧纳米凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血红蛋白类携氧纳米凝胶,它是聚乙二醇‑聚乙烯亚胺嵌段共聚物与血红蛋白的共价结合物经交联形成的纳米水凝胶,其中,血红蛋白上连接有结合珠蛋白;所述的聚乙二醇‑聚乙烯亚胺嵌段共聚物中,聚乙烯亚胺嵌段上含有接枝基团。本发明还公开了前述血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法和用途。本发明血红蛋白类携氧纳米凝胶对血管内皮细胞的毒性低,可克服现有血红蛋白类携氧载体副作用强的缺陷,具有良好的应用前景和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种血红蛋白类携氧纳米凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
输血在现代医疗中发挥了重要作用,是临床手术、抗灾和战场救治不可缺少的医疗手段。但是,传统输血还有很多弊端。例如,其血源单一,主要靠献血,而且由于人类血型复杂,需要进行严格的配型后才能使用,限制了其对急重症病人的救治和在紧急突发事件环境下的应用。更为严重的是血液易于受到肝炎,艾滋病等病毒的污染,以及现在越来越关注的新旧血问题,使得输血安全受到威胁。随着医疗技术的发展,血液的需求量不断增高,而安全有效的血源却日益紧缺。
人体血液由血浆、红细胞、白细胞和血小板组成,成分非常复杂,要制造出一种可完全代替血液的溶液非常困难,或者说几乎不可能;但研制一种临时替代品,在急需情况下短时间内代替血液中某种组分的作用却具有可行性。作为血液的重要组成部分,血红蛋白(Hemoglobin,Hb)位于红细胞内,是机体运输氧的主要媒介。但是,单纯的血红蛋白溶液并不能直接输注,因为脱离红细胞的血红蛋白失去2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)的调节,氧亲和力急剧升高,不能向组织有效供氧。而游离血红蛋白在各种酶的作用下也会迅速解聚为二聚体和单体,经肾排泄或堵塞肾小管,产生强烈的肾毒性。此外,血红蛋白缺少了红细胞内还原酶系统的作用,会很容易氧化成高铁血红蛋白(MetHb),失去携氧能力并产生自由基,造成机体氧化应激损伤。因此,需要对血红蛋白进行必要的修饰或处理,由此产生的一类制品统称为血红蛋白类携氧载体(HBOCs)。
近几十年,HBOCs一直是血液代用品研发的重点。通过对血红蛋白进行修饰,调整血红蛋白的有效分子半径,同时对黏滞度和携氧释氧能力等进行优化,以减少上述血红蛋白的不良反应,增加氧输送效果和在血浆中的存留时间,形成安全、有效的血液代用品。从理论上讲,1)HBOCs类制品无免疫原性,无传染性病毒污染,体积远小于正常的红细胞,普通血细胞无法通过微毛细血管,而HBOCs可以自由通过,对机体灌注和氧供会更加充分;2)具有良好的携氧释氧能力,且能够通过2,3-DPG的类似物调节修饰。此外,其P50值,Bohr效应,Hill系数等都与生理状态下全血类似,能更好地满足器官组织的氧供需平衡;3)HBOCs分子量远低于正常红细胞,因此黏度较低,也有利于组织灌注;4)HBOCs制品一般保存期限为1-2年,远长于成人全血。
HBOCs的研发过程主要分为三代。第一代是用小分子修饰血红蛋白或用交联剂聚合血红蛋白。第二代为血红蛋白分子与抗氧化酶如超氧化物岐化酶、过氧化氢酶等交联形成多聚物。用于制备这2代HBOCs,较为成熟的化学修饰和交联方法包括,聚乙二醇(PEG)修饰,开环棉籽糖交联,双阿司匹林交联,戊二醛(GDA)交联等,产品包括HemAssist,Polyheme,HemoLink,Hemopure(HBOC-201),Hemospan(MP4),Gelenpol,HemoTech,Hemoximer等。这2代HBOCs产品在临床实践中,都发现了很多缺陷。雅培公司开发的HemAssist属第1代产品,因在III期临床试验中发现受试者死亡率明显增加而放弃。HemAssist和Polyheme也因为临床试验中出现严重心脏毒性而终止研究。美国Biopure公司研发的Hemopure(戊二醛交联的聚合牛血红蛋白)是目前唯一已经获准在临床应用的产品,但仅限于在南非上市。因为III期临床研究中暴露出心血管方面的安全性问题,也停止了进一步的研发。2008年,Natanson和其同事在世界著名的医学杂志《JAMA》上发表了1篇有关HBOC临床试验的Meta分析,指出其增加了患者的死亡率并有潜在的引起心肌梗死的风险。同时,《JAMA》杂志为这篇文章配发了编者按,指出在明确HBOC制品潜在毒副作用及其机理之前,不应再开展进一步的临床试验。Natanson等的结论,间接导致2009年美国FDA拒绝了Northfield公司HBOC产品(PolyHeme)的上市请求,引起了整个HBOC行业内部的极大震动。针对HBOCs制品输注后的毒副反应,学术界的观点普遍认为是由于HBOC中游离或未聚合的血红蛋白,包括氧合或非氧合状态,透过内皮屏障,消耗内皮舒张因子一氧化氮(NO);同时,血红蛋白本身的氧化还原反应,生成的氧自由基造成机体氧化应激反应。
目前,研究者们正致力于第三代HBOCs的开发,它们与第一代和第二代最明显的区别是在携氧血红蛋白外面用膜或高分子材料包裹,使之更加接近红细胞的实际结构,称作包裹血红蛋白。加拿大的TMS Chang报道了使用聚乙二醇-聚乳酸胶囊包裹的血红蛋白,胶囊粒径100nm左右。日本的Tsuchida Eishun制备了细胞型血红蛋白(Hemoglobin Vehicle,HbV),粒径250nm左右。但是,这类制品仍有缺陷,如包材,尤其是磷脂价格昂贵且不稳定,工艺也较复杂,物理包裹后的血红蛋白也无法避免血红蛋白突释现象,有潜在的输注风险。
公开号为102861322的专利申请公开了一种血红蛋白类携氧载体,其包含血红蛋白、结合珠蛋白和聚乙二醇-聚酯纳米粒,血红蛋白通过结合珠蛋白连接在聚乙二醇-聚酯纳米粒表面,它通过血红蛋白可与结合珠蛋白形成稳定的复合物,在一定程度上降低了血红蛋白的毒性,但是还是具有一定的毒性,需要进一步改进。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种新的血红蛋白类携氧纳米凝胶。
本发明血红蛋白类携氧纳米凝胶,它是聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物与血红蛋白的共价结合物经交联形成的纳米水凝胶,其中,血红蛋白上连接有结合珠蛋白;
所述的聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物中,聚乙烯亚胺嵌段上含有接枝基团。
优选地,所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺两嵌段共聚物由单官能团化聚乙二醇、聚乙烯亚胺与接枝单体制备而成,其中,聚乙二醇与聚乙烯亚胺的摩尔比为1-10:1;其中,接枝单体的接枝率为8~30%。
优选地,所述单官能团化聚乙二醇为聚乙二醇单甲醚。进一步优选地,所述聚乙二醇单甲醚的分子量为2000-10000。
优选地,所述聚乙烯亚胺为支链聚乙烯亚胺,其分子量为600-10000。
优选地,所述的接枝单体(巯基化官能团单体)为α-硫辛酸、2-亚氨基硫烷或巯基聚乙二醇NHS酯,其中,巯基聚乙二醇NHS酯的分子量Mn=200。
优选地,聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物中,接枝单体(巯基化官能团单体)的接枝率为22-30%。
优选地,所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物的分子量为2480~19600。
进一步优选地,所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物(即mPEG-PEI-g-SH或mPEG-PEI-g-α-LA)的分子量为2480~2660、6620~6840、11600~11800或18800~19600。
优选地,所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺两嵌段共聚物与血红蛋白经二硫键连接。
优选地,所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺两嵌段共聚物与血红蛋白的摩尔比为3-10:1。
优选地,所述血红蛋白与血红蛋白之间通过双(3,5-二溴水杨基)延胡索酸脂(DBBF)两两连接。
优选地,所述血红蛋白与结合珠蛋白的摩尔比为1-20:1。
优选地,所述纳米凝胶的粒径为80-400nm;所述纳米凝胶的血红蛋白载药率8-45%;所述纳米凝胶中血红蛋白的氧亲和力P50值10-36;所述纳米凝胶的Hill系数1.30-2.90;所述纳米凝胶的pH值7.2-7.5,
本发明还提供了前述血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法,其特征在于:步骤如下:取聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物,加入血红蛋白,形成载血红蛋白的纳米水凝胶,再加入结合珠蛋白,即可。
其中,所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物的制备方法为:
按照如下三种制备mPEG-PEI方法的任意一种制备mPEG-PEI,再按照如下三种制备接枝的方法制备含有接枝基团的共聚物:
制备mPEG-PEI的方法1:
1)取聚乙二醇单甲醚,以无水甲苯溶解,得聚乙二醇单甲醚溶液;
2)再称取聚乙二醇单甲醚10倍摩尔量的异氟尔酮二异氰酸酯溶于甲苯溶液,加入催化量辛酸亚锡,得异氟尔酮二异氰酸酯溶液;
3)将步骤1)和步骤2)得到的两种溶液混合,80℃回流反应8~10小时,将所得产物用石油醚沉淀,真空干燥,得到mPEG-IPDI;
4)将步骤3)得到的mPEG-IPDI,溶于甲苯溶液,再加入催化量的辛酸亚锡;
5)取mPEG-IPDI1.1倍摩尔量的聚乙烯亚胺,溶于无水甲苯,得聚乙烯亚胺溶液,于40℃、氮气保护条件下逐滴滴加步骤4)得到的溶液,滴加完毕后,体系升温至80℃,继续反应10小时;
6)石油醚沉淀,真空干燥,透析纯化,干燥,即可;
制备mPEG-PEI的方法2:
1)取聚乙二醇单甲醚,溶于二氯甲烷,于室温及高纯氮气流保护条件下,加入2倍摩尔量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚吗反应0.5h后,再加入1倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺反应2h;
2)将步骤1)所得产品滴加到聚乙烯亚胺的二氯甲烷溶液中,40℃油浴中反应6-12小时后终止反应;
3)待反应体系温度降到室温后,倒入冰石油醚中沉淀,将沉淀过滤,溶剂挥发至聚合物固化,真空干燥,透析纯化,干燥,即可;
制备mPEG-PEI的方法3:
1)取丙烯酰基聚乙二醇单甲醚,溶于二氯甲烷/甲醇中,在高纯氮气流保护条件下,滴加到聚乙烯亚胺的无水甲醇溶液中,滴加完毕后于45℃油浴中反应24-48小时;
2)倒入冰石油醚中沉淀,将沉淀过滤,溶剂挥发至聚合物固化,真空干燥,透析纯化,干燥,即可;
接枝方法1:将制得的mPEG-PEI溶解于NaHCO3/EDTA溶液中,在高纯氮气流保护条件下,按照摩尔比1:1-10加入2-亚氨基硫烷,反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可;
接枝方法2:将制得的mPEG-PEI溶解于0.01M的PBS缓冲溶液中,在高纯氮气流保护条件下,按照摩尔比1:1-5加入SH-PEG-NHS(Mn=200),室温条件下反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可;
接枝方法2:取α-硫辛酸溶解于DMF/H2O中,于室温及高纯氮气流保护条件下,加入2倍摩尔量EDC反应0.5h后,再加入1倍摩尔量NHS反应2h;将上述反应溶液匀速滴加制得的mPEG-PEI的DMF/H2O溶液,40℃油浴中反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可。
其中,反应的步骤为:取聚乙二醇-聚乙烯亚胺嵌段共聚物,溶解于0.1M Tris缓冲液中,氮气流下加入0.1%的二硫苏糖醇,反应2h后,于4℃加入双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯修饰的血红蛋白,4℃避光搅拌反应6-12h后,除去游离血红蛋白,得载血红蛋白的纳米水凝胶;将载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液,加入结合珠蛋白,4℃避光振荡反应4小时,反应产物在10000g下冷冻高速离心分离。
本发明还提供了前述血红蛋白类携氧纳米凝胶在制备血红蛋白类携氧载体中的用途。
本发明血红蛋白类携氧纳米凝胶对血管内皮细胞的毒性低,可克服现有血红蛋白类携氧载体副作用强的缺陷,安全性显著提高,具有良好的应用前景和经济效益。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明所涉新型血红蛋白/结合珠蛋白类携氧纳米凝胶的示意图;
图2 A、B为实施例一中mPEG-PEI和mPEG-PEI-G-SH共聚物的合成路线图;
图3 A为实施例二中mPEG-PEI-G-SH共聚物的1H-NMR图谱;B为实施例三中mPEG-PEI-G-SH共聚物的1H-NMR图谱;C为实施例四中mPEG-PEI-g-α-LA共聚物的1H-NMR图谱;D为实施例五中mPEG-PEI-g-α-LA共聚物的1H-NMR图谱;
图4 A为实施例二空白纳米凝胶采用MALVERN粒径仪检测出的结果;B为实施例二载有血红蛋白的纳米凝胶采用MALVERN粒径仪检测出的结果;
图5 A为实施例三空白纳米凝胶采用MALVERN粒径仪检测出的结果;B为实施例三载有血红蛋白的纳米凝胶采用MALVERN粒径仪检测出的结果;
图6 A为实施例四空白纳米凝胶采用MALVERN粒径仪检测出的结果;B为实施例四载有血红蛋白/结合珠蛋白的纳米凝胶采用MALVERN粒径仪检测出的结果;
图7 A为实施例三空白纳米凝胶的透射电镜(TEM)图;B为实施例三载有血红蛋白/结合珠蛋白的纳米凝胶的透射电镜(TEM)图
图8 A为实施例四空白纳米凝胶的透射电镜(TEM)图;B为实施例四载有血红蛋白/结合珠蛋白的纳米凝胶的透射电镜(TEM)图
图9 A为实施例三中载有血红蛋白/结合珠蛋白的纳米凝胶的UV吸收光谱;B为实施例三中载有血红蛋白的纳米凝胶的XPS能谱;
图10 A为实施例三载有血红蛋白的纳米凝胶采用MTT法测定的细胞毒性结果;B为实施例四载有血红蛋白的纳米凝胶采用MTT法测定的细胞毒性结果
具体实施方式
主要仪器及试剂:
核磁共振仪:Varian 400,Varian公司,USA;
马尔文激光衍射粒度仪:Nano-ZS,Malvern Instrument,UK;
凝胶渗透色谱仪:Agilent 110,Agilent公司,USA;
透射电镜:Hitachi H-6009IV,Hitachi公司,Japan;
血气分析仪:ABL 800FLEX,Radiometer公司;BC-3000PLUS,迈瑞公司,中国;
HEMOXTM分析仪:TCS Scientific,USA;
pH电极:Mettler Toledo公司,USA;
聚乙二醇单甲醚(mPEG),购自美国Aldrich公司,分析纯;
丙烯酰基聚乙二醇单甲醚(mPEG-ACLT)、羧基聚乙二醇单甲醚(mPEG-COOH)、巯基聚乙二醇NHS酯(SH-PEG-NHS)购自北京键凯公司,分析纯;
聚乙烯亚胺(PEI)购自美国Alfa Asea公司,分析纯;
异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane,Traut’s试剂)、α-硫辛酸(α-LA)购自美国Sigma公司,分析纯;
二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乳酸、磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)均购于成都科龙化学试剂公司;
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)购自美国Sigma公司;
细胞培养基DMEM、胎牛血清FBS购自Gibco BRL公司;
人胚肾细胞(HEK293)、人脐静脉内皮细胞(HUVECs)来自四川大学华西医院麻醉与危重急救实验室。
实施例一:本发明原料的制备
1、mPEG-PEI的合成方法1
称取聚乙二醇单甲醚mPEG(Mw=2000-10000)于三颈瓶中,以无水甲苯溶解后,称取10倍摩尔量的异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)溶于甲苯溶液,加入催化量辛酸亚锡,将上述两溶液混合,80℃回流反应8~10小时。所得产物用冰石油醚(指在-20度冻4h以上的石油醚)沉淀,重复多次,40℃真空干燥48h后得到mPEG-IPDI备用;
接着精确称取1.1倍摩尔量支链PEI(聚乙烯亚胺)(Mw=600-10000)溶于无水甲苯,磁力搅拌助溶;
然后将上步反应所得到的MPEG-IPDI,溶于甲苯溶液并转移到恒压漏斗中,再加入催化量的辛酸亚锡,于40℃、氮气保护条件下将恒压漏斗内的液体逐滴滴加到PEI溶液中,滴加完毕后,体系升温至80℃,继续反应10小时。反应结束后,用石油醚沉淀多次,经40℃真空干燥、透析纯化(用水透析)后,冷冻干燥可得到mPEG-PEI。
mPEG-PEI的合成方法2:
将羧基聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH(Mw=2000-10000)溶于二氯甲烷,置于三颈瓶中,于室温及高纯氮气流(纯度大于97%的氮气流)保护条件下,加入2倍摩尔量EDC反应0.5h后,再加入1倍摩尔量NHS反应2h。将上述反应溶液匀速滴加到支链PEI(Mw=600-10000)的二氯甲烷溶液中,40℃油浴中反应6-12小时后终止反应,待反应体系温度降到室温后,将聚合物倒入冰石油醚(指在-20度冻4h以上的石油醚)中沉淀,将沉淀过滤,置于通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化,产物真空干燥后经透析纯化,再冻干即可得到mPEG-PEI。
mPEG-PEI的合成方法3:
将丙烯酰基聚乙二醇单甲醚mPEG-ACLT(Mw=2000-10000)以二氯甲烷/甲醇混合溶液(二氯甲烷和甲醇的比例是1:3)溶解后,置于恒压滴液漏斗中,在高纯氮气流(纯度大于97%的氮气流)保护条件下,匀速滴加至支链PEI(Mw=600-10000)的无水甲醇溶液,滴加完毕后于45℃油浴中反应24-48小时进行迈克尔加成反应。待反应终了,将聚合物倒入冰石油醚中沉淀,反复多次后沉淀过滤,置于通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化,产物真空干燥后经透析纯化,再冻干即可得到mPEG-PEI。
上述反应制备得到mPEG-PEI的经1H-NMR和FTIR确证其结构及分子量。反应方程式如图2a所示。
2、活性官能团的添加
mPEG-PEI-g-SH的合成方法1
精密称取实施例一中合成所得的mPEG-PEI溶解于0.1M的NaHCO3溶液(含5mM的EDTA)中,在高纯氮气流(纯度大于97%的氮气流)保护条件下,按照摩尔比1:1-10加入Traut’s试剂,反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可得到mPEG-PEI-g-SH。
mPEG-PEI-g-SH的合成方法2
精密称取实施例一中合成所得的mPEG-PEI溶解于0.01M的PBS缓冲溶液中,在高纯氮气流(纯度大于97%的氮气流)保护条件下,按照摩尔比1:1-5加入SH-PEG-NHS(Mn=200),室温条件下反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可得mPEG-PEI-g-SH共聚物。
mPEG-PEI-g-α-LA的合成方法3
精密称取适量α-LA溶解于DMF/H2O中,于室温及高纯氮气流(纯度大于97%的氮气流)保护条件下,加入2倍摩尔量EDC反应0.5h后,再加入1倍摩尔量NHS反应2h。将上述反应溶液匀速滴加到实施例一中合成所得的mPEG-PEI的DMF/H2O溶液中,40℃油浴中反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可得mPEG-PEI-g-α-LA共聚物。
上述反应制备得到mPEG-PEI-g-SH的经1H-NMR和FTIR确证其结构及分子量。反应方程式如图2b所示。
实施例二 本发明血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶(血红蛋白类携氧纳米凝胶)的制备
1、共聚物材料mPEG-PEI-g-SH的制备
聚乙二醇单甲醚(mPEG-COOH):Mn=2000g/mol
支链PEI(Alfa Asea):Mn=600g/mol
异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI):Mn=222.28g/mol
巯基聚乙二醇NHS酯(SH-PEG-NHS):Mn=200g/mol
使用Mn=2000的mPEG-COOH和Mn=1200的PEI制备本发明的mPEG-PEI-g-SH共聚物材料。具体反应条件见实施例一。具体步骤为:1、按照实施例一中mPEG-PEI合成方法1合成mPEG-PEI;2、按照实施例一中mPEG-PEI-g-SH合成方法2合成得到纳米载体材料mPEG-PEI-g-SH。产物的核磁图如图3a所示,表明已成功合成,经元素分析测定,产物中-SH的接枝率为22%,分子量为2480~2660。
2、DBBF修饰的血红蛋白的制备
参照公开号为CN101200501的专利申请制备,具体方法如下:
(1)取纯化血红蛋白,加入一定浓度的有机磷酸盐,加入一定浓度具有缓冲能力的物质,调节其pH为6.0-8.0;
(2)在低温下0℃-10℃,对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法,进行较彻底脱氧;
(3)加入DBBF(双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯),DBBF∶Hb为2.5∶1,在通氮条件下,反应温度为35℃~40℃,pH值为6.0~8.0,反应时间2.5小时,血红蛋白溶液浓度为50mg/ml;
(4)用氨基酸中止反应,氨基酸与DBBF的摩尔比为2∶1,同样条件下,反应时间2小时。
上述所说的步骤(1)中加入的有机磷酸盐为2、3-DPG类似物,可以预先用NaOH调节好,pH值为6.0~8.0的植酸,在血红蛋白溶液中的浓度为8mM/L。
上述所说的步骤(1)中选用的血红蛋白为人脐带血血红蛋白。
上述所说的步骤(1)中加入一一定浓度具有缓冲能力的物质为Tris~HCl。
上述所说的步骤(2)中脱氧方法为每间隔15min,通N2,抽真空,通小流量N2维持体系脱氧态。
上述所说的步骤(4)中氨基酸是赖氨酸。
DBBF交联人脐带血血红蛋白的α链99位赖氨酸上的氨基发生反应:
2Hb-NH2+HOC-CH2-CH2-COH-→Hb-N=CH-CH2CH2CH-N=Hb
3、血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备
精密称取520mg步骤1制备所得mPEG-PEI-g-SH溶解于0.1M PBS缓冲液(pH 7.3),经抽真空通N2后,在氮气流下加入0.1%DTT(二硫苏糖醇)反应2h后,于4℃加入DBBF(双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯)修饰的血红蛋白840mg,4℃避光搅拌反应6-12h后,用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白,直至洗涤清液在400-600nm区域无吸收为止。将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液,加入400 μg结合珠蛋白,4℃避光振荡反应4小时,反应产物在10000g下冷冻高速离心分离。
如图4所示,终产物血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶其粒径约为60nm,血红蛋白载药率12%,氧亲和力P50值18mmHg,Hill系数1.47,pH值7.2,MTT法检测结果表明该纳米水凝胶对HEK293细胞无明显毒性。
实施例三 本发明血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶(血红蛋白类携氧纳米凝胶)的制备
1、纳米凝胶mPEG-PEI-g-SH的制备
单官能团化聚乙二醇(mPEG-COOH):Mn=5000g/mol
支链PEI(Alfa Asea):Mn=1800g/mol
2-亚氨基硫烷(Traut’s试剂)
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl):
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):
使用Mn=5000的mPEG-COOH和Mn=1800的PEI制备本发明的mPEG-PEI-G-SH共聚物材料。具体反应条件见实施例一。具体步骤为:1、按照实施例一中mPEG-PEI合成方法2合成mPEG-PEI;2、按照实施例一中mPEG-PEI-g-SH合成方法1合成得到纳米载体材料mPEG-PEI-g-SH。产物的核磁图如图3b所示,表明已成功合成,经元素分析测定,产物中-SH的接枝率为30%,分子量为6620~6840。
2、DBBF修饰的血红蛋白的制备
同实施例二。
3、血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备
精密称取700mg步骤1所得mPEG-PEI-g-SH溶解于0.1M Tris缓冲液(pH7.35),经抽真空通N2后,在氮气流下加入0.1%DTT,反应2h后,于4℃加入DBBF修饰的血红蛋白560mg,4℃避光搅拌反应6-12h后,用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白,直至洗涤清液在400-600nm区域无吸收为止。将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液,加入200μg结合珠蛋白,4℃避光振荡反应4小时,反应产物在10000g下冷冻高速离心分离。
如图5所示,终产物血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶其水合半径约为100nm,血红蛋白载药率45%,氧亲和力P50值18mmHg,Hill系数1.47,pH值7.2,MTT法检测结果表明该纳米水凝胶对HEK293细胞无明显毒性。
实施例四 本发明血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶(血红蛋白类携氧纳米凝胶)的制备
1、纳米凝胶mPEG-PEI-g-α-LA的制备
单官能团化聚乙二醇(mPEG-ACLT):Mn=10000g/mol
支链PEI(Alfa Asea):Mn=1800g/mol
α-硫辛酸(α-LA):Mn=206.33g/mol
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl):Mn=191.7g/mol
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):Mn=115.09g/mol
使用Mn=10000的mPEG-ACLT和Mn=1800的PEI制备本发明的mPEG-PEI-g-α-LA共聚物材料。具体反应条件见实施例一。具体步骤为:1、按照实施例一中mPEG-PEI合成方法3合成mPEG-PEI;2、按照实施例一中mPEG-PEI-g-α-LA合成方法3合成得到纳米载体材料mPEG-PEI-g-α-LA。产物的核磁图如图3c所示,表明已成功合成,经元素分析测定,产物中-LA的接枝率为26%,分子量为11600~11800。
2、DBBF修饰的血红蛋白的制备
同实施例二。
3、血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备
精密称取600mg步骤1所得mPEG-PEI-g-α-LA溶解于0.1M HEPES缓冲液(pH 7.4),经抽真空通N2后,在氮气流下加入0.1%DTT,反应2h后,于4℃加入DBBF修饰的血红蛋白280mg,4℃避光搅拌反应6-12h后,用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白,直至洗涤清液在400-600nm区域无吸收为止。将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液,加入100μg结合珠蛋白,4℃避光振荡反应2小时,反应产物在10000g下冷冻高速离心分离。
如图6所示,终产物血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶其粒径约为220nm,血红蛋白载药率28%,氧亲和力P50值18mmHg,Hill系数1.47,pH值7.2,MTT法检测结果表明该纳米水凝胶对HEK293细胞无明显毒性。
实施例五本发明血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶(血红蛋白类携氧纳米凝胶)的制备
1、纳米凝胶mPEG-PEI-g-SH的制备
单官能团化聚乙二醇(mPEG-ACLT):Mn=10000g/mol
支链PEI(Alfa Asea):Mn=10000g/mol
巯基聚乙二醇NHS酯(SH-PEG-NHS):Mn=200g/mol
α-硫辛酸(α-LA):Mn=206.33g/mol
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl):Mn=191.7g/mol
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):Mn=115.09g/mol
使用Mn=10000的mPEG-ACLT和Mn=10000的PEI制备本发明的mPEG-PEI-G-SH共聚物材料。具体反应条件见实施例一。具体步骤为:1、按照实施例一中mPEG-PEI合成方法3合成mPEG-PEI;2、按照实施例一中mPEG-PEI-G-SH合成方法2合成得到纳米载体材料mPEG-PEI-g-SH。产物的核磁图如图3d所示,表明已成功合成,经元素分析测定,产物中-SH的接枝率为8%,分子量为18800~19600。
2、DBBF修饰的血红蛋白的制备
同实施例二。
3、血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备
同实施例三。
以下用试验例的方式来说明本发明的有益效果:
实验例一 本发明携氧纳米凝胶对血管内皮细胞的作用
1、试验分组
对照A组使用PEG修饰牛血红蛋白(血红蛋白浓度3%;参照专利CN200380109157.8);对照B组使用聚合人脐带血血红蛋白(血红蛋白浓度3%,参照专利CN02133592.3);对照实验C组使用结合珠蛋白-血红蛋白纳米粒(血红蛋白浓度3%,参照公开号CN102861322A);本发明实验D组使用实施例三或实施例四的血红蛋白-结合珠蛋白纳米凝胶(血红蛋白浓度3%);样品临用前均水浴升温到37℃。
2、试验方法
选取人脐静脉内皮细胞株(HUVECs),置于含有100μL DMEM培养基的96孔板中,细胞密度3×103,细胞培养箱中37℃培养24h后,加入上述样品100μL处理2h。空白对照组加入DMEM培养基100μL处理2h。然后行MTT法检测细胞活性。
统计分析:细胞活性采用单因素方差分析,并用LSD检验比较两两差异。P<0.05被认为是有显著性差异。数据以均数±标准差表示,n=5。*P<0.05和**P<0.01vs.对照组(A、B、C)。
3、实验结果
如图10A所示:与空白对照组(Control)比较,对照A组和对照B组内皮细胞损伤明显,活性明显降低;现有文献报道的血红蛋白类携氧载体(结合珠蛋白-血红蛋白纳米粒)(C组)的内皮细胞活性也有明显降低,但是比A组和B组的损伤相对较小;而本发明实施例三制备的血红蛋白-结合珠蛋白纳米凝胶(D组)的内皮细胞活性也有所降低,但是相较A组、B组和C组的活性均显著提高(p<0.01)。
如图10B所示:与现有文献报道的血红蛋白类携氧载体(结合珠蛋白-血红蛋白纳米粒)(C组)相比,本发明实施例四制备的血红蛋白-结合珠蛋白纳米凝胶(D组)的内皮细胞活性明显提高(p<0.01)。
结论:本发明产品对内皮细胞无明显毒性,说明本发明产品的心血管副作用小,安全性高。
本发明血红蛋白类携氧纳米凝胶对血管内皮细胞的毒性低,载药率高,氧亲和力高,可克服现有血红蛋白类携氧载体副作用强的缺陷,具有良好的应用前景和经济效益。
Claims (7)
1.一种血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法,其特征在于:它包括如下步骤:
(1)纳米凝胶mPEG-PEI-g-SH的制备:
将摩尔质量为5000g/mol的羧基聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶于二氯甲烷,于室温及纯度大于97%的氮气流保护条件下,加入2倍摩尔量EDC·HCl反应0.5h后,再加入1倍摩尔量NHS反应2h,将上述反应溶液匀速滴加到摩尔质量为1800g/mol的支链PEI的二氯甲烷溶液中,40℃油浴中反应6-12小时后终止反应,待反应体系温度降到室温后,将聚合物倒入冰石油醚中沉淀,将沉淀过滤,使溶剂挥发至聚合物固化,产物真空干燥后经透析纯化,再冻干即可得到mPEG-PEI;将mPEG-PEI溶解于0.1M的NaHCO3溶液中,所述NaHCO3溶液中含5mM的EDTA,在纯度大于97%的氮气流保护条件下,按照摩尔比1:1-10加入Traut’s试剂,反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可得mPEG-PEI-g-SH;所述mPEG-PEI-g-SH中-SH的接枝率为30%,分子量为6620~6840;
(2)DBBF修饰的血红蛋白的制备:
A、取纯化血红蛋白,加入有机磷酸盐,加入具有缓冲能力的物质,调节其pH为6.0-8.0;
B、在低温下0℃-10℃,对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法,进行脱氧;
C、加入DBBF,DBBF∶Hb为2.5∶1,在通氮条件下,反应温度为35℃~40℃,pH值为6.0~8.0,反应时间2.5小时,血红蛋白溶液浓度为50mg/ml;
D、用氨基酸中止反应,氨基酸与DBBF的摩尔比为2∶1,反应时间2小时;
(3)血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备:
称取700mg步骤(1)所得mPEG-PEI-g-SH溶解于0.1M Tris缓冲液,经抽真空通N2后,在氮气流下加入0.1%DTT,反应2h后,于4℃加入步骤(2)制备的DBBF修饰的血红蛋白560mg,4℃避光搅拌反应6-12h后,用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白,直至洗涤清液在400-600nm区域无吸收为止,将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液,加入200μg结合珠蛋白,4℃避光振荡反应4小时,反应产物在10000g下冷冻高速离心分离,即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中,所述冰石油醚为在-20度冻4h以上的石油醚;
和/或,步骤(2)的步骤A中,所述有机磷酸盐为2、3-DPG类似物,预先用NaOH调节好,pH值为6.0~8.0的植酸,在血红蛋白溶液中的浓度为8mM/L;
和/或,步骤(2)的步骤A中,所述血红蛋白为人脐带血血红蛋白;
和/或,步骤(2)的步骤A中,所述具有缓冲能力的物质为Tris-HCl;
和/或,步骤(2)的步骤B中,所述脱氧方法为每间隔15min,通N2,抽真空,通小流量N2维持体系脱氧态;
和/或,步骤(2)的步骤D中,所述氨基酸是赖氨酸。
3.一种血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法,其特征在于:它包括如下步骤:
①纳米凝胶mPEG-PEI-g-α-LA的制备:
将摩尔质量为10000g/mol的丙烯酰基聚乙二醇单甲醚mPEG-ACLT以二氯甲烷和甲醇的比例是1:3的二氯甲烷/甲醇混合溶液溶解后,置于恒压滴液漏斗中,在纯度大于97%的氮气流保护条件下,匀速滴加至摩尔质量为1800g/mol的支链PEI的无水甲醇溶液,滴加完毕后于45℃油浴中反应24-48小时进行迈克尔加成反应,待反应终了,将聚合物倒入冰石油醚中沉淀,反复多次后沉淀过滤,使溶剂挥发至聚合物固化,产物真空干燥后经透析纯化,再冻干即可得到mPEG-PEI;
称取摩尔质量为206.33g/mol的α-LA溶解于DMF/H2O中,于室温及纯度大于97%的氮气流保护条件下,加入2倍摩尔量的摩尔质量为191.7g/mol的EDC·HCl反应0.5h后,再加入1倍摩尔量的摩尔质量为115.09g/mol的NHS反应2h,将上述反应溶液匀速滴加到mPEG-PEI的DMF/H2O溶液中,40℃油浴中反应12-24小时后终止反应,产物经透析纯化,再冻干即可得mPEG-PEI-g-α-LA;所述mPEG-PEI-g-α-LA中-LA的接枝率为26%,分子量为11600~11800;
②DBBF修饰的血红蛋白的制备:
a、取纯化血红蛋白,加入有机磷酸盐,加入具有缓冲能力的物质,调节其pH为6.0-8.0;
b、在低温下0℃-10℃,对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法,进行脱氧;
c、加入DBBF,DBBF∶Hb为2.5∶1,在通氮条件下,反应温度为35℃~40℃,pH值为6.0~8.0,反应时间2.5小时,血红蛋白溶液浓度为50mg/ml;
d、用氨基酸中止反应,氨基酸与DBBF的摩尔比为2∶1,反应时间2小时;
③血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备:
称取600mg步骤①所得mPEG-PEI-g-α-LA溶解于0.1M HEPES缓冲液,经抽真空通N2后,在氮气流下加入0.1%DTT,反应2h后,于4℃加入步骤②制备得到的DBBF修饰的血红蛋白280mg,4℃避光搅拌反应6-12h后,用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白,直至洗涤清液400-600nm区域无吸收为止,将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液,加入100μg结合珠蛋白,4℃避光振荡反应2小时,反应产物在10000g下冷冻高速离心分离,即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
步骤②的步骤a中,所述有机磷酸盐为2、3-DPG类似物,预先用NaOH调节好,pH值为6.0~8.0的植酸,在血红蛋白溶液中的浓度为8mM/L;
和/或,步骤②的步骤a中,所述血红蛋白为人脐带血血红蛋白;
和/或,步骤②的步骤a中,所述具有缓冲能力的物质为Tris-HCl;
和/或,步骤②的步骤b中,所述脱氧方法为每间隔15min,通N2,抽真空,通小流量N2维持体系脱氧态;
和/或,步骤②的步骤d中,所述氨基酸是赖氨酸。
5.一种血红蛋白类携氧纳米凝胶,其特征在于:它是由权利要求1~4任一项所述的制备方法制备而得。
6.根据权利要求5所述的纳米凝胶,其特征在于:所述纳米凝胶的粒径为100-220nm;所述纳米凝胶中血红蛋白的氧亲和力P50值18mmHg;所述纳米凝胶的Hill系数1.47;所述纳米凝胶的pH值7.2。
7.权利要求5或6所述血红蛋白类携氧纳米凝胶在制备血红蛋白类携氧载体中的用途。
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