CN103251936A - 一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，包含结合珠蛋白、血红蛋白、抗氧化剂和磷酸吡哆醛。通过结合珠蛋白与血红蛋白之间的特异性结合能力，形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物，作为发挥携氧活性的单元。本发明的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体输注后无高血压反应，且对离体心脏有保护作用。因此，可用于临床输血，心脏等重要器官缺血再灌注损伤的保护，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及血液代用品领域，尤其涉及一种血红蛋白类携氧载体-结合珠蛋白复合物的携氧载体及其制备方法。

背景技术

输血在现代医疗中发挥了重要作用，是临床手术、抗灾和战场救治不可缺少的医疗手段。但是，传统输血还有很多弊端。例如，其血源单一，主要靠献血，而且由于人类血型复杂，需要进行严格的配型后才能使用，限制了其对急重症病人的救治和在紧急突发事件环境下的应用。更为严重的是血液易于受到肝炎，艾滋病等病毒的污染，以及现在越来越关注的新旧血问题，使得输血安全受到威胁。随着医疗技术的发展，血液的需求量不断增高，而安全有效的血源却日益紧缺。作为血液的重要组成部分，血红蛋白（Hemoglobin，Hb）位于红细胞内，是机体运输氧的主要媒介。但是，单纯的血红蛋白溶液并不能直接输注，因为脱离红细胞的血红蛋白失去2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）的调节，氧亲和力急剧升高，不能向组织有效供氧，且游离血红蛋白在各种酶的作用下也会迅速解聚为二聚体和单体，经肾排泄或堵塞肾小管，产生强烈的肾毒性。为了克服前述缺陷，对血红蛋白进行必要的修饰或处理，调整血红蛋白的有效分子半径，对黏滞度和携氧释氧能力等进行优化，以减少上述血红蛋白的不良反应，增加氧输送效果和在血浆中的存留时间，产生的一类制品统称为血红蛋白类携氧载体（HBOCs）。

近几十年，HBOCs一直是血液代用品研发的重点。已经有多个HBOCs产品，如HemAssist，Polyheme，HemoLink，Hemopure(HBOC-201)，Hemospan(MP4)等，进入临床试验。但是，临床试验结果显示：HBOCs可能会引起心脏毒性、高血压、胃肠道反应等副作用，增加受试者死亡率。目前，美国Biopure公司研发的Hemopure（戊二醛交联的聚合牛血红蛋白）是唯一已经获准在临床应用的产品，但是仅限于在南非上市。关于HBOCs制品输注后的毒副反应，普遍认为是其由于HBOC中存在游离/未聚合的血红蛋白，其会透过内皮屏障，消耗内皮舒张因子一氧化氮（NO），同时，血红蛋白本身的氧化还原反应生成的氧自由基造成机体氧化应激反应。

结合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）又称触珠蛋白，是一种分子量为85000的酸性糖蛋白，广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中。Hp分子中有两对肽链（α链与β链）共同形成α2β2的四聚体。结合珠蛋白主要在肝脏合成，其降解也在肝脏，半衰期约为3.5～4天。结合珠蛋白的主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，然后被单核—巨噬细胞系统处理掉。正常情况下，人的红细胞在循环血中尽管不断受到机械损伤，但仍可保持其完整性，这与红细胞具有良好可塑性的细胞形态和血液微环境的相对稳定有关。当某种原因诱发红细胞在血管内破坏时，大量血红蛋白会释放到血液循环中，血红蛋白可以从人的肾脏滤过，造成肾脏损害，甚至造成不可逆转的肾功能损伤。当结合珠蛋白与游离血红蛋白结合成稳定的复合物后，由于其分子较大，不能从肾脏排出，这样可以阻止血红蛋白从肾小球滤过，避免游离血红蛋白对肾小管的损害。结合珠蛋白与游离血红蛋白结合成复合物后，呈现出新的抗原决定簇，可被单核细胞、巨噬细胞表面的血红蛋白清除受体（CD163）所识别并结合，之后被吞噬降解，从而除去了血循环中游离的血红蛋白。2012年，李涛等人申请的中国发明专利，申请号：201210281432.5，发明名称：一种血红蛋白类携氧载体及其制备方法，公开了一种血红蛋白类携氧载体，包含血红蛋白、结合珠蛋白和聚乙二醇－聚酯纳米粒，血红蛋白通过结合珠蛋白连接在聚乙二醇－聚酯纳米粒表面。该专利首次提到将结合珠蛋白蛋白用于HBOCs制品的制备。

本申请针对结合珠蛋白良好的血红蛋白结合能力和抗氧化活性，设计并合成了一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，该制品可以有效减轻HBOCs原有的副反应，如升血压（血管活性），增加安全性，并有心脏保护活性，有望成为临床可用的新型红细胞代用品。

发明内容

为了克服现有血红蛋白类携氧载体制品的缺陷，更好地发挥血红蛋白的携氧活性，本发明提供一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体制品，包括结合珠蛋白、血红蛋白、抗氧化剂，血红蛋白通过与结合珠蛋白之间的特异性结合能力，形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物。可选的，携氧载体中还包括磷酸吡哆醛。

上述技术方案中，所述结合珠蛋白来源为人或动物。

上述任一技术方案中，所述血红蛋白来源包括人脐带血、人外周血、牛血或猪血。

上述任一技术方案中，所述血红蛋白为纯化血红蛋白或聚合血红蛋白。

上述任一技术方案中，所述结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比为1：1～10，优选1：3～5。

上述任一技术方案中，所述抗氧化剂选自抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种；优选选抗坏血酸、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种。

上述任一技术方案中，所述抗氧化剂总量与血红蛋白摩尔比为1～15：1；优选10：1。

上述任一技术方案中，所述磷酸吡哆醛与血红蛋白摩尔比为0～8：1；优选1～8：1；更优选4：1。

上述任一技术方案中，所述携氧载体的pH值为7.0-7.4，优选7.4。

本发明还提供一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体的制备方法，包括如下步骤：

a.取结合珠蛋白和血红蛋白，溶于磷酸盐缓冲液中，通入氧气和二氧化碳的混合气体或纯氧饱和5～15分钟，0～4℃避光反应5～30分钟，分离纯化；所述结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比为1:1～10；所述混合气体中氧气和二氧化碳体积比为95:5;

b.加入抗氧剂；

c.加入磷酸吡哆醛；

d.调节混合液pH值7.0～7.4，即得。

其中，所述结合珠蛋白来源为人或动物；所述血红蛋白包括人脐带血血红蛋白、人外周血血红蛋白、牛血红蛋白或猪血红蛋白。

上述任一制备方法中，所述抗氧化剂与血红蛋白的摩尔比为1～15：1；所述抗氧化剂选自抗坏血酸、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸中的一种或几种。

上述任一制备方法中，其中所述磷酸吡哆醛与血红蛋白摩尔比为1～8：1。

上述任一制备方法中，步骤a所述分离纯化方法为透析或超滤，至透析液或超滤液在400-600nm无明显吸收峰为止。

上述任一制备方法中，步骤a～步骤d均在0～4οC低温条件下操作；所述血红蛋白为聚合血红蛋白。

上述任一制备方法中，所述血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体可以溶液或冻干粉形式保存。

本发明血红蛋白类携氧载体中，血红蛋白可与结合珠蛋白形成稳定的复合物，无高血压反应，且结合珠蛋白/血红蛋白复合物经网状内皮系统清除，可大大减轻经肾脏排泄可能造成的肾损伤，克服HBOCs类制品长期存在的缺陷。具有极良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明所涉血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的结构示意图，中间为结合珠蛋白；两侧为血红蛋白二聚体；

图2为本发明所涉血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的结构示意图，中间为结合珠蛋白；两侧为聚合血红蛋白。

具体实施方式

主要仪器及试剂：

血气分析仪：ABL800FLEX，雷度米特公司（Radiometer）；BC-3000PLUS，迈瑞公司，中国；

HEMOXTM分析仪：TCS Scientific公司，USA；

pH电极：梅特勒-托利多公司（Mettler Toledo），USA；

无创血压检测系统：BP-2000，Visitech Systems公司，USA；

磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）均购于成都科龙化学试剂公司。

实施例1本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的制备

1、制备方法

取0.1μmol纯化人脐带血血红蛋白（中国医学科学院输血研究所提供），溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，通入纯氧饱和5分钟，搅拌下加入结合珠蛋白0.1μmol（结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比约为1:1），然后，0～4℃避光搅拌反应30分钟，反应液用截留分子量100kD的透析袋透析，直至透析袋外的透析液在400-600nm区域无吸收为止。透析完成后，搅拌下加入1μmol抗坏血酸，0～4℃避光搅拌反应5分钟，0.1M碳酸氢盐溶液调节pH值至7.4，冷冻干燥，即得本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体。

2、理化性质检测

血红蛋白的浓度通过Radiometer公司的ABL800FLEX血气分析仪和迈瑞公司的BC-3000PLUS分析仪测定，测定前，将终产物冻干粉复溶于2ml生理盐水中；P50值由TCS Scientific公司的HEMOXTM分析仪测定；高铁血红蛋白含量由商用试剂盒测定（南京建成生物工程研究所）；pH值由Mettler Toledo公司的pH电极测定。

3、检测结果

本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体，血红蛋白浓度为0.26gHb/dL，血红蛋白回收率约为76.47％，氧亲和力P50值5mmHg，高铁血红蛋白含量1.6％，pH值7.4。

实施例2本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的制备

1、制备方法

取0.2μmol纯化人脐带血血红蛋白（中国医学科学院输血研究所提供），溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，通入混合气体（95％氧气＋5％二氧化碳）饱和5分钟，搅拌下加入结合珠蛋白0.1μmol（结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比约为1：2），然后，0～4℃避光搅拌反应5分钟，反应液用截留分子量100kD的透析袋透析，直至透析袋外的透析液在400-600nm区域无吸收为止。透析完成后，搅拌下加入超氧化物岐化酶和谷胱甘肽各0.5μmol，并加入磷酸吡哆醛1.2μmol（磷酸吡哆醛：血红蛋白摩尔比约为6：1），0～4℃避光搅拌反应10分钟，0.1M碳酸氢盐溶液调节pH值至7.4，冷冻干燥，即得本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体。

2、理化性质检测

检测方法同实施例1

3、检测结果

本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体，血红蛋白浓度为0.31gHb/L，血红蛋白回收率约为45.59％，氧亲和力P50值16mmHg，高铁血红蛋白含量2.1％，pH值7.4。

实施例3本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的制备

1、制备方法

取0.5μmol聚合人脐带血血红蛋白（中国医学科学院输血研究所提供），溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，通入混合气体（95％氧气＋5％二氧化碳）饱和10分钟，搅拌下加入结合珠蛋白0.1μmol（结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比约为1：5），然后，0～4℃避光搅拌反应15分钟，反应液用截留分子量100kD的透析袋透析，直至透析袋外的透析液在400-600nm区域无吸收为止。透析完成后，搅拌下加入超氧化物岐化酶和谷胱甘肽各2.5μmol，并加入磷酸吡哆醛2μmol（磷酸吡哆醛：血红蛋白摩尔比约为4：1），0～4℃避光搅拌反应10分钟，0.1M碳酸氢盐溶液调节pH值至7.4，冷冻干燥，即得本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体。

2、理化性质检测

检测方法同实施例1。

检测结果：本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体，血红蛋白浓度约为1.37gHb/L，血红蛋白回收率约为80.58％，氧亲和力P50值18mmHg，高铁血红蛋白含量2.4％，HPLC测定平均分子量为226KD，pH值7.4。

实施例4本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的制备

1、制备方法

取1μmol聚合人脐带血血红蛋白（中国医学科学院输血研究所提供），溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，通入混合气体（95％氧气＋5％二氧化碳）饱和10分钟，搅拌下加入结合珠蛋白0.1μmol（结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比约为1：10），然后，0～4℃避光搅拌反应30分钟，反应液用截留分子量100kD的透析袋透析，直至透析袋外的透析液在400-600nm区域无吸收为止。透析完成后，搅拌下加入超氧化物岐化酶和谷胱甘肽各0.5μmol，并加入磷酸吡哆醛8μmol（磷酸吡哆醛：血红蛋白摩尔比约为8：1），0～4℃避光搅拌反应10分钟，0.1M碳酸氢盐溶液调节pH值至7.4，冷冻干燥，即得本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体。

2、理化性质检测

检测方法同实施例1。

检测结果：本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体，血红蛋白浓度约为2.45gHb/L，血红蛋白回收率约为72.06％，氧亲和力P50值15mmHg，高铁血红蛋白含量3.3％，pH值7.4。

实施例5本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的制备

1、制备方法

取新鲜猪血，参照专利200510122291.2制备得到纯化血红蛋白。取0.5μmol纯化猪血血红蛋白，溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，通入纯氧饱和5分钟，搅拌下加入结合珠蛋白0.1μmol（结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比约为1:5），然后，0～4℃避光搅拌反应10分钟，反应液用截留分子量100kD的透析袋透析，直至透析袋外的透析液在400-600nm区域无吸收为止。透析完成后，搅拌下加入N-乙酰半胱氨酸1.5μmol，并加入磷酸吡哆醛2μmol（磷酸吡哆醛：血红蛋白摩尔比约为4：1），0～4℃避光搅拌反应10分钟，0.1M碳酸氢盐溶液调节pH值至7.4，即得本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体。

2、理化性质检测

检测方法同实施例1。

检测结果：本发明血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体，血红蛋白浓度约为0.35gHb/dL，血红蛋白回收率约为41.18％，氧亲和力P50值16mmHg，高铁血红蛋白含量2.9％，HPLC测定平均分子量为136KD，pH值7.4。

实施例6HPLC法测定本发明携氧载体的分子量分布

1、所用条件：流动相为磷酸盐缓冲液（pH7.4），流速为0.5ml/min，上样体积为20μl，时间为60min，检测280nm的吸收峰。

2、绘制分子量分部标准曲线：在上述条件下，上样蛋白分子量Marker（分子量分别为669KD，443KD，200KD，150KD，66KD，29KD），然后，以封顶的时间对分子量大小做标准曲线。

3、将原料血红蛋白和制得的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体以超纯水稀释至0.01gHb/dl，经0.22μm的膜过滤，上样，测定HPLC图谱。平均分子量的计算按照如下公式：平均分子量=∑分子量大小×该分子量血红蛋白在图谱中所占峰面积比例。结果如表1所示：

表1.本发明实施例一～五得到的终产物平均分子量情况

通过HPLC方法测定的平均分子量结果显示，与结合珠蛋白反应后，产物的平均分子量均有明显增加，增量与结合珠蛋白的分子量（约85KD）基本一致，因此，我们推断终产物为链接了结合珠蛋白，即本发明所述基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的新型携氧载体。

实施例7本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体的血管活性检测

1、按照实施例1和实施例3分别制备得到样品1和样品2。多次试验累积产物冻干粉，并分别用生理盐水将样品冻干粉复溶到终浓度8gHb/dL，待用。

2、血管活性检测：雄性昆明小鼠6只，22-25g，随机分为样品1组和样品2组，每组3只。清醒动物称重后，置于BP-2000无创血压检测系统，尾部测压，测定得到基础血压，然后按照分组分别从尾静脉推注16％血容量（理论最大耐受量，约0.3ml/25g小鼠）的两种样品，检测推注后即刻和10分钟后的血压的变化情况。结果以均数±标准差表示（n＝3），如表2。

表2.输注本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体后血压的变化情况

检测结果如表2所示：推注本发明所示血红蛋白类携氧载体后，均未发现动物血压的明显变化，与基础状态基本一致，表明本发明的基于血红蛋白-结合珠蛋白的携氧载体无明显血管副作用，无高血压反应。

实施例8本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体对离体心脏的作用

1、按照实施例1和实施例3分别制备得到样品1和样品2。临用前，分别用经典心脏停跳保护液St.Thomas液（STS）将样品冻干粉复溶到终浓度0.1gHb/dL，并用混合气（95％氧气＋5％二氧化碳）充气饱和10分钟。

2、离体心脏模型建立及实验分组：成年雄性SD大鼠8只，体重250～350克，随机分为3组：对照组（2只）、样品1组（3只）和样品2组（3只）。动物以戊巴比妥钠40～50mg/kg麻醉并肝素化以后，迅速摘取心脏，置于4°CK-H心脏灌注液中，然后迅速挂于已预先氧饱和及排气的Langendorff离体灌注装置（ADInstruments Pty,BellaVista,NSW,AUS），以37°CK-H液灌注，灌注压力100cmH2O。心脏平衡30分钟后，分别推注单纯STS液，含0.1gHb/dL浓度样品1或样品2的STS液，实施停跳。37°C停跳40分钟，以基础状态时的灌注参数复灌2小时。PowerLab生理监测系统（ADInstruments Pty,BellaVista,NSW,AUS）记录各组心脏左室在基础状态和复灌过程中的左室发展压（LVDP），并收集冠脉流出液测定心肌酶肌钙蛋白的释放情况。结果如表3和表4所示：

表3.本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体对离体心脏左室发展压的作用

注：数据以均数±标准差表示（n＝2～3），组间比较采用t检验；**，与对照组比较p<0.01。

表4.本发明基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物携氧载体对离体心脏肌钙蛋白释放的作用

注：数据以均数±标准差表示（n＝2～3），组间比较采用t检验；**，与对照组比较p<0.01。检测结果显示，通过实施例一和实施例三制备的样品1和样品2，均可以有效提高SD大鼠离体心脏的左室发展压，和抑制心肌酶肌钙蛋白的过量释放，与对照组区别显著，因此可以推断本发明所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体可以减轻心脏缺血再灌注损伤，具有心脏保护作用。

Claims (10)

1.一种基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，其特征在于：包括结合珠蛋白、血红蛋白、抗氧化剂，血红蛋白通过与结合珠蛋白之间的特异性结合能力，形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物。

2.根据权利要求1所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述携氧载体中还包括磷酸吡哆醛。

3.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述结合珠蛋白来源为人或动物。

4.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述血红蛋白来源包括人脐带血、人外周血、牛血或猪血。

5.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述血红蛋白为纯化血红蛋白或聚合血红蛋白。

6.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述结合珠蛋白与血红蛋白的摩尔比为1：1～10；优选1：3～5。

7.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述抗氧化剂选自抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种；优选抗坏血酸、超氧化物岐化酶、谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸中的一种或多种。

8.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述抗氧化剂总量与血红蛋白摩尔比为1～15：1；优选10：1。

9.根据权利要求2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述磷酸吡哆醛与血红蛋白摩尔比为1～8：1；优选4：1。

10.根据权利要求1或2所述的基于血红蛋白-结合珠蛋白复合物的携氧载体，所述携氧载体的pH值为7.0～7.4。

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