CN112274461B

CN112274461B - 秦艽提取物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN112274461B
Application number: CN202011239187.2A
Authority: CN
Inventors: 马占林; 郑晓琼; 黄灿; 周戟; 罗慧
Original assignee: Yunnan Yinge Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yunnan Yinge Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: WO2022095489A1; CN112274461A

Abstract

本发明公开了一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：取秦艽，加入提取溶剂提取，所得提取液上样于大孔吸附树脂层析柱进行分离纯化，收集洗脱液，浓缩，干燥，得秦艽提取物；所述大孔吸附树脂由型号为HP20和AB‑8的两种树脂混合而成。本发明的优点是：能有效将秦艽中的龙胆苦苷和马钱苷酸提取出来，得到具有屏障修复、抗炎、舒缓和神经镇静的作用的秦艽提取物。

Description

秦艽提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于日用化妆品技术领域，具体涉及一种秦艽提取物及其制备方法与用途。

背景技术

人类对自我形象的关注及对美的追求使得化妆品的需求量日趋增加，且随着时代的进步和人类生活水平的提高，人们也越老越重视化妆品的有效性和安全性，“绿色天然”是是当前化妆品的关注焦点。安全有效的天然植物化妆品原料在化妆品市场中具有良好的竞争优势。

秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(GentianaL.)秦艽组(Sect.Cruciata Gaudin)植物的干燥根，始载于《神农本草经》，是世界上著名的多年生药用草本植物之一，也是一种常用的中药，又名大叶龙胆、大叶秦艽、西秦艽等。秦艽味辛、苦、平，归胃、肝、胆经。秦艽具有祛风湿，清湿热，止痹痛之功效，主治风湿痹痛，筋脉拘挛，骨节酸痛，日晡潮热，小儿疳积发热。

人们发现，秦艽中存在各种各样的环烯醚萜苷类、二氢黄酮类、三萜类、留醇类和无机元素等。它的主要活性化合物是环烯醚萜类。秦艽的生物学和药理作用包括治疗胃酸、利胆、抗肝毒性、抗炎、抗真菌和抗组胺的作用。环烯醚萜苷类包括龙胆苦苷、马钱苷酸和獐牙菜苦苷等。

目前市场上秦艽提取物的应用主要在医药技术领域上，CN109172633A一种秦艽提取物及其制备方法与应用，其中主要应用在制备保肝制剂；CN105998171A秦艽及其提取物在制备治疗和/或预防皮肤癣的药物的用途，发明了秦艽及其提取物可以抑制真菌，治疗真菌引起的皮肤癣，为临床提供了一种新的选择。研究日化上的应用，从多靶点来证明秦艽提取物具有抗炎舒缓镇痛的功效。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效从秦艽中提取得到含量较多的马钱苷酸和龙胆苦苷的秦艽提取物。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：

取秦艽，加入提取溶剂提取，所得提取液上样于大孔吸附树脂层析柱进行分离纯化，收集洗脱液，浓缩，干燥，得秦艽提取物；所述大孔吸附树脂由型号为HP20和AB-8的两种树脂混合而成。

参照2020版《中国药典》标准，以龙胆苦苷和马钱苷酸含量作为活性成分提取。现有报道采用的提取工艺主要都是以水和亲水性有机溶剂作为提取物溶剂，再经过单一树脂纯化，主要是关注单一龙胆苦苷活性成分。仅仅体现龙胆苦苷转移率较高，马钱苷酸转移率较低。基于这个不足，本发明用混合树脂来分离纯化。

作为优选，所述提取溶剂选自水或质量百分比浓度为50％～95％的乙醇溶液。

作为优选，所述提取溶剂选自质量百分比浓度为60％或75％的乙醇溶液。

《中国药典》2020版规定秦艽按干燥品计算，含龙胆苦苷和马钱苷酸的总量不得少于2.5％，实际测得秦艽药材龙胆苦苷和马钱苷酸含量是9.55％。判断：特征成分含量合格。为更好优选出提取溶剂，取秦艽原药材，分别加入水、质量百分比浓度为60％的乙醇溶液或质量百分比浓度为75％的乙醇溶液进行提取，根据《中国药典》(2020版)的规定对龙胆苦苷和马钱苷酸进行检测，结果详见表1。

表1不同提取溶剂对从秦艽原药材中提取龙胆苦苷和马钱苷酸的影响

	水提	60％乙醇	75％乙醇
				马钱苷酸/％	2.28％	2.09％	2.16％
龙胆苦苷/％	6.08％	7.09％	7.23％
				总和	8.36％	9.18％	9.39％

由表1可以得知，采用质量百分比浓度为75％的乙醇溶液对秦艽进行提取，龙胆苦苷和马钱苷酸的含量更高。

为优选出合适的大孔吸附树脂，在研发过程中，分别采用了树脂型号为AB-8、D101、HP20、D301和聚酰胺树脂进行分离纯化，结果详见表2。

表2不同型号的树脂对分离纯化龙胆苦苷和马钱苷酸的影响

用高效液相标定龙胆苦苷和马钱苷酸的含量，结果发现采用AB-8时，龙胆苦苷的提取率较高；采用HP20时，马钱苷酸的提取率较高。

为更好将龙胆苦苷和马钱苷酸更好分离纯化出来，用AB-8和HP20不同比例混合树脂，再用动态吸附筛选，结果详见表3。

表3不同比例AB-8和HP20混合对分离纯化龙胆苦苷和马钱苷酸的影响

作为优选，所述HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1～3：1～3，能很好地将龙胆苦苷和马钱苷酸分离纯化出来。特别优选的，所述HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1:3时，效果最优，且混合树脂纯化后龙胆苦苷和马钱苷酸的含量比单一树脂AB-8增加了15.72％，取得了显著的进步。

作为优选，所述干燥采用冷冻干燥的方式来进行。

本发明还提供了一种利用所述制备方法得到的秦艽提取物。

本发明还提供了一种所述制备方法得到的秦艽提取物在制备修复皮肤屏障、抗炎或舒敏化妆品中的应用，其所在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。

本发明还提供了一种所述制备方法得到的秦艽提取物在制备神经镇静化妆品中的应用，其所在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。

本发明还提供了一种所述制备方法得到的秦艽提取物在制备神抗敏镇痛化妆品中的应用，其所在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。

本发明具有以下技术优势：

(1)本发明方法以水或乙醇为提取溶剂，溶剂安全无毒。

(2)本发明提取方法是加热回流提取法，该方法简便、设备要求低、成本低廉，适合工业化生产

(3)混合大孔树脂纯化结合冷冻干燥技术，龙胆苦苷和马钱苷酸的转移率比单一树脂提高了15.72％，且工艺简便、易操作，更加适合工业化生产。最后干燥后含麦芽糊精辅料的龙胆苦苷和马钱苷酸含量大于30％(HPLC)

(4)秦艽提取物在日化中具有屏障修复、抗炎、舒缓和神经镇静的应用。

附图说明

图1为秦艽提取物工艺流程图；

图2为Episkin皮肤刺激测试细胞活力；

图3为眼刺激测试；

图4为秦艽提取物对IL-6的抑制；

图5为秦艽提取物对TNF-α的抑制；

图6为肥大细胞脱颗粒形态学结果；

图7为组织活力检测结果图；

图8为模型组织形态变化情况；

图9为模型中FLG蛋白含量的变化情况；

图10为FLG相对IOD值柱形图；

图11为荧光强度变化柱状图；

图12为TRPV1相对表达量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：

取秦艽，加入质量百分比浓度为75％的乙醇溶液加热回流1小时，将提取液过滤，浓缩，上样于型号为HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1:3的混合大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，水洗脱量2.5BV，再用质量百分比浓度为75％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇洗脱量为2.5BV，收集解析液，浓缩，冷冻干燥，得秦艽提取物。经含量检测，龙胆苦苷的提取率为94.6％和马钱苷酸的提取率为36.9％。

实施例2

一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：

取秦艽，加入质量百分比浓度为75％的乙醇溶液加热回流1小时，将提取液过滤，浓缩，上样于型号为HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1:1的混合大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，水洗脱量2.5BV，再用质量百分比浓度为75％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇洗脱量为2.5BV，收集解析液，浓缩，冷冻干燥，得秦艽提取物。经含量检测，龙胆苦苷的提取率为96.65％和马钱苷酸的提取率为29.47％。

实施例3

一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：

取秦艽，加入质量百分比浓度为75％的乙醇溶液加热回流1小时，将提取液过滤，浓缩，上样于型号为HP20树脂与AB-8树脂的质量比为3:1的混合大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，水洗脱量2.5BV，再用质量百分比浓度为75％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇洗脱量为2.5BV，收集解析液，浓缩，冷冻干燥，得秦艽提取物。经含量检测，龙胆苦苷的提取率为87.27％和马钱苷酸的提取率为26.88％。

实施例4

一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：

取秦艽，加入质量百分比浓度为60％的乙醇溶液加热回流2小时，将提取液过滤，浓缩，上样于型号为HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1:1的混合大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，水洗脱量2.5BV，再用质量百分比浓度为75％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇洗脱量为2.5BV，收集解析液，浓缩，冷冻干燥，得秦艽提取物。

实施例5

一种秦艽提取物的制备方法，包括以下步骤：

取秦艽，加入水煎煮2小时，将提取液过滤，浓缩，上样于型号为HP20树脂与AB-8树脂的质量比为3:1的混合大孔吸附树脂层析柱，先用水洗脱，水洗脱量2.5BV，再用质量百分比浓度为75％的乙醇溶液进行洗脱，乙醇洗脱量为2.5BV，收集解析液，浓缩，冷冻干燥，得秦艽提取物。

上述实施例中所采用的秦艽原药材，按照《中国药典》2020版要求进行测定。取秦艽粉末(过三号筛)约0.2527g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足至22.32g，摇匀，滤过，取续滤液，即得，高效液相标定龙胆苦苷和马钱苷酸的含量。实际测得秦艽药材龙胆苦苷和马钱苷酸含量是9.55％。

为验证本发明所得秦艽提取物的安全有效，特选取实施例1所得秦艽提取进行研究。

1安全性测试

1.1皮肤刺激性测试：Episkin 3D皮肤模型测试(OECD TG439，判别依据：细胞活力大于50％即为非刺激性物质)。结果见表4。

表4不同样品OECD TG439测试

产品名称/编号	处理方式	皮肤模型	细胞活性	结果判定
					DPBS(NgC)	10ul/15min	EpiSkin<sup>TM</sup>	100％	非刺激性物质
5％SDS(PC)	10ul/15min	EpiSkin<sup>TM</sup>	16.4％	刺激性物质
					秦艽提取物(2％浓度)	10ul/15min	EpiSkin<sup>TM</sup>	103.9％	非刺激性物质

根据OECD TG439测试结果：秦艽提取物为非刺激性物质，见图2。

1.2眼刺激性：

1.2.1.实验步骤：

1.2.1.1 CAM制备：

第0天：购买受精鸡胚，运输至实验室。照蛋检查鸡胚质量，弃去未受精、无活性或有缺陷的鸡胚。用70％酒精清洁表面，置于培养箱37.5±0.5℃孵化。

第3天：将鸡胚水平放置，继续孵育。

第4天：从孵箱中取出鸡胚，灯照检查胚胎位置。在鸡胚小端开一个小孔，用注射器小心抽取约2.5～3.0mL蛋清，用火棉胶封闭小孔。胚胎上方开一矩形窗口，然后用透明薄膜密封缺口。继续孵育并每天检査，弃去任何异常鸡胚。

第14天：从孵箱中取出鸡胚，去掉薄膜，放置Teflon环，作为样品的作用区域。

1.2.1.2筛查实验

每一浓度使用3只鸡胚，取被测样品40uL加入环内。鸡胚置于孵箱环境中30±5min。孵育后，将鸡胚从孵箱中取出，观察并比较环内与环外CAM血管的变化，评估环内血管损伤。

1.2.1.3正式实验

每一浓度使用10只鸡胚，操作过程同1.2.1.2

1.2.2观察与分析

毒性效应包括出血、毛细血管充血和鬼影血管，根据表5进行严重程度的区分。

表5严重程度区分表

若观察到任何的血管变化，则可认定血管反应为阳性。记录全部的阳性或阴性效应，用概率分析计算RC50,即导致50％的鸡胚显示阳性反应的被测物的浓度。根据表6判定如下：

表6

RC50	潜在眼刺激性预测
		>3.0％	无刺激性
>1.0％,<3.0％	无法预测
		<1.0％	刺激性

1.2.2实验结果：

筛查实验的结果见表7和正式实验的结果见表8。计算得RC50＝19.81％,95％CI：12.59％-34.61％。

表7筛选实验

表8正式实验

测试结果：RC50＝19.81％，95％CI：12.59％-34.61％。根据CAMVA实验的判定标准，秦艽提取物无眼刺激性，见图3。

2屏障修复、抗炎及舒敏功效测试：

2.1巨噬细胞炎症因子测试：

2.1.1试剂配制

2.1.1.1.LPS：将LPS用PBS配制成200ug/ml浓度，并按照100ul/管分装于1.5ml离心管中，-20℃储存备用；

2.1.1.2阳性对照样品：

1)地塞米松磷酸钠：精密称取适量地塞米松磷酸钠对照品，用PBS配制成浓度为1mg/ml浓度，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃储存备用。临用前取出，用PBS稀释成0.5mg/ml浓度。

2)泊马度胺：称取2.37mg泊马度胺对照品，加8.6737mlDMSO配制成浓度为1mM的溶液，0.22um滤膜过滤除菌，50ul管分装于200ml离心管中，-20℃保存。临用前取出用PBS稀释为浓度为2000nM的对照品溶液。

2.1.1.3.秦艽提取物：精密称取秦艽提取物适量，用PBS配制成1.7mg/ml溶液，0.22um滤膜过滤除菌，然后进行梯度稀释，配制成0.85，0.425，0.2125，0.10625mg/ml浓度，待用。

2.1.2实验过程

细胞铺板，24h后进行样品处理+LPS刺激，再24h后MTT测定细胞活力，然后进行IL-6、TNF-α测定。

2.1.3 MTT法测定药物对LPS刺激的巨噬细胞活力的影响

2.1.3.1将细胞密度调整为1x105 cell/ml，按照每孔200ul(1x104cell/孔)接种于96孔板中，板周围一圈加基础培养基防止边缘效应，另设调零组(不含细胞的200ul基础培养基)放回培养箱(37℃，5％CO2)培养；

2.1.3.2加药处理，见表9。

表9

分组	预处理	后处理(1h后)
			正常对照组(BC)	细胞+基础培养基179ul+PBS 21ul	/
调零组	基础培养基179ul+PBS 21ul	/
			阳性对照组(PC)	细胞细胞+基础培养基179ul+泊马度胺20ul	LPS 1ul
LPS刺激组(NC)	细胞+基础培养基179ul+PBS20ul	LPS 1ul
			实验组(滇龙胆、秦艽)	细胞+基础培养基179ul+各浓度待测样品20ul	LPS 1ul

24h后取出96孔板，弃除旧的培养基，按照上述表格处理方式进行加样处理，每组每个浓度3个复孔，然后放回培养箱(37℃，5％CO2)继续培养；24h后取出96孔板，收集各处理组细胞上清液，1000rpm，5min离心，收集上清-20℃保存，使用前取出融化使用，避免反复冻融。

2.1.3.3 MTT法测试细胞活力

取出细胞上清液后，每孔重新加入200ul基础培养基和20ul MTT(5mg/ml)，放回培养箱继续培养4h，然后弃除孔内液体，加入150ul DMSO，振摇10min后于560nm波长处测定吸光度。

2.1.4 ELISA法测定TNF-α、IL-6浓度

2.1.4.1试剂配制

1)洗涤液配制：提前拿出浓缩洗涤液在室温平衡20-30min，将浓缩洗涤液进行20倍稀释(30ml+570ml超纯水或去离子水)，如有晶体，可置于37℃水浴锅中加热至晶体全部溶解；

2)标准品溶液：提前拿出样品稀释液在室温平衡20-30min，取出标准品，加入2ml样本稀释液，以此作为标准曲线的起始浓度并进行梯度稀释，稀释倍数为2倍(500ul+500ul)；溶解后的冻干品需在30min内用完；

3)检测抗体溶液(1x)：取出检测抗体浓缩液，用抗体稀释液进行100倍稀释，100ul/孔，可多配制100-200ul；按需配置，现配现用。

4)HRP标记抗体/HRP标记链霉亲和素(1x)：用抗体稀释液进行100倍稀释，100ul/孔，可多配制100-200ul；按需配置，现配现用

2.1.4.2操作流程

1)根据实验用量，取出所需数量的酶标条板

2)待测样品处理：

根据TNF-α测定预实验结果，各实验组处理后TNF-α的浓度超标曲，故将样品用样品稀释液稀释20倍后进行测定；IL-6测定样品不需稀释。

3)加样，见表10：

表10

分组	试剂	加量	复孔(个)
				零孔	样品稀释液	100ul	2
标准孔	各浓度标准品溶液	100ul	2
				待测样品孔内	待测样品溶液	100ul	2

按照上述表格所示进行加样，每个样品每个浓度2个复孔；加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，注意不要有气泡；酶标板盖上覆膜及盖子(避光)，37℃孵育2h。

4)洗板：揭开封板条，弃液体，在滤纸上磕出板内残留液体；用洗涤液洗板4次，每孔300ul，最后一次洗涤后，在滤纸上磕出板内残留液体；

5)每孔加100ul 1x检测抗体溶液，盖上封板膜及盖子，37℃孵育1h；

6)洗板：重复步骤3)

7)每孔加100ul HRP标记抗体/HRP标记链霉亲和素(1x)，盖上封板膜及盖子，37℃孵育40min；

8)洗板：重复步骤3)

9)显色：每孔加TMB显色液100ul，37℃避光显色15-20min(如果颜色偏浅，可适当延长显色时间，不超过30min)

10)终止：每孔加终止液100ul，此时蓝色变成黄色。注意终止液加入顺序应与TMB显色液加入顺序一致。

11)读数：酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光度。终止液加入后5min内完成读数。每个标准品和样本的OD值减去零孔的OD值。

2.1.5实验结果

2.1.5.1 MTT测定细胞活力，见表11。

表11

如表11所示，各样品对LPS刺激的巨噬细胞活力无明显影响。

2.1.5.2 ELISA法测定秦艽提取物对TNF-α、IL-6的抑制作用

2.1.5.2.1 ELISA法测定秦艽提取物对IL-6的抑制作用，见表12。

表12

见图4，与阴性对照组(BC)相比，LPS刺激(NC组)后IL-6分泌量显著增加(###P＜0.001)，阳性对照组和实验组IL-6浓度明显低于NC组，阳性对照药泊马度胺200nM浓度下明显抑制IL-6的分泌(**P＜0.01，*P＜0.05)，不同浓度秦艽提取物可明显减轻/抑制IL-6的分泌，且IL-6的抑制作用随样品浓度增加而增大。

2.1.5.2.2 ELISA法测定秦艽提取物对TNF-α的抑制作用，见表13。

表13

见图5，与阴性对照组(BC)相比，LPS刺激(NC组)后TNF-α分泌量显著增加(###P＜0.001)，阳性对照组和实验组TNF-α浓度明显低于NC组，阳性对照药泊马度胺500nM浓度下明显抑制TNF-α的分泌(**P＜0.01，*P＜0.05)，不同浓度秦艽提取物可明显减轻/抑制TNF-α的分泌，且TNF-α的抑制作用随样品浓度增加而增大。

2.2肥大细胞脱颗粒检测

2.2.1细胞毒性检测

本次检测设置8个浓度梯度，每个浓度下设置3个重复孔。同时，实验设置溶剂对照孔、调零孔和阳性对照孔(PC，10％DMSO)。本实验采用MTT法检测细胞活力，筛选细胞的给药的安全浓度。具体操作步骤如下：

1)细胞接种：角质形成细胞按1E4个/孔、肥大细胞按2.6E4个/孔、成纤维细胞按0.8E4个/孔的接种密度分别接种细胞至96孔板，每种类型细胞单独使用一个96孔板，接种后的细胞放置培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中过夜孵育。

2)实验分组：实验设置溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。

3)配液：按测试浓度表14配制不同浓度的受试物工作液。

表14

4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL细胞培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％DMSO的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度受试物的培养液；调零孔无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中培养24h。

5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。

6)计算公式：细胞活力＝(给药孔OD-调零孔OD)/(对照孔OD-调零孔OD)×100％。

2.2.2基于角质形成细胞和成纤维细胞的形态学检测

1)细胞接种：按4E4个/孔的密度分别接种角质形成细胞和成纤维细胞至独立的24孔板中，接种后放置培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。

2)配液：根据4.1实验中MTT检测结果，选取细胞活力拐点(90％)附近浓度，进行形态学观察，确定检测样品的形态学观察浓度。

3)给药：待24孔板细胞铺板率达到40％～60％时，进行给药。样品组加入含相应浓度样品的细胞培养液，溶剂对照组加入细胞培养液，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育培养24h。

4)形态观察：孵育结束后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照(20×)。见图6。

2.2.3基于角质形成细胞毒性检测结果

对秦艽提取物由低到高设定8个给药浓度，在角质形成细胞上开展MTT检测实验，MTT检测结果见表15。

表15角质形成细胞毒性测试结果

根据MTT和形态学结果，认为秦艽提取物在0.125mg/mL的浓度范围内对角质形成细胞未表现出细胞毒性。

2.2.4基于肥大细胞毒性检测结果

对秦艽提取物由低到高设定8个给药浓度，在肥大细胞上开展MTT检测实验，MTT检测结果见表16。

表16秦艽提取物肥大细胞毒性测试结果

根据MTT结果，认为秦艽提取物在2.5mg/mL的浓度范围内对肥大细胞未表现出细胞毒性。

2.2.5基于成纤维细胞毒性检测结果

对秦艽提取物由低到高设定8个给药浓度，在成纤维细胞上开展MTT检测实验，MTT检测结果见表17。

表17秦艽提取物成纤维细胞毒性测试结果

根据MTT和形态学结果，认为秦艽提取物在0.5mg/mL的浓度范围内对成纤维细胞未表现出细胞毒性。

2.3基于肥大细胞的脱颗粒检测

1)细胞接种：按8E4个/孔的接种密度接种肥大细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。

2)配液：按实验设计配制不同浓度的受试物工作液，详见表18。

表18

3)给药：根据实验设计，待24孔板中细胞铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，每组设3个复孔，每孔加入含有900μL含有样品工作液的培养基。给药完成后将24孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中培养2h。

4)C48/80刺激：孵育2h后，根据实验分组，空白对照组加100μL正常培养基，其他组每孔均加入100μL 100μg/mL C48/80贮备液，刺激1h，刺激完成后，冰浴终止反应。

5)细胞形态观察：在倒置显微镜下，观察各组细胞脱颗粒情况，并拍照。拍照后采用IPP软件统计分析细胞的脱颗粒率，详见表19。

表19肥大细胞脱颗粒率

备注：用T-Test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

本测试通过C48/80刺激肥大细胞建立脱颗粒模型，秦艽提取物作用后，观察细胞脱颗粒形态及统计脱颗粒率，评价秦艽提取物的脱颗粒抑制及舒敏作用。结果明白，秦艽提取物在0.2mg/ml和0.05mg/ml可显著抑制肥大细胞脱颗粒现象。

2.4 SLS-EpiKutis皮肤屏障损伤模型

2.4.1实验设计

实验设计具体设置如表20。

表20

2.4.2试剂制备

1)0.4％SLS母液配置：称取0.012g SLS溶于3mL PBS溶液中，0.22μm过滤，配制成0.4％SLS母液，备用。

2)阴性对照组(NC)工作液配置：0.4％SLS母液用PBS稀释2倍(吸取200μL 4％SLS母液溶于200μL PBS中)，配制成400μL 0.2％SLS工作液，备用。

3)阳性对照组(WY14643)工作液配置：称取10mg WY14643粉末溶于1mL DMSO中，配制成30mM WY14643母液；将5μL的WY14643母液(30mM)加入到3mL模型培养液中，配制成3mL50μM的工作液，备用。

4)阳性对照组(地塞米松)工作液配置：用1mL DMSO溶解100mg地塞米松配制成浓度为100mg/mL母液；吸取2.5μL 100mg/mL地塞米松母液溶于247.5μL PBS中，配制成0.1％地塞米松溶液。将0.1％地塞米松和0.4％SLS等体积(各200μL)混合，配制成400μL 0.05％地塞米松+0.2％SLS工作液，备用。

5)秦艽提取物(10mg/mL)母液配置：称取0.03g秦艽提取物溶于3mL PBS溶液中，0.22μm过滤，配制成10mg/mL秦艽提取物，备用。

6)样品秦艽提取物(3mg/mL)工作液配置：吸取10mg/mL秦艽提取物母液1.2mL溶于0.8mL PBS溶液中，配制成6mg/mL秦艽提取物溶液；将6mg/mL秦艽提取物溶液和0.4％SLS等体积(各200μL)混合，配制成400μL 3mg/mL秦艽提取物+0.2％SLS工作液，备用。

7)样品秦艽提取物(5mg/mL)工作液配置：将10mg/mL秦艽提取物母液和0.4％SLS等体积(各200μL)混合，配制成400μL 5mg/mL英舒颜TM+0.2％SLS工作液，备用。

2.4.3给药

1)根据实验设计，将模型转移到6孔板中(提前添加0.9mL模型培养液)，在6孔板上标注测试组编号。

2)取配置好的样品工作液25μL均匀涂抹于模型表面。

3)给药结束后，置于CO2培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育24h。

4)模型清洗：用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的样品，用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体，用于后续检测。

2.4.4检测

1)组织活力检测：将用于检测组织活力的模型转移至24孔板中，每孔加入0.3mL1mg/mL的MTT工作液孵育3h±5min，结束后每孔加入2mL异丙醇进行浸提，最后用酶标仪在570nm下测取OD值，依据OD值计算各组相对组织活力。见图7。

2)炎症因子检测：孵育结束后，收集模型培养液于EP管中，置于-80℃冰箱保存。根据各炎症因子的ELISA检测试剂盒的操作说明书进行检测分析。

3)组织形态检测：将用于组织形态与免疫荧光检测的模型环切取下，用4％的多聚甲醛固定24h，固定结束后进行石蜡包埋、切片和H&E染色。显微镜下拍照观察，采集图片，见图8。

4)免疫荧光检测：石蜡切片置于70℃烤片机中，烤片4h。烤片结束后将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，无水乙醇中浸泡5min，95％乙醇中浸泡5min，75％乙醇中浸泡5min。PBS缓冲液清洗3次，每次5min。将石蜡切片放入0.01M柠檬酸钠抗原加1滴3％H2O2，室温下孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS缓冲溶液清洗3次，5min/次。滴加与二抗同源的血清37℃封闭60min，无需冲洗。吸弃血清后滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。滴加二抗工作液，室温孵育1h。PBS缓冲液清洗3次，5min/次。Hoechest染色5min。PB缓冲液清洗3次，5min/次。滴加1滴抗荧光淬灭封片剂封片，48h内采用荧光显微镜进行图片采集，图片放大倍数为400倍(目镜10×，物镜40×)。应用IPP软件，各组取3张图片，分别用IPP软件计算积分光密度值(IOD)，进行统计学分析。见图9。

2.5基于SLS-EpiKutis皮肤屏障损伤模型的相关指标检测结果

2.5.1组织活力检测结果

采用“SLS-EpiKutis”皮肤损伤模型，MTT测试结果如表所示。测试过程中，所有样品3个平行样中的个体组织活性SD值均＜18％，符合测试要求，见表21。

表21

备注：用T-Test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。

结果：与BC组相比，NC组组织活力极显著下降(P<0.01)，说明本次实验造模成功；

与NC组相比，PC-WY14643、PC-地塞米松组，组织活力显著提升(P<0.05)，说明本次实验体系有效。与NC组相比，秦艽提取物3mg/mL组组织活力显著提升(P<0.05)

2.5.2 IL-1αELISA检测结果

在SLS刺激条件下，样品秦艽提取物炎症因子IL-1α分泌抑制实验结果，见表22。

表22 IL-1α结果汇总表

备注：用T-Test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.0表示为*，P-value＜0.01表示为**。

炎症因子检测结果表明，与NC组相比，英舒颜TM在3mg/mL时，炎性因子IL-1α含量极显著下降(P<0.01)，说明在该浓度下样品可抑制因刺激引起的炎症反应加剧，并通过遏止IL-1α诱发炎性级联放大的过程，间接缓解对皮肤屏障的损伤

2.5.3组织形态结果显示，

与BC组相比，NC组模型角质层疏松增厚，活细胞层受损，表明本次建模成功；

与NC组相比，PC组在50μM的WY14643作用下，对SLS刺激引起的活细胞层受损以及角质层疏松增厚现象有显著改善，表明本次实验有效。

秦艽提取物在3mg/ml浓度作用时，对十二烷基磺酸钠(SLS)损伤模型的组织形态有一定改善作用

2.5.4屏障蛋白FLG表达检测结果见表23

表23 FLG相对IOD值汇总表

备注：用T-Test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；PC组、样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。见图10。

与BC组相比，NC组的FLG含量极显著下降(P<0.01)，说明本次实验造模成功；

与NC组相比，PC组在50μM的WY14643作用下，对SLS刺激引起的FLG含量下降有极显著提升作用(P<0.01)，说明本次实验有效。

与NC组相比，样品秦艽提取物3mg/mL组对SLS刺激引起的FLG含量下降有极显著提升作用(P<0.01)，表明秦艽提取物样品在3mg/mL浓度作用时具有屏障修复功效。

2.6辣椒素刺激角质形成细胞神经镇静功效测试

2.6.1细胞内钙离子浓度变化检测

1)细胞接种：按2E4个/孔的密度接种角质形成细胞至96孔板中，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。

2)配液：按实验设计(表24)配制含辣椒素及样品工作液。

表24实验设计

3)荧光指示剂装载：待96孔板中细胞铺板率达到80％时，吸弃培养液，用PBS洗涤细胞3次后，每孔加入100μL含1μmol/L Fluo4/AM的培养液，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育30min，吸弃上清液，每孔加入200μl PBS，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育20min。

4)给药：指示剂装载完成后，根据表3实验设计，进行分组给药，每组设3个复孔，每孔加液总量为100μL。BC组加入培养液，NC组加入含有30μM CAP的培养液，PC组和样品组分别加入含有30μM CAP的不同浓度相应样品工作液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中避光孵育30min。

5)检测：孵育结束后，吸弃上清液，用PBS洗涤细胞3次。避光条件下于荧光酶标仪上进行检测，激发波长为488nm，发射波长为520nm，记录荧光强度值。

6)检测结果统计分析：应用GraphPad Prism Program软件作图，样品组与对照组比较，采用T-test统计分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。见图11。

2.6.2细胞内钙离子浓度变化检测结果，见表25。

表25荧光强度变化结果

与BC组相比，NC组荧光强度显著上升，说明30μM的CAP可引起角质形成细胞中的钙内流现象发生，本次实验刺激条件有效；

与NC组相比，PC组荧光强度显著降低，说明本次实验体系有效；

与NC组相比，样品秦艽提取物0.1mg/mL组荧光强度显著降低，说明秦艽提取物能够有效抑制角质形成细胞中的钙内流现象。

基于角质形成细胞，在0.1mg/ml的浓度下，秦艽提取物具有一定的神经镇静功效。

2.7基于辣椒素刺激角质形成细胞抗敏镇痛功效

2.7.1试验方法

(1)细胞爬片接种：按适宜的接种密度(4.5E4/孔)接种细胞至含有爬片的24孔板，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。

(2)实验分组：实验设置空白对照组(BC)、阴性对照组(NC)、阳性对照组(PC)与2个样品组。0.3mg/mL秦艽提取物，0.1mg/mL秦艽提取物。

(3)配液：按信息表的给药浓度配制相应浓度的受试物工作液。样品名称：秦艽提取物，给药浓度分别为0.3mg/ml和0.10.3mg/ml。

(4)给药：待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。空白对照组每孔加入2mL的细胞培养液；阴性对照组加入含有15μM Capsaicin的细胞培养液；阳性对照组每孔加入2mL含有15μM Capsaicin以及15.6μg/mL反-4-叔丁基环己醇的细胞培养液；样品组每孔加入2mL含有相应浓度受试物的培养液；给药完成后将24孔板爬片放置在培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中培养24h。

(5)培养结束后，吸弃培养基上清，PBS清洗3次，5min/次；

(6)吸弃PBS，每孔滴加山羊血清200μL/孔，室温封闭60min；

(7)吸弃山羊血清封闭液，每孔滴加稀释后的一抗Anti-VR1抗体(200μL/孔)(山羊血清1:150稀释)，4℃孵育过夜；

(8)吸弃一抗，PBS清洗3次，5min/次，用吸水纸吸干爬片上的PBS残留液体，每孔滴加稀释后的荧光二抗Goat pAb to Rb IgG(Alexa

488)(200μL/孔)(PBS 1:500稀释)，室温避光孵育1h；

(9)吸弃二抗，PBS清洗3次，5min/次，用吸水纸吸干爬片上的PBS残留液体，每孔滴加Hochest33342(200μL/孔)(PBS 1:500稀释)，室温孵育5min；

(10)吸弃Hochest33342，PBS清洗3次，5min/次。用吸水纸吸干爬片上的PBS残留液体，针头挑出爬片，在载玻片上滴加一滴抗淬灭剂并将爬片反放与载玻片上，封片(用剪过的黄色枪头吸取抗淬灭剂)。

(11)荧光显微镜下拍照。

2.7.2实验结果见表26

表26 TRPV1相对表达量如表

本次检测结果显示：NC组接受15μM Capsaicin刺激，其细胞表面TRPV1表达量显著高于BC组，说明基于Keratinocytes的体外致敏模型模拟成功；PC组细胞在Capsaicin的基础上接受阳性标准品处理，其细胞表面TRPV1表达量显著下调。说明此次实验有效。见图12。

本次检测采用免疫荧光法对Keratinocytes表面TRPV1表达量进行检测，依据此评估秦艽提取物抗敏镇痛功效。本次验证对TRPV1免疫荧光强度进行量化分析，发现：与BC组相比，经辣椒素刺激后，TRP V1的表达显著上升(NC组)；0.1mg/mL和0.3mg/mL的英舒颜均能显著抑制TRP V1的表达。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种秦艽提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取秦艽，加入提取溶剂提取，所得提取液上样于大孔吸附树脂层析柱进行分离纯化，收集洗脱液，浓缩，干燥，得秦艽提取物；所述大孔吸附树脂由型号为HP20和AB-8的两种树脂混合而成；所述HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1～3：1～3。

2.根据权利要求1所述的一种秦艽提取物的制备方法，其特征在于，所述提取溶剂选自水或质量百分比浓度为50％～95％的乙醇溶液。

3.根据权利要求2所述的一种秦艽提取物的制备方法，其特征在于，所述提取溶剂选自质量百分比浓度为60％或75％的乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的一种秦艽提取物的制备方法，其特征在于，所述HP20树脂与AB-8树脂的质量比为1:3。

5.根据权利要求1所述的一种秦艽提取物的制备方法，其特征在于，所述干燥采用冷冻干燥的方式来进行。

6.一种利用权利要求1-5任一项所述制备方法得到的秦艽提取物。

7.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的秦艽提取物在制备修复皮肤屏障、抗炎或舒敏化妆品中的应用，其所在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。

8.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的秦艽提取物在制备神经镇静化妆品中的应用，其所在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。

9.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的秦艽提取物在制备抗敏镇痛化妆品中的应用，其所在所述化妆品中的用量为0.05～99wt％。