CN107998171A - 一种绞股蓝提取物及其制备工艺与检测方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物领域，涉及一种绞股蓝提取物及其制备工艺及其检测方法与用途。该绞股蓝提取物是采用超微粉碎、碱水提取以及大孔吸附树脂进行柱层析分离纯化等步骤制成的。该方法制备的绞股蓝提取物中活性成分含量高。本发明还提供了采用高效液相色谱仪对该绞股蓝提取物中活性成分进行含量测定的方法。本发明还提供了该绞股蓝提取物的制药用途。本发明的技术的得到了云南省德宏州科技型中小企业技术创新项目的支持，项目名称：绞股蓝总苷提取纯化工艺开发，编号：CX2017‑10。

Description

一种绞股蓝提取物及其制备工艺与检测方法与用途

技术领域：

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种绞股蓝提取物及其制备方法与检测方法。

技术背景：

绞股蓝(拉丁名：Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino)葫芦科绞股蓝属草质攀援植物；茎细弱，具分枝，具纵棱及槽，无毛或疏被短柔毛。日本称之甘蔓茶。绞股蓝喜阴湿温和的气候，多野生在林下、小溪边等荫蔽处，多年生攀援草本。在中国主要分布在湖南、湖北，云南、广西等省，号称“南方人参”，生长在南方的绞股蓝药用含量比较高，民间称其为神奇的“不老长寿药草”，1986年，国家科委在“星火计划”中，把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”之首位，2002年3月5日国家卫生部将其列入保健品名单。

曹远东、熊学敏在2013年10月15日申请名为一种高纯度兽药用绞股蓝总皂苷的制备方法的发明专利(公开号：CN103520256A)。主要提供技术方案：以药用的绞股蓝总皂苷药材为原料，采用连续逆流超声波提取、陶瓷膜微滤和大孔树脂吸附分离技术，结合传统溶剂回流提取原理，通过高效提取和分离，从而得到高纯度的目标产物——兽药用绞股蓝总皂苷，提高了产品纯度和得率，稳定了产品质量和高品质，降低了生产成本，达到了开发出高纯度兽药用绞股蓝总皂苷及其深加工产品的要求。它通过技术的不断提升，调整工艺流程和技术参数，解决了兽药用绞股蓝总皂苷量产过程中所遇到的提取、溶剂回收、富集、纯化等工序的协调性方面的难点问题。

陈志成在2005年11月7日申请名为一种绞股蓝总苷滴丸及其制备方法的发明专利(公开号：CN1785181A)。主要提供技术方案：是以绞股蓝总苷为有效成分，以聚乙二醇4000和十六醇为基质，将绞股蓝总苷分散在熔融的基质液中，滴制到液体石蜡中，冷凝形成的滴丸剂。上述有效成分及基质的配比为绞股蓝总苷：聚乙二醇4000：十六醇＝4：15：1。本发明具有方法简单、生产成本低、崩解快、生物利用度高的优点。

浙江中医大学在2013年10月16日申请名为一种用于预防和治疗高尿酸血症的药物即绞股蓝总皂苷的发明专利(公开号：CN104546987A)。主要提供技术方案：绞股蓝总皂苷能降低高尿酸血症的大鼠血清的UA水平，降低血清和肝的XOD活性，降低血清ADA的活性。绞股蓝总皂苷在制备预防和治疗高尿酸血症的药品或食品中应用：药品制备绞股蓝皂苷可以与药学上认可的辅料组成片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、口服液、散剂、硬胶囊剂等各种剂型。食品制备绞股蓝皂苷可以小剂量添加在各种允许添加量的保健食品中。本发明具有成分易于分离、质量可控、使用剂量小、作用显著等优点。

广州白云山和记黄铺中药有限公司在2016年12月9日申请名为一种绞股蓝总皂苷的提取分离过程中的快速检测方法的发明专利(公开号：CN106596426A)。主要提供技术方案：采用大孔树脂吸附、纯化绞股蓝总皂苷的生产中使用，所述方法包括采用分光光度法测定样品的吸光度，通过所述样品的吸光度的比较来确定上样过程上样终点和/或洗脱过程终点，对绞股蓝皂苷的分离纯化、过程控制具有重要的指导意义。

中央民族大学在2016年6月21日申请名为一种绞股蓝总皂苷片及其制备方法的发明专利(公开号：CN106036860A)。主要提供技术方案：经过绞股蓝总皂苷提取、主料与辅料的配置，软材制作，制粒干燥，压片过程制得。该绞股蓝总皂苷片由主料绞股蓝总皂苷6～9％与辅料环糊精40％～63％，木糖醇20～40％，柠檬酸7～15％，硬脂酸镁0.3～0.4％按重量比配比。该绞股蓝总皂苷片加工简单，附加值高，外观光洁，够味适中，营养丰富，可提高机体免疫力，降血糖，降血压等特点；本产品易于保存，携带方便，是一种休闲保健食品。

中国农业大学在2014年3月17日申请名为一种富含绞股蓝皂苷的绞股蓝提取物的制备方法的发明专利(公开号：CN103908486A)。主要提供技术方案：所述方法为取绞股蓝乙醇提取物，在微生物培养基中27～40℃条件下进行发酵1～7天，将发酵后的绞股蓝总提物用等体积正丁醇萃取1～6次，减压浓缩，干燥得到绞股蓝发酵再提取物；所述微生物为植物乳杆菌或酵母菌。

广西金秀香料香精有限责任公司在2016年10月27日申请名为一种绞股蓝苷的提取方法的发明专利(公开号：CN106727867A)。主要提供技术方案：取绞股兰收割，切碎，先用原料重量8～10倍的水对绞股蓝进行第一次煎煮提取，滤渣加重量是绞股蓝原料重量的5～6倍的水进行第二次提取，离心过滤，得合并两次离心过滤后的滤液，得滤液及滤渣，滤渣可以用作饲料或者香烟添加剂；滤液减压后得到的稠膏与硅胶搅拌均匀，加入到层析硅胶柱，用体积分数为50～80％的乙酸乙酯洗脱，浓缩成浸膏用乙醇溶解加入浮选塔，盐酸和氢氧化钠溶液调节pH，利用连续泡沫分离法提纯，收集溢出的泡沫，喷雾干燥得绞股兰苷提取物，通过此方法每一吨原料可提取绞股兰苷4～5kg，提取回收率大98％以上，纯度大于98％，优于传统工艺。

厦门华侨亚热带植物引种园在2014年4月15日申请名为绞股蓝皂苷XLVEd及其制备方法的发明专利(公开号：CN103923149A)。主要提供技术方案：所述绞股蓝皂苷XLVEd的名称为2-羟基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量800。所述绞股蓝皂苷XLVEd的制备方法：(1)制备绞股蓝总皂苷；(2)用酶法转化绞股蓝总皂苷；(3)制备绞股蓝皂苷XLVEd。利用酶法转化法制备绞股蓝皂苷XLVEd，以绞股蓝为原料，在我国分布广种植面积大，价廉易得，资源丰富，是生物药物和功能性食品开发应用的良好材料。酶法转化制备方法设备要求简单，工艺简单，容易控制和扩大规模，且制备的绞股蓝皂苷XLVEd纯度高，副产物少。

张名静在2013年11月21日申请名为一种绞股蓝总皂苷提取方法的发明专利(公开号：CN104644724A)。主要提供技术方案：将绞股蓝晒干除杂、粉碎，用60～80％的乙醇浸泡6～10小时，过滤，将滤渣继续用60％～80％的乙醇浸泡4～6小时后过滤，再重复浸泡一次，合并三次滤液。用离心萃取机进行高速离心萃取，萃取剂使用正丁醇，级数为20～40级，分离出油相，将油相进行浓缩、干燥即可。本发明方法集提取与纯化为一体，工业化生产连续性、自动化程度高。

湖南麓山天然植物制药有限公司在2012年4月10日申请名为一种绞股蓝总苷颗粒中绞股蓝总苷的制备方法的发明专利(公开号：CN102600228A)。主要提供技术方案：(1)将绞股蓝药材粉碎成粗粉，投入多功能提取罐中，加6～8倍量的水，再加入乳化剂混匀，然后回流提取2次，每次1小时，收集提取液；(2)将收集的提取液Ph值调整为7～8，过滤沉淀后，取滤液，通过大孔吸附树脂吸附、层析，用50～70％浓度的乙醇洗脱1～2次收集洗脱液，回收乙醇后减压浓缩，喷雾干燥得粉末提取物。使用本发明的方法提取绞股蓝，能增大了绞股蓝总苷的收率，使提取物收率提高30％以上；能减少制备绞股蓝总苷的提取时间和提取次数，能极大的缩短绞股蓝提取的生产周期，降低生产成本。

陕西嘉禾生物科技股份有限公司在2015年12月10日申请名为一种从绞股蓝中提取绞股蓝总皂苷的方法的发明专利(公开号：CN105456332A)。主要提供技术方案：首先，将原料绞股蓝粉碎，用碱水浸泡进行提取，过滤，得到滤液和滤渣；其次，将滤渣用有机溶剂进行提取，过滤，即得提取液；最后，将提取液浓缩，加入碱水振摇，将碱水层弃去，向有机层中加入水再振摇，水层弃去，然后将有机层浓缩烘干，即得绞股蓝皂苷产品。本发明操作便捷，快速省时，产品质量较高，绞股蓝皂苷含量大于98％，回收率大于87％。

另外，胡亚洁2016年7月18日在山东医科大学学报上发表了一篇名为绞股蓝总皂苷防治糖尿病肾病作用机制研究进展的论文(胡亚洁.绞股蓝总皂苷防治糖尿病肾病作用机制研究进展[J].山东中医药大学学报,2016,40(04):385-387)。主要提供技术方案：绞股蓝总皂苷是绞股蓝主要有效成分，具有改善糖尿病肾病病理表现的作用，但是具体作用机制尚不明确。通过文献研究，发现绞股蓝总皂苷防治糖尿病肾病的作用机制可能与影响相关足细胞裂孔隔膜(SD)蛋白分子、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和神经生长因子等细胞因子的表达有关。

李荣华、钟鸣2016年3月20日在中药材上发表了一篇名为绞股蓝总皂苷-γ-环糊精包合物的制备工艺研究的论文(李荣华,钟鸣.绞股蓝总皂苷-γ-环糊精包合物的制备工艺研究[J].中药材,2016,39(03):606-609.)。主要提供技术方案：研究绞股蓝总皂苷-γ-环糊精包合物的最佳制备工艺，以提高绞股蓝总皂苷的利用率。采用饱和水溶液法制备绞股蓝总皂苷-γ-环糊精包合物，通过正交试验，以得率和包封率为指标综合评价制备工艺，筛选最佳工艺条件。优选后的绞股蓝总皂苷-γ-环糊精包合物的最佳制备工艺为：绞股蓝总皂苷与γ-环糊精(γ-CD)的质量比为1：2，包合温度为40℃，包合时间为2.0h，γ-CD与水的用量比为1：30(g/mL)。通过该工艺制备的包合物胶囊中绞股蓝总皂苷在60min时累积溶出百分率达65.1％。绞股蓝总皂苷-γ-环糊精包合物的工艺稳定可靠，重现性良好，为工业化生产绞股蓝总皂苷包合物提供理论依据。

杨婧娟、何少贵、赵梦琦、张希2016年8月15日在食品工业科技上发表了一篇名为不同方法提取绞股蓝总皂苷的比较研究的论文(杨婧娟,何少贵,赵梦琦,张希.不同方法提取绞股蓝总皂苷的比较研究[J].食品工业科技,2016,37(16):269-272.)。主要提供技术方案：以常规乙醇回流法、酶法及微生物发酵法提取绞股蓝总皂苷，通过总皂苷含量、单体皂苷组分、抗氧化活性三方面对不同提取方法进行比较研究。结果显示，复合酶法提取所得绞股蓝总皂苷含量达7.69％，比常规回流法相对提高了31％，但对皂苷组分转化未见显著效果。微生物发酵提取破壁效果最佳，提取物中绞股蓝总皂苷含量达8.34％，比回流提取法所得含量相对提高了42.1％；经发酵处理后，绞股蓝总皂苷中活性更强的次级苷组分如绞股蓝皂苷V-AH(人参皂苷Rg₃)等含量增加，对DPPH·清除的IC₅₀值相比常规法由1.544mg·mL^-1降至0.562mg·mL^-1，对Fe³⁺还原力的V_C当量抗氧化能力AEAC值提高至(236.299±12.785)mgV_C/g固形物，显示出该方法的优越性。

辛伟、李山姗、王淼、王一男、赵春杰2016年3月20年在沈阳医科大学学报上发表一篇名为绞股蓝总苷片的指纹图谱及含量测定的论文(辛祎,李山姗,王淼,王一男,赵春杰.绞股蓝总苷片的指纹图谱及含量测定[J].沈阳药科大学学报,2016,33(03):208-214.)。主要提供技术方案：采用超高效液相色谱法建立中药制剂绞股蓝总苷片的指纹图谱，并同时测定其中人参皂苷Rb₁和绞股蓝皂苷XLIX的含量。采用KromatUniversilXBC₁₈色谱柱(150mm×2.1mm，3μm)，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速为0.2mL·min^-1，检测波长为203nm，柱温为30℃；建立绞股蓝总苷片指纹图谱，运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”对10批制剂进行相似度评价，并对其中2个色谱峰进行指认及含量测定。10批绞股蓝总苷片指纹图谱中标定了17个共有色谱峰，相似度值为0.983～0.995。人参皂苷Rb₁和绞股蓝皂苷XLIX质量浓度分别在4.2～42.0mg·L^-1和9.4～94.0mg·L^-1内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.5％和99.4％。用该方法所建立的皂苷类指纹图谱方法，结合有关成分的含量测定能更好地控制其质量，对提高绞股蓝总苷片的整体质量控制提供参考依据。

范东东、匡艳辉、董利华、叶潇、陈两锦、张东、马振山、王锦玉、朱晶晶、王智民、王德勤、李楚源2017年2月23日在中国中药杂志上发表一篇名为基于“伴随标志物”在线控制技术的绞股蓝总皂苷纯化工艺及成分鉴定研究的论文(范冬冬,匡艳辉,董利华,叶潇,陈两绵,张东,马振山,王锦玉,朱晶晶,王智民,王德勤,李楚源.基于“伴随标志物”在线控制技术的绞股蓝总皂苷纯化工艺及成分鉴定研究[J].中国中药杂志,2017,42(07):1331-1337.)。主要提供技术方案：基于“伴随标志物”紫外在线检测技术以绞股蓝总皂苷(GPS)为目标，优化绞股蓝中GPS的纯化工艺，采用UPLC-QTOF-MS技术对GPS进行定性。“伴随标志物”紫外在线检测研究表明，上样终点为流出液吸光度为原药液的1/2时，洗脱终点为洗脱流出液吸光度基本稳定。UPLC-QTOF-MS鉴定出GPS提取物中的16个皂苷，其中新皂苷3个。该研究优选出的纯化工艺简单、检测方便、易于在线测定、实时记录，能较好的运用到大生产或生产的自动化中。质谱定性鉴定结果表明，基于"伴随标志物"紫外在线检测技术能很好地保留药材中的主要药效成分，为过程控制和质量溯源提供了分析工具。

束波、刘志江、钱民章2016年12月8日在天然产物研究与开发上发表一篇名为绞股蓝总苷对高脂血症大鼠血管平滑肌细胞表型的影响的论文(束波,刘志江,钱民章.绞股蓝总苷对高脂血症大鼠血管平滑肌细胞表型的影响[J].天然产物研究与开发,2017,29(02):217-223.)。主要提供技术方案：研究绞股蓝总苷对高脂诱导的大鼠血管平滑肌细胞表型的影响及可能的分子机制。采用高脂饲料喂饲建立高脂大鼠模型，观察绞股蓝总苷对血脂各成分的影响，血管平滑肌细胞超微结构及血管表型标志物表达的影响。结果显示，绞股蓝总苷能降低大鼠血脂水平并抑制血管平滑肌细胞超微结构发生去分化表型改变；增加高脂大鼠动脉分化标志蛋白SM-actin的表达，降低细胞增殖蛋白PCNA的表达。说明绞股蓝总苷能有效抑制高脂诱导的大鼠平滑肌细胞去分化，机制可能与抑制MCPIP1的表达有关。

吴柳松、钱民章2017年1月12日在中国病理生理杂志上发表一篇名为绞股蓝总苷对PCSK9基因表达及辛伐他汀降血脂作用的影响的论文(吴柳松,钱民章.绞股蓝总苷对PCSK9基因表达及辛伐他汀降血脂作用的影响[J].中国病理生理杂志,2017,33(01):79-85.)。主要提供技术方案：探讨绞股蓝总苷对大鼠肝脏前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因表达及辛伐他汀的降血脂作用的影响。肝组织病理结果显示，高脂血症性大鼠出现脂肪肝病变；Simvastatin组、GPs组以及combined组大鼠肝细胞脂肪变性程度有不同程度减轻，尤以combined组效果显著。与model组比较，simvastatin组PCSK9和LDLR的mRNA表达均明显升高，GPs组以及combined组PCSK9的mRNA表达明显降低(P<0.05)，GPs组LDLR的mRNA表达变化不明显，combined组LDLR的mRNA表达明显升高(P<0.05)。与model组比较，Simvastatin组PCSK9和LDLR的蛋白表达均明显升高；GPs组和combined组的PCSK9蛋白表达明显降低，LDLR蛋白表达明显升高(P<0.05)。GPs能抑制肝脏PCSK9表达，增加LDLR表达量；与辛伐他汀联用可增强其降血脂和减轻肝脏脂肪病变的效果。

绞股蓝总苷胶囊是本专利的申请人云南梁河民族制药有限公司的主导品种，批准文号：国药准字Z53021674。绞股蓝总苷胶囊的功效为：养心健脾，益气活血，除痰化瘀，降血脂。适用于高血脂症，见有心悸气短，胸闷肢麻，眩晕头痛，健忘耳鸣，自汗乏力或脘腹胀满等心脾气虚，痰阻淤血者。

云南梁河民族制药有限公司始建于1970年，主要以生产特色中成药为主，包括心脑血管药物：绞股蓝总苷胶囊；呼吸系统药物系列：半夏糖浆、强力枇杷露、枸缘酸喷托维林糖浆等；补益类药物系列：仙茸壮阳口服液、人参五味子糖浆；以及珍稀药酒系列：回春酒、豹骨木瓜酒等数十个品种。其中绞股蓝总苷胶囊是云南梁河民族制药有限公司最为重要的主导品种，该产品已上市销售十余年，疗效确切，其销售额逐年上升，得到了广大医患的充分认可。

按照国家科技部、国家食品药品监督管理总局、国家中医药管理局关于中药大品种二次开发的指导意见，云南梁河民族制药有限公司对绞股蓝总苷胶囊进行了有关“二次开发”的一系列研究工作，形成了一系列的研究成果。研究发现，绞股蓝总苷胶囊对卵巢早衰具有一定的治疗效果，但是疗效并不是特别的理想，经过反复研究发现，改进绞股蓝总苷胶囊现有的制备方法，提高绞股蓝总苷中绞股蓝皂苷A和人参皂苷Rb1的含量，其治疗卵巢早衰的效果，明显提高。本发明的技术的得到了云南省德宏州科技型中小企业技术创新项目的支持，项目名称：绞股蓝总苷提取纯化工艺开发，编号：CX2017-10。

发明内容：

本发明的目的是提供一种绞股蓝提取物。

本发明的另一目的是提供该绞股蓝提取物的制备方法。

本发明的另一目的是提供该绞股蓝提取物含量测定方法。

本发明还提供了该绞股蓝提取物的硬胶囊剂药物剂型及其制备方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种绞股蓝提取物，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内25℃～35℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为700～900kPa，进料量为400～600g，分选频率为35～45Hz，粉碎时间为15～25min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入10～20倍量pH为9～11的氨水溶液，微波提取，微波功率400～600W，提取时间35～45min，提取温度55～65℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:8～12，上样体积10～14BV，水洗8～12BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱8～12BV除杂，再以乙酸乙酯：1％冰醋酸溶液＝80:15～25的洗脱剂10～14洗脱，流速为0.5～1.5BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

所述的绞股蓝提取物，优选采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

一种绞股蓝提取物的检测方法，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，以0.5～1.5％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：365～375nm；流速：1.0～2.0mL·min^-1；柱温：25～35℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以55％～65％甲醇制成每1mL含80～120μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以55％～65％甲醇制成每1mL含80～120μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末20～30mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入55％～65％甲醇70～90mL，超声处理25～35min，超声功率为250～350W，超声频率为55～65KHz，超声温度为40～50℃，放冷，加55％～65％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述的绞股蓝提取物的检测方法，采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，优选步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，规格：4.6mm×150mm，5μm；以1％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：368nm；流速：1.5mL·min^-1；柱温：30℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入60％甲醇80mL，超声处理30min，超声功率为300W，超声频率为60KHz，超声温度为45℃，放冷，加60％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述的绞股蓝提取物，采用药学中常规的制药方法制备成硬胶囊剂。

一种绞股蓝提取物在制备治疗卵巢早衰药物中的应用，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，规格：4.6mm×150mm，5μm；以1％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：368nm；流速：1.5mL·min^-1；柱温：30℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入60％甲醇80mL，超声处理30min，超声功率为300W，超声频率为60KHz，超声温度为45℃，放冷，加60％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

通过如下实验研究验证本发明的技术效果：

实验一：对延缓卵巢功能衰退的绞股蓝提取物的筛选实验研究

1材料与方法

1.1动物

昆明种小鼠，SPF级，雌性，12～13月龄，由广州中医药大学动物中心(三元里校区)提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2013-0034。

1.2药物及试剂

复方复方戊酸雌二醇片(商品名：逸维仙)，由浙江仙琚制药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H20020299。规格：每片含:戊酸雌二醇2mg，炔诺酮0.7mg；批号：20160213。

坤泰胶囊，由贵阳新天药业股份有限公司生产，批准文号：国药准字Z20000083，规格：每粒装0.5g，批号：20151203。

受试药物B：将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得到受试药物B。

受试药物A：绞股蓝500g，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到受试药物A。

受试药物C：(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得受试药物C。

受试药物D：绞股蓝500g，加入15倍量50％的乙醇溶液，加热回流提取，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到受试药物D。

ELISA试剂盒：由上海邦奕生物科技有限公司提供，批号：151023B。DNA末端原位标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒，由上海乔羽生物有限公司提供，批号：160111S。

试剂：水合氯醛，上海铭博生物科技有限公司，批号：20151126；甲醛，上海铭博生物科技有限公司，批号：20151123。

1.3仪器

BA410研究型显微镜，广州市汇滕科学仪器有限公司；TGL型台式冷冻离心机，北京时代北利离心机有限公司；530型酶标仪，宝予德(中国)有限公司；THZ-C型恒温震荡器，天津欧诺仪器股份有限公司；812型全自动酶标洗板机，南京泰昌生物科技有限公司；RM2235型轮转石蜡切片机，湖北博太电子科技有限公司DNP-9162型电热恒温培养箱，林茂科技有限公司；生物组织摊片机，上海文乐生物科技有限公司。

1.4分组、造模及给药

本次研究共选用80只小鼠作为实验样本，从中择优选择70只作为本次研究进行卵巢衰老建模的对象，月龄在14月龄至15月龄之间，符合年老小鼠的月龄标准。将70只年老小鼠随机分为7组，每组10只，即年老空白组，复方戊酸雌二醇片组，给药剂量为0.00035g·Kg^-1；坤泰胶囊组，给药剂量为2.0g·Kg^-1；受试药物B组，给药剂量为2.0g·Kg^-1；受试药物A组，给药剂量为2.0g·Kg^-1；受试药物C组，给药剂量为2.0g·Kg^-1；受试药物D组，给药剂量为2.0g·Kg^-1；另取15只小鼠所生的雌性仔鼠，饲养3个月，作为年轻对照组。各组均按25mL·Kg^-1灌胃给药，空白组和年轻对照组，不给任何药物，只给予同样剂量的水，每天给药1次，连续30天。

1.5检测血清E₂、LH、FSH、P含量

最后一次给药后，经过18h，眼球取血，静置30min后，离心20min，制成血清样本，采用ELISA法对血清进行检测，测定E₂、LH、FSH、P四项指标的含量。

1.6检测子宫内膜厚度与组织

采血完成后，将小鼠腹腔剖开，取双侧子宫，将子宫周围的脂肪组织剥离干净后对子宫进行称重，计算脏器指数。将子宫标本浸泡在浓度为15％的甲醛溶液中，然后固定，石蜡包埋，进行切片，对切片进行HE染色，检测子宫病理学切片。

1.7检测卵巢组织

取双侧完整卵巢，将卵巢周围的脂肪组织剥离干净后对卵巢进行准确的称重，并对脏器的指数进行准确计算。将卵巢标本浸泡在浓度为15％的甲醛溶液中，然后固定，石蜡包埋，进行切片。对切片进行HE染色，进行组织学检测，观察卵巢的各级生长卵泡数、黄体数。

1.8TUNEL法检测

石蜡切片，然后在水中进行脱蜡处理，加入缓冲液、封闭液、生物素标记的抗地高辛抗体，DAB显色，苏木素复染，应用数码医学图像分析系统对卵巢组织的颗粒细胞进行分析和检测。

1.9统计学处理方法

对实验所得得数据进行统计学处理，采用SPSS20.0统计学软件进行分析，以表示。

2结果

2.1对年老小鼠血清E₂、LH、FSH、P含量的影响

与年轻对照组比较，年老空白组血清中E₂、P的含量显著下降，FSH、LH的含量显著提高，差异均具有统计学意义(P<0.01)，说明模型造模成功。

经受试药物治疗后，受试药物C组小鼠血清E₂、P含量明显升高，FSH、LH含量降低，与年老空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。实验结果见表1、表2。

表1对年老小鼠血清E₂、P含量的影响

注：与年轻对照组比较，##P<0.01；与年老空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表2对年老小鼠血清FSH、LH含量的影响

注：与年轻对照组比较，##P<0.01；与年老空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2对年老小鼠子宫、卵巢系数与子宫内膜厚度的影响

与年轻对照组比较，年老空白组小鼠子宫、卵巢系数和子宫内膜厚度均明显减小，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，说明造模成功。经受试药物治疗后，受试药物C组小鼠子宫、卵巢系数和子宫内膜厚度明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。实验结果见表3。

表3对年老小鼠子宫、卵巢系数与子宫内膜厚度的影响

注：与年轻对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与年老空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3对年老小鼠卵巢各级卵泡数、黄体数的影响

与年轻对照组比较，年老空白组生长卵泡、成熟卵泡和黄体数均明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，提示年老小鼠模型造模成功。经受试药物治疗后，受试药物C组小鼠卵巢生长卵泡数、成熟卵泡数明显增多，与年老空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。实验结果见表4、附图1至附图8。

表4对年老小鼠卵巢各级卵泡数、黄体数的影响

注：与年轻对照组比较，##P<0.01；与年老空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4对年老小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

与年轻对照组比较，年老空白组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡数明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，说明造模成功。经受试药物治疗后，受试药物C组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡数明显降低，与年老空白组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5、附图9至附图16。

表5对年老小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

注：与年轻对照组比较，##P<0.01；与年老空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3结论

本研究结果显示，受试药物C能显著升高年老小鼠血清E₂含量，显著降低FSH、LH的含量，说明受试药物C能改善内分泌系统紊乱状态。本实验发现，受试药物C能增加年老小鼠的卵泡数，对黄体数有一定的升高作用，并且提升血清中P的含量，对年老小鼠卵巢颗粒的细胞凋亡具有显著的抑制作用，子宫组织结构有明显的改善作用，说明受试药物C能延缓卵巢衰老，改善生殖系统功能。

本研究结果显示，受试药物C能显著升高年老小鼠血清E₂含量，显著降低FSH、LH的含量，说明受试药物C能改善内分泌系统紊乱状态。本实验发现，受试药物C能增加年老小鼠的卵泡数，对黄体数有一定的升高作用，并且提升血清中P的含量。在经过受试药物的周期性治疗后，年老小鼠的卵巢功能以及子宫组织结构都得到了明显的改善，这表明受试药物对于延缓卵巢功能衰退，改善内分泌以及生殖系统功能作用良好。说明在本发明提供的特定的制备工艺下制备所得的绞股蓝提取物才具有延缓卵巢功能衰退的作用疗效。

实验二：HPLC测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量

经前期研究表明，绞股蓝提取物中含有的股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁是绞股蓝提取物具有延缓卵巢功能衰退作用疗效的主要活性成分，发明人经过反复实验，建立了通过高效液相色谱法一次性同时测定绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁含量的检测方法，研究如下。

1仪器及试剂

Agilent1100高效液相色谱仪，DAD检测器。绞股蓝皂苷A(批号：20160123B，含量≥99.0％)由成都标样生物科技有限公司生产。人参皂苷Rb₁(批号：20151220B，含量≥99.5％)，由成都标样生物科技有限公司生产。乙腈为色谱纯，三氟乙酸为化学纯，水为高纯水。

绞股蓝提取物：(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得绞股蓝提取物，在本发明中成为“本品”。

2色谱条件

色谱柱：C₁₈色谱柱，规格：4.6mm×150mm，5μm；以1％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：368nm。流速：1.5mL·min^-1；柱温：30℃。理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500。

3实验方法与结果

3.1对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液的制备

3.1.1对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液。

3.1.2供试品溶液的制备：取本品粉末25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入60％甲醇80mL，超声处理30min，超声功率为300W，超声频率为60KHz，超声温度为45℃，放冷，加60％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3.1.3测定法：分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。见图17至图19。

3.2方法学考察

3.2.1线性关系考察

对照品储备溶液制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品15.00mg，以60％甲醇制成每1mL含150μg的对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品15.00mg，以60％甲醇制成每1mL含150μg的对照品溶液。

精密移取绞股蓝皂苷A对照品储备溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，置10mL量瓶中，分别加60％甲醇至刻度，摇匀，制成不同浓度的一系列绞股蓝皂苷A对照品溶液，分别进样10μL，每个浓度进样两针。精密移取人参皂苷Rb₁对照品储备溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL置10mL量瓶中，分别加60％甲醇至刻度，摇匀，制成不同浓度的一系列人参皂苷Rb₁对照品溶液，分别进样10μL。

经回归分析，绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的回归方程如下：

绞股蓝皂苷A：Y＝953.263X－2.135，R＝0.9998，线性范围：0.302μg～1.359μg。

人参皂苷Rb₁：Y＝803.462X－2.452，r＝0.9998；线性范围：0.216～1.526μg。

3.2.2仪器精密度试验

分别吸取浓度为50.0μg·mL^-1的绞股蓝皂苷A对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪测定，连续6次，峰面积RSD值为0.61％。

分别吸取浓度为50.0μg·mL^-1的人参皂苷Rb₁对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪测定，连续6次，峰面积RSD值为1.21％。

3.2.3稳定性试验

按3.1项下制备供试品溶液，每隔4h精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，测定样品24h的稳定性。绞股蓝皂苷A的峰面积RSD为0.51％；人参皂苷Rb₁峰面积的RSD为0.96％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

3.2.4重复性试验

按3.1项下制备供试品溶液，平行处理6份，分别精密吸取10μL注入高效液相色谱仪测定，绞股蓝皂苷A的含量为25.36％，测定量RSD为0.95％；人参皂苷Rb₁的含量为55.46％，测定量RSD为1.20％。

3.2.5加样回收率试验

实验结果见表6、表7。

表6绞股蓝皂苷A回收率试验结果

表7人参皂苷Rb₁回收率试验结果

结果表明：该含量测定方法的加样回收率较好。

3.2.6样品测定

取另样品，按含量测定方法进行检测，结果见表8。

表8提取物中绞股蓝皂苷A的含量测定结果

4结论

本法结果准确，精密度，重现性均好，可作为含量测定的有效方法。

实验三：不同提取纯化方法制备绞股蓝提取物中股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁含量的比较研究

1不同提取纯化方法制备的绞股蓝提取物

1.1A方法制备绞股蓝提取物：将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得到受试药物B。

1.2B方法制备的绞股蓝提取物：绞股蓝500g，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到受试药物A。

1.3C方法制备的绞股蓝提取物：(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得受试药物C。

1.4D方法制备的绞股蓝提取物：绞股蓝500g，加入15倍量50％的乙醇溶液，加热回流提取，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到受试药物D。

2.测定

采用本发明实验二所提供的HPLC法测定绞股蓝提取物中股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量的方法进行测定。

3.测定结果

测定结果见表9。

表9不同提取方法提取得到的绞股蓝提取物中股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁含量

4.结论

实验结果可见，采用C方法制备的绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁含量最高，这可能也是本发明提供的绞股蓝提取物在延缓卵巢功能衰退方面作用明显优于其他绞股蓝提取物的主要原因。

实验四：延缓皮肤光老化的绞股蓝提取物的筛选实验研究

本发明提供的绞股蓝提取物在延缓卵巢功能衰退方面具有显著的疗效，按照中医药领域技术人员的常规推理，该绞股蓝提取物在延缓皮肤光老化方面也应该具有较好的作用，发明人对此进行了药物筛选实验研究。

1材料

1.1动物

昆明种小鼠，小鼠体重17～23g，雌雄均等，由广州中医药大学(三元里校区)实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2013-0034。

1.2药品、试剂

受试药物B：将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得到受试药物B。

受试药物A：绞股蓝500g，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到受试药物A。

受试药物C：(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得受试药物C。

受试药物D：绞股蓝500g，加入15倍量50％的乙醇溶液，加热回流提取，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到受试药物D。

SOD测定试剂盒，由福建福缘生物科技有限公司生产；MDA测定试剂盒，由福建福缘生物科技有限公司生产；羟脯氨酸测定试剂盒由上海江莱生物科技有限公司生产。

1.3仪器

100W紫外光灯，由深圳仁为光电有限公司制造；紫外线强度测定仪，由深圳市德胜兴科技有限公司制造；组织匀浆机，由无锡沃信仪器制造有限公司制造。

2方法

2.1分组与给药

实验小鼠，雌雄各半，随机分为6组，分别如下：

(1)空白对照组：不进行紫外线光照，灌胃等量蒸馏水；

(2)蒸馏水灌胃组：紫外线光照，灌胃等量蒸馏水；

(3)受试药物A组：灌胃受试药物A，给药剂量为2g·kg^-1。

(4)受试药物B组：灌胃受试药物B，给药剂量为2g·kg^-1。

(5)受试药物C组：灌胃受试药物C，给药剂量为2g·kg^-1。

(6)受试药物D组：灌胃受试药物D，给药剂量为2g·kg^-1。

所有小鼠均在给药30min后进行紫外线光照。

2.2造模

除了空白对照组外，受试药物A组、受试药物B组、受试药物C组、受试药物D组、蒸馏水灌胃组的小鼠以10％Na₂S溶液取背部中间皮肤脱毛，暴露1.5cm×1.5cm面积的裸露皮肤。

100W的紫外线灯光照，小鼠距离紫外灯大约50cm。第1天至第10天，每天紫外光照射1次，每次40min，第11天至第20天，每天照射2次，上午、下午各一次，每次照射20分钟。

2.3取材

第20天结束后，末次照射后，处死小鼠，取裸露皮肤约1cm²，检测羟脯氨酸；另取裸露皮肤1cm²，测定成纤维细胞数；取裸露皮肤0.1g，检测MDA和SOD。

2.4检测羟脯氨酸

称取裸露皮肤0.1g，在95℃的水解液中水解35min，离心机中离心15min，取上清液。采用羟脯氨酸测定试剂盒进行检测。

2.5检测MDA、SOD

称取裸露皮肤0.1g，用生理盐水漂洗，漂洗去除脂肪和结缔组织，干燥，称重，切碎，放入内切式匀浆管中，取10倍量裸露皮肤重量的生理盐水，倒入匀浆管中，制备组织匀浆，离心，l5min，取上清液。采用MDA试剂盒、SOD试剂盒进行检测。

2.6数据处理

实验数据用均数±标准差(x±s)体现，用软件SPSS10.0进行统计学检验。

3结果

3.1皮肤观察

空白对照组小鼠皮肤没有褶皱，皮肤光滑，富有弹性，质地均匀，纹理清晰。

蒸馏水灌胃组小鼠皮肤有深层褶皱，有明显红色斑点，皮肤粗糙，没有弹性，角质化、粗糙、有皮屑。

受试药物A组小鼠皮肤有较深皱纹，红色斑点减少，皮肤不平滑，有皮屑。

受试药物B组小鼠皮肤皱纹已不明显，没有明显红斑，纹理清楚，没有皮屑，已接近空白对照组小鼠皮肤。

受试药物C组小鼠皮肤有较深皱纹，红色斑点减少，皮肤不平滑，有皮屑。

受试药物D组小鼠皮肤有较深皱纹，红色斑点减少，皮肤不平滑，有皮屑。

3.2对皮肤中SOD与MDA的影响

与空白对照组比较，蒸馏水灌胃组皮肤SOD活性显著降低，具有统计学意义(P<0.01)，MDA水平显著升高，具有统计学意义(P<0.01)。受试药物B组与蒸馏水灌胃组比较，皮肤SOD活性明显升高，具有统计学意义(分别P<0.01)，MDA含量显著降低，具有统计学意义(P<0.01)；受试药物A组、受试药物C组、受试药物D组，与蒸馏水灌胃组相比，皮肤SOD活性略几乎没有升高，MDA含量几乎没有降低。实验结果见表10。

3.3对小鼠皮肤羟脯氨酸含量的影响

与空白对照组相比，蒸馏水灌胃组皮肤羟脯氨酸含量显著下降，具有统计学意义(P<0.01)。受试药物B组与蒸馏水灌胃组相比，皮肤羟脯氨酸含量明显升高(P<0.05)，具有统计学意义(P<0.01)；受试药物A组、受试药物C组、受试药物D组，与蒸馏水灌胃组相比，皮肤羟脯氨酸含量几乎没有升高，不具有统计学意义(P>0.05)。实验结果见表10。

表10对小鼠皮肤SOD、MDA、羟脯氨酸含量影响

注：与蒸馏水灌胃组比较*P＜0.05，**P＜0.01

4结论

受试药物B对延缓皮肤光老化具有明显的作用疗效，而受试药物C(本发明绞股蓝提取物)对延缓皮肤光老化基本无效。

附图说明：

图1为青年对照组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图2为老年空白组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图3为复方戊酸雌二醇片组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图4为坤泰胶囊组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图5为受试药物B组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图6为受试药物A组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图7为受试药物C组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图8为受试药物D组卵泡数、黄体数显微图(HE，200×)

图9为青年对照组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图10为老年空白组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图11为复方戊酸雌二醇片组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图12为坤泰胶囊组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图13为受试药物B组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图14为受试药物A组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图15为受试药物C组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图16为受试药物D组卵巢颗粒细胞凋亡显微图(HE，200×)

图17为绞股蓝皂苷A对照品HPLC图

图18为人参皂苷Rb₁对照品HPLC图

图19为绞股蓝提取物HPLC图

具体实施方式：

实施例1：绞股蓝提取物及其制备方法与检测方法

1、绞股蓝提取物及其制备

处方：绞股蓝500g。

制备方法：(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

2、绞股蓝提取物的含量测定

采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，规格：4.6mm×150mm，5μm；以1％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：368nm；流速：1.5mL·min^-1；柱温：30℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入60％甲醇80mL，超声处理30min，超声功率为300W，超声频率为60KHz，超声温度为45℃，放冷，加60％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

(5)结果：本品中股蓝皂苷A的含量为39.46μg·mg^-1、人参皂苷Rb₁的含量为41.28μg·mg^-1。

Claims (6)

1.一种绞股蓝提取物，其特征在于，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内25℃～35℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为700～900kPa，进料量为400～600g，分选频率为35～45Hz，粉碎时间为15～25min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入10～20倍量pH为9～11的氨水溶液，微波提取，微波功率400～600W，提取时间35～45min，提取温度55～65℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:8～12，上样体积10～14BV，水洗8～12BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱8～12BV除杂，再以乙酸乙酯：1％冰醋酸溶液＝80:15～25的洗脱剂10～14洗脱，流速为0.5～1.5BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

2.如权利要求1所述的绞股蓝提取物，其特征在于，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得。

3.一种绞股蓝提取物的检测方法，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得；

其特征在于，采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，以0.5～1.5％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：365～375nm；流速：1.0～2.0mL·min^-1；柱温：25～35℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以55％～65％甲醇制成每1mL含80～120μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以55％～65％甲醇制成每1mL含80～120μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末20～30mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入55％～65％甲醇70～90mL，超声处理25～35min，超声功率为250～350W，超声频率为55～65KHz，超声温度为40～50℃，放冷，加55％～65％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.如权利要求3所述的绞股蓝提取物的检测方法，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得；

其特征在于，采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，规格：4.6mm×150mm，5μm；以1％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：368nm；流速：1.5mL·min^-1；柱温：30℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入60％甲醇80mL，超声处理30min，超声功率为300W，超声频率为60KHz，超声温度为45℃，放冷，加60％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.如权利要求1～2任意一项所述的绞股蓝提取物，其特征在于，该绞股蓝提取物采用药学中常规的制药方法制备成硬胶囊剂。

6.一种绞股蓝提取物在制备治疗卵巢早衰药物中的应用，其特征在于，该绞股蓝提取物是采用如下方法制备的：

(1)将绞股蓝置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的绞股蓝进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料量为500g，分选频率为30Hz，粉碎时间为20min，得绞股蓝超微粉A；

(2)取步骤(1)所得绞股蓝超微粉A，加入15倍量pH为10的氨水溶液，微波提取，微波功率500W，提取时间40min，提取温度60℃，提取液滤过，滤液浓缩成浸膏，得到浸膏B；

(3)取步骤(2)所得浸膏B进行柱层析分离，选用H-60型大孔吸附树脂树脂，柱径高比为1:10，上样体积12BV，水洗10BV除杂，再用50％的乙醇溶液洗脱10BV除杂，再以乙酸乙酯:1％冰醋酸溶液＝80:20的洗脱剂12BV洗脱，流速为1BV·h^-1，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得；

采用高效液相色谱法测定绞股蓝提取物中绞股蓝皂苷A、人参皂苷Rb₁的含量，步骤如下：

(1)色谱柱：C₁₈色谱柱，规格：4.6mm×150mm，5μm；以1％冰醋酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，洗脱顺序为：从0min到15min，1％冰醋酸溶液从10％线性上升至25％，乙腈从90％线性下降至75％，从16min到25min，1％冰醋酸溶液从25％线性上升至45％，乙腈从75％线性下降至55％，从26min到45min，1％冰醋酸溶液从45％线性上升至75％，乙腈从55％线性下降至25％；检测波长：368nm；流速：1.5mL·min^-1；柱温：30℃；理论塔板数按人参皂苷Rb₁峰计算应不低于3500；

(2)对照品溶液的制备：精密称取绞股蓝皂苷A对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的绞股蓝皂苷A对照品溶液；精密称取人参皂苷Rb₁对照品，以60％甲醇制成每1mL含100μg的人参皂苷Rb₁对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末25mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入60％甲醇80mL，超声处理30min，超声功率为300W，超声频率为60KHz，超声温度为45℃，放冷，加60％甲醇至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。