CN117630233A - 一种全血中25-羟基维生素d的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学分析检测技术领域，尤其涉及一种全血中25‑羟基维生素D的检测方法。检测方法包括：将全血样本与乙腈混合后离心，取上清液进行氮吹和复溶后，采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测；高效液相色谱的检测条件包括：C18色谱柱；流动相A为乙酸水溶液，流动相B包括甲醇、异丙醇和异丁醇。本发明提供了一种能准确、高效地同时检测全血中25‑羟基维生素D3和25‑羟基维生素D2的高效液相色谱法，无需对全血进行血清分离的步骤，实现了直接对全血中25‑羟基维生素D3和25‑羟基维生素D2的准确检测，便于临床实现快速对全血中25‑羟基维生素D的监测需求。
Description
技术领域
本发明涉及医学分析检测技术领域，尤其涉及一种全血中25-羟基维生素D的检测方法。
背景技术
维生素是维持机体正常生理功能、维持细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物，是人体健康所必须的一类基本营养物质，在调节物质代谢过程中发挥重要作用。维生素D属于脂溶性维生素，是调节骨代谢的重要维生素，婴幼儿缺乏维生素D会导致佝偻病，成人缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素D时，体内维生素D负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。25-羟基维生素D半衰期较长，体内存在形式稳定且浓度较高，是监测体内维生素D营养水平的标志物。25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是25-羟基维生素D在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素D的检测指标，因此，监测人体内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，有助于评价人体维生素D的状况。
现有技术中大多都是针对血清样本进行分析检测，较少有直接采用人全血样本检测其中的25-羟基维生素D含量的检测方法。即便是采用人全血的样本进行检测，也均是通过液相色谱-串联质谱法进行检测。例如CN 115980211 A通过液相色谱-串联质谱法实现了对血斑、血清、血浆、全血等多种标本中25-羟基维生素D的检测。但是，质谱仪设备昂贵、使用和维护成本较高，制约了采用质谱仪的相关检测方法在一些基层医院和科研单位的使用。
发明内容
为了解决上述技术难题，本发明提供了一种定量检测全血中25-羟基维生素D的高效液相色谱法。具体发明内容包括如下：
首先，本发明提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，包括：
将全血样本与乙腈混合后离心，取上清液进行氮吹和复溶后，采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测；
所述高效液相色谱的检测条件包括：
C18色谱柱，其规格为（4~6）μm，（4~5）×（95~105）mm；
所述等度洗脱的流动相包括流动相A和流动相B；
流动相A为乙酸水溶液，流动相B包括体积比为（15~20）:（0.8~1.2）:1的甲醇、异丙醇和异丁醇；
所述等度洗脱过程中流动相A和流动相B的体积百分比之和为100%，流动相A的体积百分比为22%~26%。
由于血清和全血中所含的杂质存在较大差异，针对血清的蛋白沉淀剂不一定仍然适用于全血样本的蛋白沉淀过程，因此，发明人针对全血样本以及采用高效液相色谱检测所需满足的进样要求，对大量蛋白沉淀剂的选用进行优化，包括单独采用乙腈、采用甲醇乙腈异丙醇混合液、以及在其基础上添加硫酸锌以及硫酸铵溶液后，最终发现单独采用乙腈和全血样本直接混合后，蛋白沉淀的效果最佳且高效液相色谱的响应值较好，前处理方法高效、简便。
由于选择不同的蛋白沉淀剂对全血样本的蛋白沉淀效果存在较大差异，导致前处理后的待测样本中的杂质种类和含量也存在较大差异，因此发明人进一步针对采用乙腈蛋白沉淀后的前处理样本，对色谱条件进行组合优化，最终获得了上述高效液相色谱的检测条件。
通过上述前处理方法以及上述液相色谱条件的联合应用，能够实现准确、高效地同时检测全血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2。
优选地，所述全血为人全血。
更优选地，所述人全血为人毛细血管全血。
更优选地，所述人全血为人指尖毛细血管全血。
本发明中的检测方法能够准确定量检测出25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2，但是本领域公知，仅依靠25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的指标并不能够直接指向特定的疾病，因此本发明的检测方法并不涉及疾病的诊断与治疗。
优选地，乙腈与全血样本的体积比为1：（0.4~0.6）。
优选地，乙腈与全血样本的体积比为1：（0.47~0.53）。
控制乙腈和全血样本的体积比在上述范围内，能够使得蛋白沉淀的效果更好且使得高效液相色谱的响应值更高。
优选地，所述流动相B还包括乙酸。
优选地，乙酸的体积与所述流动相B中甲醇、异丙醇和异丁醇的总体积的比例为（680~720μL）：1L。
最优选地，流动相B包括体积比为900mL：50mL：50mL：700μL的甲醇、异丙醇、异丁醇和乙酸。
优选地，所述流动相A中乙酸与水的体积比为（320~380）μL：500mL。
最优选地，流动相A包括体积比为500mL：350μL的水和乙酸。
优选地，所述离心的转速为12000 rpm以上；离心时间为8min以上。最优选为13000rpm以上离心10min以上。
优选地，所述氮吹的温度为60℃以上。
在上述氮吹温度下能够使得氮吹时间进一步缩短，有利于节约前处理时间。
优选地，所述复溶采用的复溶液为乙腈水溶液。
通常复溶液与流动相组分保持一致，从而避免溶剂效应的产生，然而本发明发现在本发明的前处理过程中选择乙腈水溶液，也可以消除溶剂效应，且配制使用更方便。
优选地，乙腈占所述复溶液的体积百分比为75%~85%，最优选为80%。
优选地，复溶液的添加体积为70~90μL，最优选为80μL。
优选地，所述C18色谱柱为SVEA色谱柱。
本发明进一步发现选择SVEA（瑞典Nanologica公司）色谱柱的检测效果更佳，采用月旭的相同规格的色谱柱（Ultimate XB-C18，货号为00201-31041）基线鼓包。
优选地，等度洗脱的流速为1~1.2 mL/min。
优选地，所述氮吹和复溶后，振荡离心，然后采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测。
优选地，所述氮吹和复溶后，先在1500rpm以上振荡，然后离心，而后采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测。
优选地，将全血样本与乙腈混合后，先在3000rpm以上振荡后离心。
优选地，离心的温度优选为2~6℃。
优选地，离心后取200μL~250μL上清液进行氮吹。
在一些实施方案中，将校准品、质控品与样本进行相同的前处理。
在一些实施方案中，采用外标法建立标准曲线实现定量分析检测。
在一些实施方案中，通过内标法定量分析检测。
本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到本发明检测方法的其它较优实施方案。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种能准确、高效地同时检测全血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的高效液相色谱法。该方法能满足相关法规对25-羟基维生素D检测的线性、重复性、准确度、精密度、基质效应、特异性等要求，无需对全血进行血清分离的步骤，实现了直接对全血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的准确检测，便于临床实现快速对全血中25-羟基维生素D的监测需求。
附图说明
图1是实施例1检测全血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的高效液相色谱图。
图2是实施例2采用不同全血样本量高效液相色谱响应值对比图。
图3是对比例1采用不同蛋白沉淀液的高效液相色谱图。
图4是对比例2采用不同蛋白沉淀液的高效液相色谱图。
图5是对比例3更换流动相后的高效液相色谱图。
图6是对比例4采用不同流动相体积比的高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
由于人源样本难以获得，下述实施例采用兔全血作为人全血的替代基质配制标准曲线的各个浓度点及质控。
下述实施例中的人血样本来源为指尖毛细血管血。
实施例1
本实施例提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，包括如下步骤：
1、试剂配制
1.1、维生素D标准品及质控品配制
试剂如表1所示。
表1
1.1.1 储备液配制
购置的25-羟基维生素D2（BePure，MU-0005-1mg）具有准确的质量，无需称量，直接加入1mL（准确移取）甲醇，超声至25-羟基维生素D2完全溶解，得1.00mg/mL的25-羟基维生素D2储备液（SSC-D2），转移至1.5mL棕色小瓶中，贴标签，-20℃保存；
购置的25-羟基维生素D3（BePure，MU-0010-1mg）具有准确的质量，无需称量，直接加入1mL（准确移取）甲醇，超声至25-羟基维生素D3完全溶解，得1.00mg/mL的25-羟基维生素D3储备液（SSC-D3），转移至1.5mL棕色小瓶中，贴标签，-20℃保存。最终得到以下储备液。
表2
1.1.2 替代基质H0：兔全血
1.1.3 校准品及质控品配制
（1）25羟基维生素D2/D3浓储液（SSC-D2/D3）配制
1）精密量取25μLSSC-D2和25μLSSC-D3加入到25mL棕色容量瓶中；
2）用甲醇定容至刻度线、并混合均匀，最终得到25mL 25羟基维生素D2/D3浓储液（SSC-D2/D3）。浓储液中各组分浓度为：D2：1000ng/mL；D3：1000ng/mL。
（2）校准品C5配制
1）精密量取180mL H0，加入到合适的玻璃容器中；
2）精密量取20mL SSC-D2/D3到步骤1）的容器中混匀，最终得到200mL校准品C5。C5中各组分浓度为：D2：100ng/mL；D3：100ng/mL。
（3）校准品C1-C4及质控品QCL、QCH配制
校准品C1-C4及质控品QCL、QCH由校准品C5和替代基质H0稀释得到，稀释比例见表3（此处以配制50mL为例）。
表3
配制后浓度如表4，配制好后，贴标签，-20℃保存。
表4
1.2、蛋白沉淀液的配制
直接取购买好的色谱纯乙腈试剂进行分装即可，贴标签，常温保存。
1.3、复溶液的配制
以配制10mL的量为例，用移液器分别准确量取8mL乙腈和2mL纯化水，放入10mL的溶剂瓶中，超声混合均匀，配制成复溶液，贴标签，常温保存。
1.4、流动相配制
流动相A液配制：用量筒准确移取500mL水，加入350μL乙酸，混匀超声脱气，待用。
流动相B液配制：用量筒分别准确移取900mL色谱级甲醇、50mL色谱级异丙醇、50mL色谱级异丁醇，加入700μL乙酸，混匀超声脱气，待用。
2、使用的设备如表5所示。
表5
3、前处理及液相色谱检测
（1）检测样本制备：加校准品、质控品、样本：精密移取100μL校准品、质控品、样本，分别加入到1.5mL离心管中。
（2）蛋白沉淀：精密移取200μL蛋白沉淀液，分别加入到以上对应的1.5mL离心管中。
（3）振荡：盖上离心管盖，置于涡旋混匀仪上，3000rpm充分振荡10min。
（4）离心：于4 ℃、13000 rpm离心10min。
（5）取上清液：取250 μL的上清液置于96孔U型板中。
（6）氮吹/复溶：将1mL 96孔U型板放置于氮吹仪，60℃氮气吹干后，用复溶液80μL复溶。
（7）振荡：盖上96孔板垫，置于96孔板混匀仪中，1500rpm充分振荡5 min。
（8）离心：将96孔U型板置于4 ℃、4000 rpm离心机中，离心5min。
（9）检测：将96孔板置于液相色谱分析仪中，进行检测；液相色谱分析仪参数如表6所示。
表6
4、线性范围试验
4.1、验证方法：按照上述处理方法处理待测产品校准品C1~C5溶液，每个浓度重复测试3次。可参考公式计算线性回归的相关系数r，相关系数R^2应≥0.990。
；
r：线性回归相关系数；
xi：C1~C5的浓度；
yi：对应浓度溶液中校准品的峰面积均值。
4.2、接受标准：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数r均≥0.990。
4.3、实验结果
线性范围：维生素D2/D3：10ng/mL~100ng/mL，具体如表7所示。
表7
4.4、结论
25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3线性回归的相关系数R^2均≥0.990，满足接受标准。
5、重复性试验
使用已配制好的质控品，按照上述检测方法，每个样本重复测定10次，参考公式计算重复性的变异系数（CV）。
；
CV：重复性的变异系数；
：10次测量结果的平均值；
S：10次测量结果的标准差。
接受标准：低值质控品的变异系数CV≤20%，高值质控品的变异系数CV≤15%。
实验结果如表8所示，结果表明，低值质控品的变异系数CV≤20%，高值质控品的变异系数CV≤15%，满足接受标准。
表8
6、精密度试验
6.1、实验流程
混合低、中、高三个不同浓度的血样，低浓度样本25-羟基维生素D3含量小于15ng/mL；中浓度样本25-羟基维生素D3含量大于15ng/mL并且小于30ng/mL；高浓度样本25-羟基维生素D3含量大于30ng/mL或25-羟基维生素D2含量为未检出。在其中分别加入25羟基维生素D2标准品，使得低、中、高浓度混合血样的25-羟基维生素D2含量为分别为10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml。连续测试5天，每天每个浓度平行处理5份，分别计算5天测试含量的平均值、批内差和批间差。25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的批内和批间精密度评价结果分别如表9和表10所示。测试结果表明，测试相同人全血中的25-羟基维生素D2/D3的批间批内精密度RSD均≤15%，批内批间精密度评价满足方法学要求。
表9
表10
7、基质效应试验
实验方法：100μL血样前处理后测得峰面积A；100μL带基质的标样经前处理后测得峰面积B；50μL血样和50μL带基质的标样混合后经前处理测得峰面积C。
可接受标准：基质偏差（%）=（A+B）/2C（%），基质偏差≤±20%。
25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的测试结果分别如表11和表12所示。测试结果表明，测试相同血样的25-羟基维生素D2/D3的基质效应均≤±20%，基质效应评价满足方法学要求。
表11
表12
8、血样干扰试验
8.1实验流程
8.1.1贮存液的配制如表13所示。
表13
8.1.2测试样本T的配制
按照实验设计的干扰物浓度要求，在基础样本（混合全血）上添加一定量的干扰物贮存液作为测试样本，本实验方案添加量统一为基础样本的5%添加量。每个样本重测5次，取均值。
8.1.3对照样本C的配制
在基础样本（混合全血）中统一添加5%制备贮存液的溶剂作为对照样本，其添加体积与测试样本相同。每个样本重测5次，取均值。
8.1.4进样列表
按交互顺序分析测试标本和对照标本，即：
C1T1C2T2C3T3C4T4C5T5。
8.1.5 接受标准
若，则潜在干扰物质对分析物的测定没有影响，否则可以判断潜在的干扰成立。
25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的测试结果分别如表14和表15所示。测试结果显示，4个干扰物质对分析物测定的偏差Dev%均在接受标准范围内，判定4个潜在干扰物质对分析物的测定没有影响。
表14
表15
9、加标回收率试验
（1）血清样本本底测试：取两种不同的混血，分别取100μL全血各4个，按照上述检测方法使用已配制好的校准品测试全血中25-羟基维生素D3及25-羟基维生素D2本底含量。
（2）加标样本配制：取90 μL的混合全血样本，分别加入浓度为24ng/mL、48ng/mL、96ng/mL的低、中、高三种水平的25-羟基维生素D2/D3的标准品10μL，待用。
（3）按照上述检测方法使用已配制好的校准品测试全血加标后的样本。
接受标准：加标回收率80%~120%。
25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的测试结果分别如表16和表17所示。25-羟基维生素D3的加标回收率为88%~114%，25-羟基维生素D2的加标回收率为85%~111%均在范围内，满足要求。
表16
表17
10、实际样本检测数据
按照上述检测方法使用已配制好的校准品测试实际人血样本50例，数据如表18所示。
表18
综上所述，本发明的前处理操作简便、氮吹时间短、重复性及准确度高；该方法25-羟基维生素D2线性范围为10~100ng/mL、25-羟基维生素D3线性范围为10~100ng/mL，相关系数均r≥ 0.990（线性范围宽）；低值质控品重复性的变异系数（CV）≤ 20%，高值质控品重复性的变异系数（CV）≤ 15%（重复性好）；25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的批间批内精密度RSD均≤15%（精密度好），基质效应均≤±20%，胆红素等干扰物质对分析物的测定没有影响（特异性好），加标回收率为85%~114%（准确度好），本实施例检测方法的色谱图如图1所示。
实施例2
本实施例提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：
前处理中样本的添加量由100μL分别调整为40μL，150μL，200μL。
测试结果如图2所示，全血样本量较低时，较难检测到响应值；全血样本量较高时，会出现干扰。
对比例1
本对比例提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：
前处理中将蛋白沉淀液乙腈替换为甲醇：乙腈：异丙醇（体积比10：85：5）的混合液。
结果如图3所示，目标物测试谱图峰形差，且有干扰物峰存在。
对比例2
本对比例提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：
在乙腈的基础上加入0.2mol/L的硫酸锌溶液，加入量依次为10μL、20μL、30μL，作为蛋白沉淀液。
以及在乙腈的基础上加入50μL饱和硫酸铵溶液，作为蛋白沉淀液。
结果如图4所示，在乙腈的基础上添加不同体积的硫酸锌溶液或饱和硫酸铵溶液并没有对目标物25-羟基维生素D的响应值有明显改善情况。
对比例3
本对比例提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：
将流动相B中的甲醇、异丙醇和异丁醇替换为等量的乙腈。
结果如图5所示，乙腈水作为流动相时，峰形好但干扰过多，目标物易受到影响。
对比例4
本对比例提供了一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：
将实施例1中A水相/B有机相比例24：76依次修改为：30：70和20:80。
结果如图6所示，流动相体积比为24：76时，25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的分离效果最好。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种全血中25-羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括：
将全血样本与乙腈混合后离心，取上清液进行氮吹和复溶后，采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测；
所述高效液相色谱的检测条件包括：
C18色谱柱，其规格为（4~6）μm，（4~5）×（95~105）mm；
所述等度洗脱的流动相包括流动相A和流动相B；
流动相A为乙酸水溶液，流动相B包括体积比为（15~20）:（0.8~1.2）:1的甲醇、异丙醇和异丁醇；
所述等度洗脱过程中流动相A和流动相B的体积百分比之和为100%，流动相A的体积百分比为22%~26%。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，乙腈与全血样本的体积比为1：（0.4~0.6）。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，乙腈与全血样本的体积比为1：（0.47~0.53）。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相B还包括乙酸。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述离心的转速为12000 rpm以上；离心时间为8min以上。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氮吹的温度为60℃以上。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述复溶采用的复溶液为乙腈水溶液。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，乙腈占所述复溶液的体积百分比为75%~85%。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为SVEA色谱柱。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氮吹和复溶后，振荡离心，然后采用高效液相色谱等度洗脱的方式进行检测。
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