CN116297931A - 一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法 - Google Patents

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CN116297931A CN202310175975.7A CN202310175975A CN116297931A CN 116297931 A CN116297931 A CN 116297931A CN 202310175975 A CN202310175975 A CN 202310175975A CN 116297931 A CN116297931 A CN 116297931A
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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，具体公开了一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，采用高效液相色谱和质谱联用法，其中，高效液相色谱的条件包括：采用EC‑C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为甲酸溶液，流动相B为乙腈水溶液，按照设定程序进行洗脱，质谱条件包括：离子源：AJS‑ESI；扫描模式：MRM；气体流量：4～6L/min；气体温度：290～310℃；雾化气压力：40～50psi；鞘气温度：340～360℃；鞘气流量：10～12L/min。本发明在不对牛磺酸进行衍生的条件下，能够定量地检测出复方氨基酸注射液中牛磺酸含量，提高检测准确度，从而保证了复方氨基酸注射液的质量、提高临床用药的安全性和有效性。

Description

一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法。
背景技术
牛磺酸是一种由含硫氨基酸转化而来的氨基酸，又名牛黄酸、牛胆酸、牛胆碱、牛胆素。广泛分布于体内各个组织和器官，且主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中。是一种有机渗透的调节物质，其不仅参与调节细胞体积，还为胆汁盐的形成提供基础，在细胞内游离钙浓度的调制方面也起到了重要作用。虽然牛磺酸是一种未纳入蛋白质类物质的特殊氨基酸，但牛磺酸是大脑、视网膜、肌肉组织中最丰富的氨基酸。牛磺酸应用广泛，如在中枢神经系统的功能、细胞保护作用、心肌病、肾功能不全、肾功能发育异常和视网膜神经损伤等方面都有牛磺酸。
复方氨基酸注射液为常见的一种肠外营养注射液，在临床上应用范围较广。由于其成分复杂，含有多种氨基酸，为了保证临床用药的安全性和有效性，每种氨基酸成分均需要根据处方标示量进行含量控制。其中牛磺酸是其主要有效成分之一，其结构式如下：
Figure BDA0004100846380000011
现有文献资料中，复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法主要有3种类型，一是氨基酸分析仪进行检测，但该方法中牛磺酸出峰时间短，易受干扰；二是采用衍生试剂进行预处理，该方法要求在衍生化后固定的时间进行检测，易发生系统误差；三是采用CAD检测器进行检测，经过试验发现此方法在检测过程中不稳定；故需要单独建立一种方法针对复方氨基酸中牛磺酸含量进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，在不对牛磺酸进行衍生的条件下，能够定量地检测出复方氨基酸注射液中牛磺酸含量，提高检测准确度。
本发明通过下述技术方案实现：
一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，采用高效液相色谱和质谱联用法，其中，高效液相色谱的条件包括：采用EC-C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为甲酸溶液，流动相B为乙腈水溶液，按下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 A1 B1
2 A1 B1
2.1 A2 B2
4 A2 B2
4.1 A1 B1
6 A1 B1
其中，A1＝90～100％，A2＝5～20％；B1＝0～10％，B2＝80～95％；
质谱条件包括：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：4～6L/min；气体温度：290～310℃；雾化气压力：40～50psi；鞘气温度：340～360℃；鞘气流量：10～12L/min。毛细管电压：+4000V；Delta EMV(+)：200V；驻留时间：200ms；0～2.5min To MS；其余时间ToWaste。
在高效液相色谱和质谱联用法(液相质谱联用仪)中，高效液相色谱主要作用是分离，质谱作为检测器，一次进样后就能获得一个结果。
本发明提供的牛磺酸的检测方法，通过对液相条件和质谱条件的筛选优化，成功建立了一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的准确定量检测，且无需对牛磺酸进行衍生。该检测方法经过系统的方法学验证，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出复方氨基酸注射液中的牛磺酸含量，从而提高相关复方氨基酸注射液临床用药的安全性和有效性。
本发明在使用时，供试品溶液制备方式：精密量取本品，用水稀释至含牛磺酸约20ng/ml，即得。对照品溶液制备方式：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液和对照品贮备液各适量，用水稀释至含牛磺酸约20ng/ml，即得。
不同样品制备方式会影响回收率，采用上述制样的方式具有较高的回收率。
供试品高效液相色谱的进样浓度为10ng/ml～50ng/ml；对照品溶液制备采用阴性加标的方式制备。
进一步地，按下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 98 2
2 98 2
2.1 10 90
4 10 90
4.1 98 2
6 98 2
。
在本发明中，起分离作用的是流动相A-流动相B(98:2)的比例，中间增加的梯度目的是冲洗色谱柱，后续低毒目的是平衡色谱柱。
通过试验发现：采用上述梯度洗脱不仅能起到很好的分离作用，且能够平衡色谱柱。
进一步地，高效液相色谱中流动相的流速为0.6～1.0ml/min。
进一步地，高效液相色谱的进样量为1～3μl。
进一步地，高效液相色谱的柱温为25～40℃。
进一步地，高效液相色谱的柱温为30～35℃。
进一步地，高效液相色谱采用的流动相A为0.01～0.2％L的甲酸溶液。
进一步地，高效液相色谱包括LC、HPLC和UPLC。
进一步地，质谱条件包括：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：5L/min；气体温度：300℃；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min。
牛磺酸的质谱参数：
Figure BDA0004100846380000031
采用上述质谱条件和质谱参数，能够很好实现对样品的检测。
进一步地，高效液相色谱条件包括：色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18，4.6mm×100mm，2.7μm；
流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；
柱温为30℃；进样体积为1μl；流速为每分钟0.6ml；梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 98 2
2 98 2
2.1 10 90
4 10 90
4.1 98 2
6 98 2
质谱条件为：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：5L/min；气体温度：300℃；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；
牛磺酸的质谱参数：
Figure BDA0004100846380000032
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，采用高效液相色谱和质谱联用法通过对液相色谱条件和质谱的筛选和优化，不用对牛磺酸进行衍生，有效避免了因衍生物不稳定导致检测误差，实现了在不对牛磺酸进行衍生的条件下，能够定量地检测出复方氨基酸注射液中牛磺酸含量，提高检测准确度。
2、本发明的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，灵敏度高，能够对含量复方氨基酸中含量极低的牛磺酸进行检测。
3、本发明的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，稳定性良好，且检测时间短、效率高。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为对照品溶液的检测示意图；
图2为缺牛磺酸阴性空白溶液的检测示意图；
图3为含有牛磺酸的供试品溶液的检测示意图；
图4为实施例2中牛磺酸含量线性及灵敏度考察结果图；
图5为对比例1中对照品溶液的检测示意图；
图6为对比例1中加标溶液的检测示意图；
图7为对比例2中对照品溶液的检测示意图；
图8为对比例2中加标溶液的检测示意图；
图9为对比例3中对照品溶液的检测示意图；
图10为对比例3中加标溶液的检测示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1(专属性实验)：
一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，包括以下内容：
液相色谱和质谱联用，其高效液相色谱条件包括：
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18，4.6mm×100mm，2.7μm；
流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；
柱温为30℃；进样体积为1μl；流速为每分钟0.6ml；梯度洗脱程序如表1所示：
表1
Figure BDA0004100846380000041
Figure BDA0004100846380000051
质谱条件为：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：5L/min；气体温度：300℃；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；毛细管电压：+4000V；DeltaEMV(+)：200V；驻留时间：200ms；0～2.5min To MS；其余时间To Waste。
牛磺酸的质谱参数如表2所示：
表2
Figure BDA0004100846380000052
溶液制备：
缺牛磺酸阴性空白贮备液：精密量取缺牛磺酸阴性样品1.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
缺牛磺酸阴性空白溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
对照品贮备液：取牛磺酸对照品5.0mg，精密称定，置10ml量瓶中，加45％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，混匀；
对照品溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液、对照品贮备液用水稀释至约20ng/ml，作为对照品溶液。
供试品溶液：精密量取四川科伦药液股份有限公司复方氨基酸注射液1.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀；精密量取0.8ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，即得。
将对照品溶液、缺牛磺酸阴性空白溶液和含有牛磺酸的供试品溶液按照实施例1所述方法进行检测，检测结果分别如图1-图3所示：
由图1-图3可知：知阴性空白溶液、供试品中其他成分不干扰牛磺酸的检测。
实施例2(线性及灵敏度实验)：
缺牛磺酸阴性空白贮备液：精密量取缺牛磺酸阴性样品1.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
缺牛磺酸阴性空白溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
对照品贮备液：称取牛磺酸对照5.000mg，置10ml量瓶中，加45％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，混匀；精密取1.0ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀；精密量取2ml，置20ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，即得(2μg/ml)
取对照品贮备液进行稀释，然后进样分析，色谱条件同“实施例1”，检测结果如表3所示
表3牛磺酸含量线性及灵敏度考察结果
Figure BDA0004100846380000062
有上表可知：在2.000ng/ml～30.00ng/ml浓度范围内，线性相关系数r为0.9996>0.995，截距偏差为0.61％<10％，说明线性与范围满足要求。检测限浓度为1.000ng/ml(相当于含量浓度的5.0％，S/N为5.1)，方法定量限浓度为2.000ng/ml(相当于含量浓度10％，S/N为17.1)，方法灵敏度满足检测要求。
实施例3(准确度实验)：
缺牛磺酸阴性空白贮备液：精密量取缺牛磺酸阴性样品1.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
缺牛磺酸阴性空白溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
对照品贮备液：称取牛磺酸对照品约5mg，置10ml量瓶中，加45％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，混匀；精密量取1.0ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀；精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，即得(约2μg/ml)。
对照品溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml与对照品贮备液1.0ml，置同一100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为对照品溶液(约20ng/ml)。
回收溶液-80％：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml、对照品贮备液0.8ml，置同一100ml量瓶中，混匀(3份)。
回收溶液-100％：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml、对照品贮备液1.0ml，置同一100ml量瓶中，混匀(3份)。
回收溶液-120％：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml、对照品贮备液1.2ml，置同一100ml量瓶中，混匀(3份)。
取各溶液进样分析，色谱条件同“实施例1”，结果见表4。
表4牛磺酸含量准确度考察结果
Figure BDA0004100846380000071
由表4可知，在缺牛磺酸阴性样品中加入适量牛磺酸(加入量为含量浓度的80％、100％、120％)，各水平下回收率均在90％～110％之间(RSD<5％，n＝9)；说明方法的准确度满足检测要求。
实施例4(耐用性实验)：
缺牛磺酸阴性空白贮备液：精密量取缺牛磺酸阴性样品1.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
缺牛磺酸阴性空白溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
对照品贮备液：称取牛磺酸对照品约5mg，置10ml量瓶中，加45％乙腈溶液溶解并稀释至刻度，混匀；精密量取1.0ml，置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀；精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，即得(约2μg/ml)。
对照品溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml与对照品贮备液1.0ml，置同一100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，作为对照品溶液(约20ng/ml)。
回收溶液：精密量取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml、对照品贮备液1.0ml，置同一100ml量瓶中，混匀。
在确定的基本色谱条件下(0*，同“实施例1专属性”)，分别微调液相与质谱条件(1*-4*)，进样分析，检测条件及结果如表5所示。
表5牛磺酸含量检测耐用性考察结果
Figure BDA0004100846380000081
结果表明，微调相关色谱与质谱参数，溶剂空白及样品中其他成分对牛磺酸检测无干扰，回收率无明显差异(RSD<10％，n＝5)，方法耐用性较好。
综上，本发明提供的牛磺酸的检测方法，通过对液相条件和质谱条件的筛选优化，成功无需对牛磺酸进行衍生，就能实现对复方氨基酸注射液中牛磺酸的准确定量检测。该检测方法具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出复方氨基酸注射液中的牛磺酸含量，从而提高相关复方氨基酸注射液临床用药的安全性和有效性。
对比例1(液相色谱条件筛选)：
液相条件：
流动相A：0.01mol/L甲酸铵溶液；流动相B：乙腈；
流速：1.0ml/min；流动相A-流动相B(50:50)等度洗脱5min。
其余条件同实施例1。
溶液制备(溶剂为水)：
对照品贮备液：牛磺酸0.6mg→1ml(乙腈)；
对照品贮备液1#：取对照品贮备液0.4ml→10ml；取0.9ml→10ml。
对照品溶液：取对照品贮备液1#1ml→10ml(约200ng/ml)。
缺牛磺酸阴性空白贮备液：取缺牛磺酸阴性样品1.0ml→100ml。
缺牛磺酸阴性空白溶液：取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml→10ml。
加样回收溶液：取缺牛磺酸阴性空白贮备液0.8ml+对照品贮备液1#1ml→10ml。
在上述条件下，牛磺酸出峰时间0.852min，对照品溶液峰面积为4972，加样回收溶液峰面积为1034，回收率明显偏低，不满足要求。代表性图谱见附图5～6。
对比例2(液相色谱条件筛选)
调整流动相比例为流动相A-流动相B(98:2)等度洗脱5min，其余条件和样品制备方式同对比例1。
在上述条件下，牛磺酸出峰时间0.905min，对照品溶液峰面积为1501，加样回收溶液峰面积为983，回收率明显偏低，不满足要求。代表性图谱见附图7～8。
对比例3：
液相色谱条件和质谱条件同实施例1，样品制备方式同对比例1。
在上述条件下，牛磺酸响应提高明显，但回收率仅为77.19％，仍偏低。代表性图谱见附图9～10。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱和质谱联用法，其中，高效液相色谱的条件包括：采用EC-C18色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为甲酸溶液，流动相B为乙腈水溶液，按下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 A1 B1 2 A1 B1 2.1 A2 B2 4 A2 B2 4.1 A1 B1 6 A1 B1
其中，A1＝90～100％，A2＝5～20％；B1＝0～10％，B2＝80～95％；
质谱条件包括：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：4～6L/min；气体温度：290～310℃；雾化气压力：40～50psi；鞘气温度：340～360℃；鞘气流量：10～12L/min。
2.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，按下表进行梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 98 2 2 98 2 2.1 10 90 4 10 90 4.1 98 2 6 98 2
。
3.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，高效液相色谱中流动相的流速为0.6～1.0ml/min。
4.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的进样量为1～3μl。
5.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的柱温为25～40℃。
6.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的柱温为30～35℃。
7.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，高效液相色谱采用的流动相A为0.01～0.2％的甲酸溶液。
8.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，高效液相色谱包括LC、HPLC和UPLC。
9.根据权利要求1所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，质谱条件包括：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：5L/min；气体温度：300℃；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种复方氨基酸注射液中牛磺酸的检测方法，其特征在于，
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18，4.6mm×100mm，2.7μm；
流动相A：0.1％甲酸溶液；流动相B：乙腈；
柱温为30℃；进样体积为1μl；流速为每分钟0.6ml；梯度洗脱程序：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 98 2 2 98 2 2.1 10 90 4 10 90 4.1 98 2 6 98 2
质谱条件为：离子源：AJS-ESI；扫描模式：MRM；气体流量：5L/min；气体温度：300℃；雾化气压力：45psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；
牛磺酸的质谱参数：
Figure FDA0004100846370000021
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