ES2251735T3 - Ciclacion de cofactor enzimatico utilizando piridina nucleotido transhidrogenasa soluble. - Google Patents
Ciclacion de cofactor enzimatico utilizando piridina nucleotido transhidrogenasa soluble.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA REACCION ENZIMATICA QUE IMPLICA UN COFACTOR DE UN NUCLEOTIDO PIRIDINICO, EN LA CUAL SE EMPLEA UNA ENZIMA QUE PRESENTA UNA SECUENCIA QUE TIENE UNA IDENTIDAD CON LA SECUENCIA SEQ ID NO:2, SUPERIOR AL 70 %, Y QUE ES CAPAZ DE TRANSFERIR EQUIVALENTES REDUCTORES ENTRE LOS COFACTORES DE NUCLEOTIDO PIRIDINICO. ALTERNATIVAMENTE, SE PUEDE UTILIZAR UNA CELULA TRANSFORMADA PARA EXPRESAR DICHA ENZIMA.
Description
Ciclación de cofactor enzimático utilizando
piridina nucleótido transhidrogenasa soluble.
La presente invención se refiere a la utilización
de una enzima para la oxidación o reducción de cofactores de
piridina nucleótido durante las reacciones enzimáticas in
vivo o in vitro, por ejemplo en las biotransformaciones
enzimáticas o de toda la célula o en técnicas analíticas
enzimáticas.
Los procedimientos de biotransformación que
utilizan microorganismos naturales o genéticamente modificados o
enzimas aisladas proporcionan métodos de síntesis de muchos
productos útiles. Las biotransformaciones presentan varias ventajas
con respecto a los métodos de síntesis química, en particular la
regioespecificidad y la estereoespecificidad de las reacciones
catalizadas por enzimas, la utilización de condiciones de reacción
suaves y la ausencia de requisitos para disolventes tóxicos.
Con frecuencia las enzimas óxidoreductasas
requieren cofactores activos por redox para su actividad. Entre los
cofactores más frecuentes están los cofactores de piridina
nucleótido dinucleótido dicotinamida adenina (NAD: forma oxidada
NAD^{+}, forma reducida NADH) y fosfato de dinucleótido
dicotinamida adenina (NADP: forma oxidada NADP^{+}, forma reducida
NADPH). Estos cofactores son costosos y, excepto en los casos de
productos sumamente valiosos, no pueden suministrarse de manera
factible en cantidades estequiométricas. Este es un factor que
limita la utilización de muchas enzimas oxidoreductasas para las
reacciones de biotransformación.
El requisito para los cofactores en un proceso de
biotransformación puede reducirse proporcionando medios de
regeneración de la forma deseada del cofactor. Esto significa que el
cofactor necesita suministrarse solamente en cantidades catalíticas.
Por ejemplo, si la reacción de interés requiere NAD^{+}, que se
reduce en la reacción a NADH, el NADH puede ser reoxidado por
NAD^{+} mediante otro sistema enzimático, tal como fórmico
deshidrogenasa dependiente de NAD^{+} en presencia de formato.
Esto se denomina ciclación del cofactor. La fórmico deshidrogenasa
es particularmente adecuada para esta finalidad, ya que la reacción
que cataliza es esencialmente irreversible.
Una complicación más es que la mayoría de las
enzimas que requieren NAD no pueden utilizar NADP como cofactor y
viceversa. Por ejemplo, la fórmico deshidrogenasa no puede
utilizarse para regenerar NADPH a partir de NADP^{+}.
Un caso especial es cuando un proceso de
biotransformación requiere dos enzimas oxidoreductasas que requieren
diferentes cofactores. Por ejemplo, un proceso de biotransformación
recientemente propuesto para la conversión de morfina en el potente
analgésico hidromorfona requiere la acción sucesiva de la morfina
deshidrogenasa dependiente de NADP^{+} y la morfinona reductasa
dependiente de NADH (French et al. (1995) Bio/Technology
13:674-676). En la primera reacción, la morfina se
transforma en morfinona con reducción de NADP^{+} a NADPH, y en la
segunda reacción la morfinona se convierte en hidromorfona con
oxidación de NADH a NAD^{+}. Por consiguiente deben suministrarse
ambos NADP^{+} y NADH. Una complicación adicional es que, en
presencia del NADPH generado en la primera reacción, la morfina
deshidrogenasa reduce el producto hidromorfona a un producto
indeseable, dihidromorfina, con reoxidación de NADPH a NADP^{+}.
Estas reacciones se presentan en la Figura 1A adjunta.
Las enzimas dependientes de piridina nucleótido
pueden utilizarse asimismo en determinados procedimientos de ensayo
enzimáticos, siendo determinada la cantidad del analito por el grado
de oxidación o reducción del cofactor. La oxidación y reducción de
NAD y NADP puede medirse por varios métodos; por ejemplo,
espectrofotometría y fluorimetría. Sin embargo, los métodos
excepcionalmente sensibles para la detección de la oxidación o
reducción pueden únicamente estar disponibles para NAD o NADP, pero
no para ambos. Por ejemplo, la oxidación de NADH a NAD^{+} puede
detectarse con suma sensibilidad utilizando las enzimas
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) y fosfoglicerocinasa (PGK) a fosforilato
bifosfato de adenosina (ADP) a trifosfato de adenosina (ATP) en una
reacción que depende de la presencia de NAD^{+} y a continuación
detectando el ATP resultante mediante la reacción emisora de luz que
depende de ATP de la luciferasa de la luciérnaga. Este método no
puede utilizarse para detectar la oxidación de NADPH a NADP^{+},
ya que la GAPDH disponible en el mercado es específica para
NAD^{+}.
Varios de los problemas mencionados anteriormente
pueden solventarse mediante la utilización de una enzima que
transfiere equivalentes reductores entre NAD y NADP; por ejemplo,
reduciendo NAD^{+} a NADH mientras que oxida NADPH a NADP^{+}.
Dicha enzima es conocida como piridina nucleótido transhidrogenasa
(PNTH). Varios tipos de enzima presentan esta actividad (Rydström
et al. (1987) en "Pyridine nucleotide coenzymes: chemical,
biochemical and medical aspects", parte B eds. Dolphin et
al., John Wiley & Sons, NY, pág. 433-460).
La que se conoce mejor es la PNTH que bombea protones, unida a la
membrana que se encuentra en las membranas de los mitocondrias y en
determinadas bacterias tales como Escherichia coli. Esta
enzima, que está unida a la membrana, es generalmente inadecuada con
fines de biotransformación y analíticos.
Por ejemplo, el documento
EP-A-0733712 da a conocer que los
organismos que expresan a PNTH pueden utilizarse como
biocatalizadores. La enzima expresada está unida a la membrana y
necesita una fuente de energía.
Arch. Biochem. Biophys. (1996) 176;
136-143, da a conocer PNTH de Pseudomonas
aeruginosa. Esta enzima PNTH soluble y unida sin energía ha sido
caracterizada con algún detalle, pero su utilidad es limitada.
El gen (denominado sth) que codifica la
transhidrogenasa soluble de NCIMB 9815 de Pseudomonas
fluorescens se ha clonado y secuenciado y la enzima se ha
sobrexpresado en Escherichia coli. Esto permite la
preparación de grandes cantidades de enzimas de manera relativamente
fácil. La enzima se ha purificado y caracterizado. Esta enzima está
definida por la reacción que cataliza, es decir, la transferencia de
equivalentes reductores entre NAD y NADP o los análogos de estos
cofactores; la secuencia del nucleótido del gen estructural,
sth, que codifica la enzima, y la secuencia de aminoácidos
deducida de la enzima procedente de ésta; las propiedades
estructurales de la enzima, incluyendo una subunidad M_{r} de
aproximadamente 50.000; y la capacidad para formar grandes
polímeros de M_{r} que sobrepasa 1.000.000.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se utiliza un microorganismo como catalizador, en el cual se
transforma el microorganismo para expresar una enzima que presenta
una secuencia con una identidad superior al 70% con la SEC. ID nº: 2
y que puede transferir equivalentes reductores entre los cofactores
de piridina nucleó-
tido.
tido.
Un aspecto adicional de la presente invención
consiste en un proceso en el que un sustrato se convierte en un
producto por medio de una enzima y un cofactor de piridina
nucleótido, que comprende la utilización de una enzima u organismo
tal como se definió anteriormente.
Otro aspecto de la invención consiste en una
molécula de nucleótido que presenta una secuencia con una identidad
superior al 70% con la SEC. ID nº: 1, que codifica una enzima con
actividad de la piridina nucleótido transhidrogenasa soluble. El gen
puede utilizarse para la producción de la enzima o de una forma
alterada de la enzima que utiliza un organismo modificado
genéticamente. Por ejemplo, un organismo modificado genéticamente
que lleva en gen sth como la totalidad o parte de un montaje
heterólogo puede desarrollarse de tal modo que estimule la
producción de la enzima, que a continuación puede recuperarse del
medio de cultivo o de los extractos celulares. Los métodos para
realizar esto son bien conocidos en la técnica.
La invención puede ser utilizada por la enzima
que presenta la secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 2, o una
secuencia de aminoácidos que tiene más del 70%, preferentemente por
lo menos el 80%, y más preferentemente por lo menos el 90% de
identidad. La enzima puede utilizarse como tal o como un
microorganismo transformado. Los anfitriones adecuados para la
transformación son bien conocidos por los expertos en la materia. Un
ejemplo de anfitrión adecuado es E. coli.
Una enzima u organismo de la invención puede
utilizarse en biotransformación, con fines analíticos o con
cualquier otro fin apropiado. Es particularmente útil en relación
con una reacción en la que una enzima utiliza un cofactor de
piridina nucleótido. Un ejemplo específico se muestra en la Fig. 1B
(para comparación con la Fig. 1A). La utilización de STH significa
que la reducción de hidromorfona disminuye mucho, evitando el
aumento de NADH. Esto elimina la necesidad de suministrar cofactores
costosos. En la biotransformación, STH puede lanzar equivalentes
reductores desde NADH a NAD^{-}, permitiendo que las células sean
utilizadas en más de un proceso. Puede medirse una señal basada en
la oxidación de NADH y NAD^{+}. La señal alterada puede ser
detectada después mediante una técnica más sensible que no era
aplicable con anterioridad.
El Ejemplo 1 siguiente ilustra la clonación y el
secuenciado de sth, mientras que los Ejemplos 2 y 3 ilustran
la utilización de STH según la invención. Los Ejemplos se
proporcionan con referencia a la Fig. 1 (descrita anteriormente) y a
otros dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 2 es una cartografía de restricción del
fragmento Eco RI de 5,0 kb y el subclon Sac II/Xho I de 0,5 kb que
lleva el gen sth. El área sombreada indica la zona de
codificación y las flechas indican las reacciones de
secuenciado.
La Figura 3 presenta la transformación de morfina
en hidromorfona en presencia de transhidrogenasa soluble. Los
cuadrados, morfina; los círculos, hidromorfona; los triángulos,
dihidromorfina.
La Figura 4 presenta las biotransformaciones
consecutivas de la morfina con células JM109/pMORB3-
AmutMC80S/pPNT4 de E. coli y JM109/pMORB3-AmutMC80S de E. coli (OC = concentración de opioides (mM), \Box = morfina, \bullet = hidromorfona y \blacktriangle = dihidromorfina).
AmutMC80S/pPNT4 de E. coli y JM109/pMORB3-AmutMC80S de E. coli (OC = concentración de opioides (mM), \Box = morfina, \bullet = hidromorfona y \blacktriangle = dihidromorfina).
El dinucleótido de tionicotinamida adenina
(tNAD^{+}) y 2',5'-difosfato de adenosina agarosa
se adquirieron en Sigma (Poole, Dorset, UK). Otros reactivos eran de
calidad analítica o superior y se obtuvieron en Sigma o Aldrich
(Gillingham, Dorset, UK).
NCIMB9815 de Pseudomonas fluorescens se
adquirió en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria
(Aberdeen, Escocia, UK). JM109 de Escherichia coli se
adquirió en Promega (Southampton, UK). Ambos organismos se
cultivaron de forma rutinaria en medio SOD (Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) a 30ºC (P.
fluorescens) o 37ºC (E. coli) con agitación rotativa a
180 rpm.
Se analizó de manera rutinaria la actividad de
STH observando la reducción del dinucleótico de tionicotinamida
adenina (tNAD^{+}), análogo de NAD^{+} con características
espectrales alteradas, a 400 nm en una mezcla de reacción
constituida por tNAD^{+} 0,1 mM y NADPH 0,1 mM en tampón de
fosfato 50 mM, pH 7,0, a 30ºC. Se definió una unidad (U) de
actividad enzimática como la cantidad de actividad que reduce 1 mmol
de tNAD^{+} por minuto en estas condiciones. El cambio molar de
absorbancia a 400 nm de tNAD^{+} en la reducción a tNADH se asumió
como
11.300 l.mol^{-1} cm^{-1} (Cohen et al. (1970) J. Biol. Chem. 245:2825-2836). Se analizó de forma rutinaria la concentración de proteínas utilizando el reactivo de Pierce (Rockford, IL, USA) según el protocolo del fabricante. Se utilizó albúmina de suero bovino como patrón. Se calculó la actividad específica en unidades de actividad de STH por mg de proteína (U/mg).
11.300 l.mol^{-1} cm^{-1} (Cohen et al. (1970) J. Biol. Chem. 245:2825-2836). Se analizó de forma rutinaria la concentración de proteínas utilizando el reactivo de Pierce (Rockford, IL, USA) según el protocolo del fabricante. Se utilizó albúmina de suero bovino como patrón. Se calculó la actividad específica en unidades de actividad de STH por mg de proteína (U/mg).
Se adquirió pBluescript SK+, vector de clonación
patrón, en Stratagene (Cambridge, Cambs., UK). polisacárido IEMBL,
vector de bajo número de copias, está descrito en Poustka et
al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:4129-4133. Se realizaron la transferencia
Southern y la manipulación del ADN utilizando técnicas normalizadas
(Sambrook et al., supra).
Purificación de STH: Se purificó piridina
nucleótido transhidrogenasa soluble (STH) a partir de las
células
NCIMB9815 de P. fluorescens según una modificación del método de Höjeberg et al. (1976) Eur. J. Biochem. 66:467-475. Se cultivaron las células en esta fase estacionaria en 1 l de medio SOB. Se recogieron las células por centrifugación (5.000 g, 15 min) y se volvieron a poner en suspensión en 20 ml de tampón A (Tris/HCl 50 mM, pH 7,0, con ditiotreitol 2 mM). A continuación se destruyeron las células mediante tratamiento con ultrasonidos (25 detonaciones de 5 s a 12 \mum separadas por pausas de 30 s para refrigeración en un baño de agua con hielo) utilizando un MSE Soniprep 150. Se eliminó el residuo celular por centrifugación (25.000 g, 10 min). El extracto contenía 93 unidades de actividad de STH a una actividad específica de 0,19 U/mg.
NCIMB9815 de P. fluorescens según una modificación del método de Höjeberg et al. (1976) Eur. J. Biochem. 66:467-475. Se cultivaron las células en esta fase estacionaria en 1 l de medio SOB. Se recogieron las células por centrifugación (5.000 g, 15 min) y se volvieron a poner en suspensión en 20 ml de tampón A (Tris/HCl 50 mM, pH 7,0, con ditiotreitol 2 mM). A continuación se destruyeron las células mediante tratamiento con ultrasonidos (25 detonaciones de 5 s a 12 \mum separadas por pausas de 30 s para refrigeración en un baño de agua con hielo) utilizando un MSE Soniprep 150. Se eliminó el residuo celular por centrifugación (25.000 g, 10 min). El extracto contenía 93 unidades de actividad de STH a una actividad específica de 0,19 U/mg.
Se purificó STH utilizando una columna de 1 cm de
diámetro interno rellena con 6 ml de 2',5'-difosfato
de adenosina agarosa (altura de relleno 7,6 cm). Se operó la columna
a 12 ml/h durante la carga y a 24 ml/h durante el lavado. Todos los
procedimientos se realizaron a 4ºC y todos los tampones contenían
ditiotreitol 2 mM. Después del equilibrado de la columna con
CaCl_{2} 5 mM en tampón A, se cargó en la columna extracto en
bruto (20 ml), al que se había añadido CaCl_{2} hasta una
concentración final de 5 mM. Se lavó la columna a continuación con
90 ml de NaCl
0,4 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A, seguido de 24 ml de NaCl 0,7 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A. En dirección inversa se eluyó con Tris/HCl 50 mM, pH 8,9, que contenía NaCl 0,4 M. Se recogieron las fracciones de 5 ml y se agruparon las fracciones activas. El producto agrupado se concentró por ultrafiltración utilizando una celda de ultrafiltración Amicon 8050 dotada de una membrana de corte M_{r} nominal 10.000 y a continuación se diafiltró con tampón A para reducir el pH y la concentración salina. El volumen final fue de 1,5 ml. Este material contenía 62 U de actividad de STH a una actividad específica de 140 U/mg.
0,4 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A, seguido de 24 ml de NaCl 0,7 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A. En dirección inversa se eluyó con Tris/HCl 50 mM, pH 8,9, que contenía NaCl 0,4 M. Se recogieron las fracciones de 5 ml y se agruparon las fracciones activas. El producto agrupado se concentró por ultrafiltración utilizando una celda de ultrafiltración Amicon 8050 dotada de una membrana de corte M_{r} nominal 10.000 y a continuación se diafiltró con tampón A para reducir el pH y la concentración salina. El volumen final fue de 1,5 ml. Este material contenía 62 U de actividad de STH a una actividad específica de 140 U/mg.
Este producto se aplicó a continuación a una
columna de filtración en gel de 1,6 cm de diámetro interno rellena
con 150 ml de Sephacryl S-300 (Pharmacia) (75 cm de
altura de relleno) equilibrada con tampón A. Esta columna se operó a
8 ml/h. Se recogieron las fracciones de 2 ml. Se agruparon las
fracciones activas (16 ml) y se concentraron por ultrafiltración tal
como se describió anteriormente hasta un volumen final de 1 ml. El
producto contenía 26 U de actividad de STH a una actividad
específica de 310 U/mg.
Antes del análisis por SDS-PAGE
se concentró más la muestra mediante liofilización y resuspensión en
un pequeño volumen de tampón A. El material redisuelto no era
activo. SDS-PAGE presentaba una sola banda de
proteínas con un M_{r} aparente de 55.000, conforme con el valor
descrito para la enzima procedente de Pseudomonas aeruginosa
(Rydström et al., supra).
Clonación: Se transfirió la proteína desde
un gel SDS-PAGE a una membrana de
poli(difloruro de vinilideno) (PVDF) (ProBlott, Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando el sistema de
transferencia semiseco
PhastTransfer (Pharmacia, St. Albans, Herts, UK) según las instrucciones del fabricante.
PhastTransfer (Pharmacia, St. Albans, Herts, UK) según las instrucciones del fabricante.
Se determinó la secuencia
N-terminal por degradación automática de Edman. La
secuencia N-terminal de la PNTH purificada se
determinó como:
A-V-Y-N-Y-D-V-V-V-L-G-S-(G/V)-P-A-G-E-(G/V)-A-A-M-N-A-A-(R/D)-
en la que los paréntesis indican asignaciones dudosas.
Se obtuvo como resultado una tabla de sesgo del
codón para P. fluorescens basada en 20 genes en la base de
datos del gen EMBL. Esto puso de manifiesto una preferencia
significativa para G y C en la tercera posición de la mayoría de los
codones. Basándose en este sesgo del codón, se diseñó el
oligonucleótido degenerado siguiente:
AC-(C/G)AC-(C/G)AC-GTC-GTA-GTT-GTA-(C/G)AC-(G/C)GC (basándose en los restos 1 a 9 de la secuencia
N-terminal).
AC-(C/G)AC-(C/G)AC-GTC-GTA-GTT-GTA-(C/G)AC-(G/C)GC (basándose en los restos 1 a 9 de la secuencia
N-terminal).
Las transferencias Southern del ADN genómico de
NCIMB9185 de P. fluorescens demostraron que este
oligonucleótido se liga más fuertemente a un fragmento Eco RI de 5,0
kb. Se preparó un banco de fragmentos Eco RI de 4 a 5 kb en
el vector de clonación pBluescript SK+ utilizando JM109 de E.
coli como anfitrión y las células recombinantes se identificaron
por transferencia de colonias utilizando la sonda de
oligonucleótido. Se aislaron varias colonias positivas y se observó
que todas llevaban la misma inserción de 5,0 kb. Se recuperaron
ambas orientaciones de la inserción. Los plásmidos recombinantes se
denominaron pSTH1A y pSTH1B, variando únicamente en la orientación
de la inserción Eco RI. Se localizó el gen sth por
cartografía de restricción de la inserción seguido de análisis
Southern utilizando la sonda de oligonucleótido. El secuenciado
indicó la presencia de un marco de lectura abierto que codifica una
proteína de la misma secuencia N-terminal que la
determinada para STH. Se prepararon varios subclones en pBluescript
SK+ y se secuenciaron utilizando cebadores basados en el vector como
se presenta en la Figura 1. La secuencia de sth y la
secuencia de STH de aminoácidos deducida se presenta como SEC. ID
nº: 1 y nº 2.
Los extractos celulares preparados a partir de
cultivos saturados de JM109/pSTHIA de E. coli o pSTHIB que
presentaba actividad de STH detectable, se analizaron por reducción
del dinucleótido de tionicotinamida adenina (tNDA^{+}) en
presencia de NADPH. Se subclonó un fragmento Sac
II/Xho I de 1,5 kb en pBluescript SK+ (Figura 2). Este
plásmido se denominó pSTH2. En pSTH2, sth está en la
orientación correcta para ser expresado en el activador lac de
pBluescript SK+. Los extractos celulares de los cultivos saturados
de JM109/pSTH2 de E. coli en ausencia o presencia de IPTG 0,4
mM presentaban actividad de transhidrogenasa de 4,1 U/mg y de 22,0
U/mg respectivamente. Basándose en la actividad específica de la STH
purificada, se estimó que en el último caso STH formó
aproximadamente 6% de proteína celular soluble, aproximadamente 100
veces el nivel observado en P. fluorescens.
Se purificó la STH recombinante hasta
homogeneidad aparente en una sola etapa de cromatografía por
afinidad utilizando 2',5'-difosfato de adenosina
agarosa. Se preparó el extracto celular tal como se describió
anteriormente a partir de 1 l de cultivo saturado de JM109/pSTH2 de
E. coli cultivado en presencia de IPTG 0,4 mM. De los 25 ml
resultantes de extracto celular, se cargaron 5 ml, que contenían
2140 U de actividad de STH a una actividad específica de 27 U/mg en
una columna rellena con 2',5'-difosfato de adenosina
agarosa tal como se describió anteriormente. Se lavó la columna a
continuación con 35 ml de NaCl 0,7 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A.
La STH se eluyó a continuación con NaCl 0,4 M Tris/HCl 50 mM, pH
8,9. Las fracciones más activas, que totalizaban 13 ml, se
agruparon, se concentraron y se dializaron tal como se describió
anteriormente, excepto que se utilizó una membrana de corte de peso
molecular nominal 300.000. El producto contenía 900 U de actividad
de STH a una actividad específica de 300 U/mg. Este material parecía
ser homogéneo por SDS-PAGE; por consiguiente se
omitó la etapa de filtración en gel. La STH purificada se almacenó a
-20ºC en tampón A con ditiotreitol 2 mM, sin pérdida detectable de
actividad durante varias semanas.
Se compararon las propiedades de la STH
recombinante con las descritas para la enzima de Pseudomonas
aeruginosa. La subunidad M_{r} determinada por
SDS-PAGE es coherente con la descrita anteriormente
(Rydström et al., supra). Para determinar si la enzima
recombinante podía formar grandes polímeros, se adsorbieron las
muestras en películas de carbono, teñidas negativamente con acetato
de uranilo al 1% p/v y se examinaron por microscopía electrónica
utilizando un microscopio electrónico Phillips CM100. Se observaron
polímeros largos de aproximadamente 10 nm de diámetro y en exceso de
500 nm de longitud. Esto es coherente con los informes previos
(Louie et al. (1972) J. Mol. Biol.
70:651-664).
Se prepararon morfina deshidrogenasa y morfinona
reductasa a partir de las cepas recombinantes de Escherichia
coli según los procedimientos publicados (Willey et al.
(1993) Biochem. J. 290:539-544; French y
Bruce (1995) Biochem. J. 312:671-678). Se
preparó STH a partir de NCIMB9815 de Pseudomonas fluorescens
tal como se describió en el Ejemplo 1. Se analizaron
cuantitativamente los alcaloides de morfina por HPLC (French et
al., supra).
Se incubó a 4ºC durante 8 horas una mezcla de
reacción constituida por 0,5 ml de tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,0,
que contenía morfina 10 mM, NADPH 0,2 Mm, NAD^{+} 0,2 mM,
ditiotreitol 1 mM, 1 unidad de morfinona reductasa, 1 unidad de
morfina deshidrogenasa y 6 unidades de STH. Se tomaron a intervalos
muestras de 50 \mul, se trataron con ácido acético para precipitar
las proteínas y se analizaron por HPLC. La morfina se convirtió en
hidromorfona con alto rendimiento, como se muestra en la Figura 3.
Se realizó asimismo un experimento en paralelo con carencia de STH.
En este caso, no tuvo lugar ninguna transformación de la morfina.
Esto demuestra que STH es capaz de catalizar la ciclación de los
cofactores en un proceso de biotransformación enzimática.
Un fragmento Pst I de 1,2 kb que lleva un
gen estructural (morA) completo de morfina deshidrogenasa
mutante con su secuencia de unión al ribosoma corriente arriba y
secuencias activadoras se ligó en el vector de bajo número de
copias, pS IEMBL, digerido previamente con Pst I creando el
montaje pMORA4mutMC80S, que contenía las secuencias de restricción
adecuadas para la subclonación adicional. Un fragmento
Hind@III/Eco RI de 1,2 kb que lleva el gen mutante
morA, la secuencia de unión al ribosoma y la zona activadora
se escindió de pMORA4mutMC80S y se ligó en pMORB3 digerido con
HindIII/Eco RI (French et al, supra) que
llevaba una sola copia de morB, gen estructural para
morfinona reductasa, junto con su secuencia de unión al ribosoma y
la zona activadora, creando el montaje
pMORB3-AmutMC80S.
Un fragmento Pst I/Xho I de 1,5 kb que
llevaba el gen estructural para la piridina nucleótido
transhidrogenasa soluble se ligó en pS IEMBL, previamente digerido
con Pst I y Sal I, creando el montaje pPNT4.
Las células
JM109/pMORB3-AmutMC80S de E. coli y
JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 de E. coli se
cultivaron en fase estacionaria y se recogieron por centrifugación a
17.310 x g durante 15 min a 4ºC. Se lavaron a continuación las
células con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se volvieron a
centrifugar. Se eliminó el sobrenadante y los sedimentos celulares
se almacenaron en hielo hasta que se necesitaron para su
biotransformación. Los valores típicos para las actividades
enzimáticas en las células JM109/pMORB3-AmutMC80S de
E. coli fueron 0,06 U/mg para morfina deshidrogenasa y 0,88
U/mg para morfinona reductasa; mientras que los valores para las
células de JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 de E.
coli fueron de 0,044 U/mg para morfina deshidrogenasa, 0,78 U/mg
para morfinona reductasa y 0,72 U/mg para STH. Se realizaron
biotransformaciones celulares completas a pequeña escala (volumen
total de 3 ml) en las mezclas de reacción que contenían morfina 20
mM y una densidad celular final de 0,17 g/ml en
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Se realizaron
biotransformaciones por duplicado a 30ºC en un agitador rotativo y
se extrajeron muestras a intervalos regulares. Se clarificaron las
muestras por centrifugación y se analizó el contenido en opioides
utilizando HTLC tal como se describió anteriormente (French et
al., supra). Se realizaron una serie de
biotransformaciones consecutivas utilizando el mismo lote de células
que se recogió y se lavó en las incubaciones. Los resultados
ilustrados en la Figura 4 indican que las células que contienen STH
recombinante podían utilizarse más de una vez durante el proceso de
biotransformación, mientras que las células que carecen de STH
recombinante solamente podían utilizarse una vez. Estos resultados
dan a entender que la STH recombinante puede ciclar el cofactor en
procesos enzimáticos in vivo dependientes de NADP y de
NAD.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CAMBRIDGE UNIVERSITY TECHNICAL SERVICES LTD.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: The Old Schools, Trinity Lane
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: N/A
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: (ZIP): CB2 ITS
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CICLACIÓN DE COFACTOR ENZIMÁTICO UTILIZANDO PIRIDINA NUCLEÓTIDO DESHIDROGENASA SOLUBLE
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO (todavía desconocido)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1660 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 209...1600
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 464 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Utilización de un microorganismo como
biocatalizador, en la que el microorganismo se transforma para
expresar una enzima que presenta una secuencia con una identidad
superior al 70% con la SEC. ID nº: 2 y que es capaz de transferir
equivalentes reductores entre los cofactores de piridina
nucleótido.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que la identidad es por lo menos del 80%.
3. Utilización según la reivindicación 1, en la
que la identidad es por lo menos del 90%.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es piridina
nucleótido transhidrogenasa soluble.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en un ensayo analítico basado en enzimas y
que comprende además la medición de una señal basada en la oxidación
de NADH a NAD.
6. Procedimiento en el que un sustrato se
transforma en un producto mediante una enzima y un cofactor de
piridina nucleótido, que comprende la utilización de una enzima o
microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4.
1 a 4.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, que
consiste en una biotransformación o un análisis.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que el sustrato es morfina.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que el cofactor se utiliza en una
cantidad catalítica.
10. Molécula de nucleótido que presenta una
secuencia con una identidad superior al 70% con la SEC. ID nº: 1,
que codifica una enzima con actividad de la piridina nucleótido
transhidrogenasa soluble.
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